高良姜素調(diào)節(jié)MCP-1/CCR2信號軸對肺癌細胞惡性生物學(xué)行為的影響

秦婷婷 徐洋 楊璐瑜 洪帆 周濤 車瑾

肺癌是呼吸系統(tǒng)中的一類疾病,在全球中都是屬于死亡率最高的癌癥之一,而且隨著人們的生活環(huán)境變化,其發(fā)病率在不斷上升。而非小細胞肺癌屬于肺癌中最高發(fā)的一類癌癥[1-2]。目前臨床上常采用化療的方法治療,但是會產(chǎn)生耐藥而導(dǎo)致效果不佳[3]。因此,對肺癌發(fā)生發(fā)展的機制研究可能會發(fā)現(xiàn)治療肺癌的其它有效途徑。高良姜素,化學(xué)名稱為3,5,7-三羥基黃酮,在高良姜和蜂蜜中存在,屬于天然黃酮類化合物[4-5]。對于高良姜素的藥理學(xué)研究顯示,其具有降血脂、清除自由基、抗腫瘤以及抗氧化等作用,有研究已經(jīng)顯示高良姜素可以通過調(diào)控相關(guān)信號通路從而增強順鉑等化療藥物對于肺癌的治療效果[6-7]。而對于細胞因子單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)也經(jīng)常被叫做趨化因子配體2(CC chemokine ligand 2,CCL2)。MCP-1的受體就是趨化因子受體2(CC chemokine receptor 2,CCR2)。有研究報道,MCP-1可以與CCR2相互作用,進一步參與細胞凋亡、增殖等生理過程。MCP-1屬于促炎性趨化因子,并且與癌癥的預(yù)后有關(guān),所以對MCP-1/CCR2信號通路的抑制就成為了新的腫瘤治療策略[8-10]。而高良姜素能否通過調(diào)控MCP-1/CCR2信號通路對人肺癌細胞產(chǎn)生影響還未有研究。因此,本研究旨在探究高良姜素對人肺癌細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響以及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞 人肺癌細胞系(A549)來自博輝生物科技(廣州)有限公司。

1.2 主要試劑 高良姜素來自上海瓦蘭生物科技有限公司;RPMI-1640細胞培養(yǎng)液購自愛必信(上海)生物科技有限公司;吉非替尼購自北京凱詩源生物科技有限公司;MCP-1來自上海鴻肽生物科技有限公司;細胞計數(shù)試劑盒購自廈門慧嘉生物科技有限公司;凋亡試劑盒購自上海偉進生物科技有限公司;胎牛血清購自北京博爾西科技有限公司;transwell小室來自北京沃凱生物科技有限公司;兔源一抗MCP-1、Caspase-3、GAPDH購自武漢愛博泰克生物科技有限公司;兔源一抗CCR2、Ki67、MMP-2購自武漢益普生物科技有限公司;辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自上海信裕生物科技有限公司。

1.3 細胞培養(yǎng) 將人肺癌細胞A549接種在RPMI-1640完全培養(yǎng)基(含10%FBS、1%雙抗)中并置于37℃、5% CO2的濕潤培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長至對數(shù)期后進行后續(xù)實驗測定。

1.4 細胞分組以及細胞計數(shù)試劑盒-8(CCK-8)檢測 將A549細胞以每孔2×105個細胞的濃度接種到96孔板中。培養(yǎng)24 h后,將細胞分為正常培養(yǎng)的ctrl組,以及分別用低濃度高良姜素(25 μmol/L)、高濃度高良姜素(100 μmol/L)[11]、吉非替尼(10 μmol/L)[12]、高濃度高良姜素+MCP-1(100 μmol/L高良姜素+ 75 ng/mL MCP-1)[13]進行孵育處理的細胞組,在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h以供后續(xù)實驗使用。然后向每個孔中加入10 μL的CCK-8試劑。與細胞一起孵育2 h后,使用多功能酶標(biāo)儀在450 nm處監(jiān)測光密度值(吸光度/OD值)并處理分析。

1.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 將A549細胞用胰蛋白酶消化處理后,接種至6孔板(4×105個/mL)并培養(yǎng)48 h。按照1.4步驟的細胞分組并處理,然后根據(jù)試劑盒商家的說明,用FITC膜連蛋白V/碘化丙啶雙重染色,通過流式細胞儀(BD FACSCalibur)檢測細胞凋亡。FITC+/PI+和FITC+/PI-的細胞為凋亡細胞,最后分析處理細胞凋亡率。

