益母草堿調(diào)節(jié)Fas/FasL信號通路對乳腺癌細(xì)胞惡性生物行為的影響

宋夢 許承彬 張來香 宋煒

乳腺癌發(fā)生于乳腺上皮組織細(xì)胞,其發(fā)病率居女性惡性腫瘤發(fā)病率首位,嚴(yán)重危害女性生命健康[1]。目前,乳腺癌的治療以手術(shù)切除為主,再根據(jù)病情以放療、化療等為輔助治療,放療費用高、不良反應(yīng)大,現(xiàn)階段,化學(xué)藥物治療仍為主要的臨床治療手段[2]。由于乳腺癌易復(fù)發(fā)、易轉(zhuǎn)移,篩選高效、低毒的治療藥物對乳腺癌的治療具有重要的臨床意義。益母草堿是從益母草中提取的一種天然生物堿,具有多種藥理活性,如抗氧化、神經(jīng)保護、抗癌、抗炎等[3],已被用于抗癌藥物的研究中。Lin等[4]研究表明,益母草可以顯著促進(jìn)人宮頸癌細(xì)胞的凋亡。Liu等[5]研究表明,益母草堿可以通過抑制的miR-18a-5p/SOCS5/JAK2/STAT3軸活性,破壞CML惡性腫瘤。且益母草堿在動物的毒性實驗中尚未出現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)[6],具有較高的臨床應(yīng)用價值。脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,Fas)與脂肪酸合成酶配體(fatty acid synthase ligand,FasL)信號通路(Fas/FasL),可以介導(dǎo)細(xì)胞外源性凋亡[7],是調(diào)控細(xì)胞凋亡的主要途徑之一。本研究以4T1細(xì)胞株為研究對象,探究益母草堿對Fas/FasL信號通路的調(diào)節(jié)作用,以及對乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移、凋亡等的影響,以期為乳腺癌的臨床治療提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 主要材料 4T1乳腺癌細(xì)胞購自中國科學(xué)院(上海)細(xì)胞庫;益母草堿(≥98%)購自上海西格生物科技有限公司;CCK-8試劑盒(CA1210)、凋亡試劑盒(CA1020),購自索萊寶生物科技有限公司;N-cadherin(AF0243)、Vimentin(AF1975)、Fas(AF6861),細(xì)胞周期試劑盒(C1052)購自碧云天生物科技有限公司;FasL(sc-19988)購自圣克魯斯生物技術(shù)有限公司;LipofectamineTM 3000 試劑盒購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞增殖活性的檢測:取對數(shù)期生長的4T1乳腺癌細(xì)胞,制備單細(xì)胞懸液,以2×104個/孔接種于96孔板中,加入完全培養(yǎng)基,分別再加入終濃度為10、20、40、80、160 mmol/L的益母草堿,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12、24、48 h,加入10 μL的CCK-8,孵育4 h,使用酶標(biāo)儀,測定每孔在450 nm處的OD值,計算細(xì)胞存活率。

1.2.2 細(xì)胞的處理與分組:將4T1乳腺癌細(xì)胞分為對照組(Control組)、益母草堿低、中、高濃度組(Leo-L組、Leo-M組、Leo-H組)、益母草堿高濃度+轉(zhuǎn)染短發(fā)夾RNA慢病毒陰性對照組(Leo-H+sh-NC組),益母草堿高濃度+轉(zhuǎn)染Fas短發(fā)夾RNA慢病毒組(Leo-H+sh-Fas組)。取對數(shù)期4T1乳腺癌細(xì)胞,以5×104個/孔接種于24孔板中,培養(yǎng)至貼壁生長(密度70%～90%),加入病毒溶液,按照細(xì)胞∶病毒=1∶50,感染細(xì)胞24 h,將培養(yǎng)基更換為新鮮的完全培養(yǎng)基,加入嘌呤霉素繼續(xù)培養(yǎng)1周,在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞呈綠色熒光,即獲得穩(wěn)定感染Fas短發(fā)夾RNA慢病毒細(xì)胞、感染短發(fā)夾RNA慢病毒細(xì)胞,加入濃度為30 mmol/L的益母草堿,記為Leo-H+sh-Fas組、Leo-H+sh-NC組;Leo-L組、Leo-M組、Leo-H組細(xì)胞給予10、20、30 mmol/L的益母草堿;Control組加入等量DMEM。6組細(xì)胞均于37℃(5%CO2)恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 細(xì)胞遷移能力:Transwell小室法評價細(xì)胞的遷移能力,取各組對數(shù)期生長的4T1細(xì)胞,加入胰消化酶進(jìn)行消化,用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基配置2×105個/mL的單細(xì)胞懸液,取100 μL加入Transwell上室,下室加入500 μL含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基,于37℃(5%CO2)恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,室溫下在4%多聚甲醛中固定20 min,結(jié)晶紫染色,在顯微鏡下隨機選取5個視野,觀察并記錄細(xì)胞遷移數(shù)目。