1.6 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移 將A549細胞接種到6孔板中,等到細胞生長到融合狀態(tài),吸去培養(yǎng)基,用200 μL槍頭尖刮去細胞。然后根據(jù)1.4中的分組以及濃度進行處理并孵育48 h,然后使用倒置顯微鏡監(jiān)測細胞的遷移情況,計算劃痕愈合率。

1.7 Transwell 檢測細胞侵襲能力 首先將處于對數(shù)期生長的細胞重懸,備用。Matrigel基質(zhì)膠稀釋后,加到上室中,孵育4 h后,將重懸的A549細胞加入上室并加入1.4中的分組藥物及相應(yīng)的濃度,下室中加入含有10%FBS的培養(yǎng)液,在37℃環(huán)境中孵育48 h。然后用多聚甲醇固定細胞、結(jié)晶紫染色,然后用光學(xué)顯微鏡觀察記錄細胞侵襲數(shù)。

1.8 western blot檢測MCP-1、CCR2、Caspase-3、Ki67、MMP-2蛋白表達 取上述1.4分別處理的A549細胞在RIPA裂解緩沖液中裂解,再加入蛋白酶抑制劑,提取總蛋白。將蛋白質(zhì)進行定量、電泳、轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上、用脫脂乳封閉,然后將膜與一抗MCP-1(1∶1 000)、CCR2(1∶1 000)、Caspase-3(1∶1 000)、Ki67(1∶1 000)、MMP-2(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)在4℃下孵育過夜,然后將膜浸泡于HRP標(biāo)記的二抗孵育液中2 h。加入ECL試劑檢測觀察免疫反應(yīng)蛋白。使用Image Lab軟件分析目標(biāo)蛋白的灰度值。

2 結(jié)果

2.1 5組A549細胞增殖能力比較 與ctrl組相比,低濃度高良姜素組、高濃度高良姜素組、吉非替尼組的細胞存活率出現(xiàn)下降趨勢(P<0.05);高濃度高良姜素組、吉非替尼組與低濃度高良姜素相比,細胞存活率有更加明顯的降低(P<0.05);高濃度高良姜素+MCP-1組與高濃度高良姜素組比較,細胞存活率上升(P<0.05)。見表1。

表1 5組A549細胞存活率比較 n=5,%,

2.2 5組A549細胞凋亡比較 通過流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況。低濃度高良姜素組、高濃度高良姜素組、吉非替尼組與ctrl組比較,A549細胞凋亡率升高(P<0.05);高濃度高良姜素組、吉非替尼組與低濃度高良姜素相比,細胞凋亡率升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);而高濃度高良姜素+MCP-1組與高濃度高良姜素組比較,細胞凋亡率又出現(xiàn)降低趨勢(P<0.05)。見圖1,表2。

圖1 流式細胞術(shù)檢測5組A549細胞凋亡水平

表2 5組A549細胞凋亡率比較 n=5,%,

2.3 5組A549細胞遷移能力比較 通過劃痕實驗測定細胞的遷移能力。低濃度高良姜素、高濃度高良姜素組、吉非替尼組的A549細胞劃痕愈合率與ctrl組比較降低(P<0.05);高濃度高良姜素組、吉非替尼組與低濃度高良姜素相比,細胞劃痕愈合率降低(P<0.05);與高濃度高良姜素組比較,高濃度高良姜素+MCP-1組A549細胞劃痕愈合率升高(P<0.05)。見圖2,表3。

圖2 劃痕實驗檢測A549細胞遷移(×100)

表3 5組A549細胞劃痕愈合率比較 n=5,%,

2.4 5組A549細胞侵襲能力比較 通過Transwell實驗測定細胞的侵襲能力。低濃度高良姜素、高濃度高良姜素組、吉非替尼組組的A549侵襲細胞數(shù)與ctrl組比較明顯減少(P<0.05);高濃度高良姜素組、吉非替尼組與低濃度高良姜素相比,細胞侵襲數(shù)降低(P<0.05);與高濃度高良姜素組比較,高濃度高良姜素+MCP-1組A549細胞侵襲細胞數(shù)增加(P<0.05)。見圖3,表4。

圖3 Transwell實驗檢測A549細胞侵襲(結(jié)晶紫染色×200)

表4 5組A549細胞侵襲細胞數(shù) n=5,個,

2.5 5組A549細胞中MCP-1、CCR2、Caspase-3、Ki67、MMP-2相關(guān)蛋白表達比較 與ctrl組比較,低濃度高良姜素組、高濃度高良姜素組、吉非替尼組的MCP-1、CCR2、Ki67、MMP-2蛋白表達降低,Caspase-3蛋白表達升高(P<0.05);高濃度高良姜素組、吉非替尼組與低濃度高良姜素相比,MCP-1、CCR2、Ki67、MMP-2蛋白表達降低,Caspase-3蛋白表達升高(P<0.05);與高濃度高良姜素組比較,高濃度高良姜素+MCP-1組MCP-1、CCR2、Ki67、MMP-2蛋白表達出現(xiàn)升高現(xiàn)象,而Caspase-3蛋白表達降低(P<0.05)。見圖4,表5。