1.2.4 細(xì)胞凋亡:Hoechst33258染色法觀察細(xì)胞形態(tài),6組處于對數(shù)期4T1細(xì)胞,配制濃度為2×105個/mL的單個細(xì)胞懸液,接種于6孔板,培養(yǎng)24 h,加入多聚甲醛室溫下固定20 min,PBS清洗,加入Hoechst33258染液染色15 min,PBS洗滌多余的染色液,使用熒光倒置顯微鏡,觀察細(xì)胞。

1.2.5 細(xì)胞凋亡與周期進(jìn)展:收集6組處于對數(shù)期的4T1細(xì)胞,加入70%預(yù)冷乙醇溶液,固定12 h,部分細(xì)胞加入Annexin V-FITC,混勻,再加入PI染液染色5 min,流式機檢測細(xì)胞凋亡率;另一部分細(xì)胞,加入PI染液染色20 min,上流式機檢測細(xì)胞周期進(jìn)展。

1.2.6 細(xì)胞N-cadherin、Vimentin、Fas、FasL表達(dá):Western blot法檢測,取6組對數(shù)期的4T1細(xì)胞,加入RIPA,低溫處理30 min,4 000 r/min離心20 min,取上清液,測定總蛋白含量;蛋白樣本中加入緩沖液,經(jīng)凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜,加入5%脫脂乳粉,封閉120 min;加入一抗N-cadherin、Vimentin、Fas、FasL(稀釋度為1∶1 000),4℃孵育12 h,磷酸緩沖液洗滌3次,加入對用二抗,室溫繼續(xù)孵育2 h,ECL發(fā)光顯影,以β-actin作為內(nèi)參蛋白,分析目標(biāo)蛋白相對表達(dá)水平。

1.2.7 荷瘤小鼠模型的建立:取對數(shù)期生長的4T1細(xì)胞,加入胰消化酶進(jìn)行消化,配置濃度為5×106個/mL 4T1細(xì)胞單細(xì)胞懸液,于裸鼠第二對乳腺脂肪墊處接種4T1細(xì)胞單細(xì)胞懸液0.1 mL[8],接種1周后,小鼠接種處可明顯檢測到移植瘤,乳腺癌模型建立成功。將小鼠隨機分為Control組和Leo組,每組6只,Leo組小鼠每天灌胃150 mg/kg的益母草堿[5],Control組灌胃等量0.9%氯化鈉溶液,連續(xù)給藥4周,每周測量小鼠移植瘤體積,實驗結(jié)束后,脫頸處死,取出移植瘤檢測質(zhì)量以及檢測Fas、FasL蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 益母草堿對4T1細(xì)胞增殖活性的影響 10、20、40、80、160 mmol/L的益母草堿處理4T1細(xì)胞12 h、24 h、48 h,均可顯著降低細(xì)胞存活率,呈濃度和時間依賴效應(yīng),以不同濃度的益母草堿處理4T1細(xì)胞12 h后,細(xì)胞IC50值(半數(shù)抑制濃度)為(53.61±1.729) mmol/L;綜合結(jié)果,選擇濃度為10.0、20.0、40.0 mmol/L的益母草堿,處理細(xì)胞12 h,進(jìn)行后續(xù)實驗。見表1。

表1 益母草堿對4T1細(xì)胞增殖活性的影響 n=6,%,

2.2 益母草堿對4T1細(xì)胞遷移與凋亡的影響

2.2.1 益母草堿對4T1細(xì)胞遷移能力的影響 與control相比,Leo-L組、Leo-M組、Leo-H組細(xì)胞遷移個數(shù)呈濃度依賴性減少(P<0.05);與Leo-H組相比,Leo-H+sh-Fas組細(xì)胞遷移個數(shù)顯著增多(P<0.05)。見圖1,表2。

表2 益母草堿對4T1細(xì)胞遷移能力及細(xì)胞凋亡的影響 n=6,

2.2.2 益母草堿對4T1細(xì)胞凋亡的影響:control組細(xì)胞形態(tài)飽滿,呈彌散、微弱藍(lán)色熒光;Leo-L組、Leo-M組、Leo-H組細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中均可見濃染致密顆粒塊狀熒光,且熒光強度逐漸增強;而相比于Leo-H組,Leo-H+sh-Fas組細(xì)胞核藍(lán)色熒光減弱。相比于control組,Leo-L組、Leo-M組、Leo-H組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05);相比于Leo-H組,Leo-H+sh-Fas組細(xì)胞凋亡率顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2,圖2、3。

圖2 Hoechst 33258染色觀察細(xì)胞形態(tài)(Hoechst 33258染色×400)