圖4 western blot檢測A549細胞中MCP-1、CCR2、Caspase-3蛋白表達;A ctrl組;B 低濃度高良姜素組;C 高濃度高良姜素組;D 吉非替尼組;E 高濃度高良姜素+MCP-1組

表5 5組A549細胞中MCP-1、CCR2、Caspase-3、Ki67、MMP-2蛋白表達比較 n=5,

3 討論

肺癌屬于發(fā)病率和死亡率都很高的疾病之一,而且由于科技的發(fā)展,人們的生活環(huán)境、方式等發(fā)生了重大改變,也會影響肺癌的發(fā)生,且發(fā)生趨勢呈上升狀態(tài)[14-15]。而且腫瘤的發(fā)生與腫瘤微環(huán)境也密不可分,其中大量的作用因子也會影響腫瘤的發(fā)展[16]。因此本文針對肺癌細胞中的趨化因子,檢測高良姜素對于癌細胞的影響。

高良姜素主要是從高良姜中提取得到的,具有抗炎、抗氧化和抗過敏、抗腫瘤等良好的藥理作用。相關(guān)文獻報道,高良姜素對呼吸相關(guān)疾病有較好的作用[17]。而肺癌就類屬于呼吸系統(tǒng)的疾病,所以本研究選取高良姜素探究其對人肺癌細胞的影響。結(jié)果顯示,低、高濃度高良姜素以及吉非替尼處理均可降低人肺癌細胞的凋亡率,增殖水平,細胞創(chuàng)傷愈合率,以及細胞侵襲性,且高良姜素濃度越高,對應(yīng)指標(biāo)的變化趨勢越明顯。而高濃度高良姜素處理的人肺癌細胞對上述指標(biāo)的影響與吉非替尼處理后相比較的差異無統(tǒng)計學(xué)意義,表明高良姜素可促進人肺癌細胞凋亡,增殖、遷移和侵襲。

已經(jīng)有團隊報道了有關(guān)MCP-1、CCR2信號通路的抗腫瘤作用,即在母細胞瘤中,CCR2的已知配體MCP-1,在腫瘤中高表達并募集CCR2從而促進腫瘤發(fā)展[18]。MCP-1/CCR2對于腎臟免疫細胞浸潤也有作用,抑制MCP-1/CCR2就可以緩解慢性腎臟病;MCP-1還可以促進人類乳腺癌的發(fā)展,以及小鼠乳腺腫瘤的發(fā)展即MCP-1與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[19-20]。而研究MCP-1/CCR2信號通路與肺癌相關(guān)性的研究較少,基于MCP-1/CCR2信號通路的已有作用,本文進行了相關(guān)探究。結(jié)果顯示與相關(guān)研究作用結(jié)果相似,人肺癌A549細胞MCP-1、CCR2蛋白表達升高,Caspase-3蛋白表達降低;低、高濃度高良姜素、吉非替尼處理均可降低人肺癌A549細胞中MCP-1、CCR2蛋白表達,升高Caspase-3蛋白表達。且高良姜素濃度越高,對MCP-1、CCR2、Caspase-3蛋白表達的作用越明顯,推測高良姜素可能通過抑制MCP-1/CCR2信號通路促進對人肺癌細胞的凋亡等生物學(xué)行為影響。為了驗證該猜想,本研究利用增加趨化因子MCP-1來干預(yù)高濃度高良姜素處理的人肺癌細胞,結(jié)果顯示,MCP-1減弱了高濃度高良姜素對人肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲的抑制作用,并抑制了細胞凋亡。證實了高良姜素可能通過抑制MCP-1/CCR2通路抑制人肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲,促進細胞凋亡。

綜上所述,高良姜素可能通過抑制MCP-1/CCR2通路抑制人肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲等惡性生物學(xué)行為,促進細胞凋亡。該研究為開發(fā)新的通過抑制MCP-1/CCR2信號通路治療肺癌的藥物提供了理論基礎(chǔ)。然而,本研究尚存在不足之處,即高良姜素在體內(nèi)對于抑制MCP-1/CCR2信號通路的影響效果尚且不知,而且可能高良姜素對肺癌還有不同的作用機制,有待后續(xù)實驗的進一步深入探究。