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡

2.3 益母草堿對4T1細(xì)胞周期進(jìn)展的影響 相比于Control組,Leo-L組、Leo-M組、Leo-H組G0/G1期細(xì)胞比例顯著升高,G2/M期細(xì)胞比例及S期細(xì)胞比例顯著降低(P<0.05),呈濃度依賴效應(yīng);相比于Leo-H組,Leo-H+sh-Fas組G0/G1期細(xì)胞比例顯著降低,G2/M期細(xì)胞比例及S期細(xì)胞比例顯著升高(P<0.05)。見表3。

表3 益母草堿對4T1細(xì)胞周期進(jìn)展的影響 n=6,%,

2.4 益母草堿對4T1細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及Fas、FasL表達(dá)的影響 相比于Control組,Leo-L組、Leo-M組、Leo-H組細(xì)胞N-cadherin、Vimentin表達(dá)顯著降低,Fas、FasL表達(dá)顯著升高,呈濃度依賴性(P<0.05);相比于Leo-H組,Leo-H+sh-Fas組細(xì)胞N-cadherin、Vimentin表達(dá)顯著升高,Fas、FasL表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見圖4,表4。

圖4 益母草堿對4T1細(xì)胞皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及Fas、FasL表達(dá)的影響;A Control組;B Leo-L組;C Leo-M組;D Leo-H組;E Leo-H+sh-NC組;F Leo-H+sh-Fas組

表4 益母草堿對4T1細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及Fas、FasL表達(dá)的影響 n=6,

2.5 益母草堿對乳腺癌移植瘤生長的影響 小鼠乳腺癌移植瘤實驗結(jié)果顯示,在接種5周后,小鼠第2對乳頭處可見明顯腫瘤腫塊,移植瘤模型建立成功。相比于Control組,Leo組小鼠移植瘤體積及質(zhì)量顯著降低,N-cadherin、Vimentin表達(dá)顯著降低,Fas、FasL表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見表5、6,圖5。

圖5 益母草堿對乳腺癌移植瘤N-cadherin、Vimentin、Fas、FasL蛋白表達(dá)的影響;A Control組;B Leo組

表5 益母草堿對乳腺癌移植瘤生長的影響 n=6,cm3,

表6 益母草堿對乳腺癌移植瘤生長及N-cadherin、Vimentin、Fas、FasL蛋白表達(dá)的影響 n=6,

3 討論

目前,乳腺癌已成為發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一,相對于發(fā)達(dá)國家,發(fā)展中國家以及低收入國家,乳腺癌的生存預(yù)后差,病死率高,嚴(yán)重威脅人們生命安全[9-10],尋找價廉、高效的治療藥物,對乳腺癌的防治至關(guān)重要。益母草堿來源廣泛,毒副作用小,已被大量研究證明具有顯著的抗癌活性,如,羅娜等[11]研究發(fā)現(xiàn),益母草堿可以通過調(diào)控LINC00461,抑制宮頸癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;Liang等[12]研究表明,益母草堿可以通過調(diào)控miR-18a-5p/SLC40A1軸,抑制前列腺癌體外和體內(nèi)生長。乳腺癌細(xì)胞的過度增殖與遷移關(guān)系到乳腺癌疾病的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[13]。本研究中以4T1細(xì)胞株為研究對象,使用益母草堿進(jìn)行處理,結(jié)果顯示,益母草堿可以顯著抑制4T1細(xì)胞的增殖與遷移,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,荷瘤小鼠實驗進(jìn)一步驗證益母草堿可以顯著抑制荷瘤小鼠腫瘤的生長,但機制尚不明確。

癌細(xì)胞最顯著的特征即為無限增殖,細(xì)胞周期是細(xì)胞增殖分化的關(guān)鍵,阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程是降低細(xì)胞增殖能力的有效手段之一[14]。本研究結(jié)果顯示,益母草堿干預(yù)處理后,4T1細(xì)胞處于G0/G1期的細(xì)胞比例顯著升高,S期的細(xì)胞比例顯著降低,細(xì)胞被阻滯于G0/G1期,增殖能力明顯被抑制。因此推斷,益母草堿可能通過阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞凋亡是目前腫瘤研究的主要方向之一,受多種信號通路調(diào)節(jié),其中Fas/FasL信號通路是非常重要的凋亡途徑。Fas存在于多種組織和器官中,是腫瘤壞死因子受體的一種,FasL是Fas的天然受體,參與細(xì)胞內(nèi)多種信號的傳遞[15]。Fas與FasL結(jié)合(Fas/FasL信號通路激活)凋亡途徑被激活,引起細(xì)胞凋亡,維持機體正常免疫功能[16]。有研究表明,腫瘤組織中Fas表達(dá)受到抑制,表達(dá)量顯著低于癌旁組織和正常組織[17-18],上調(diào)Fas水平可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。宋文龍等[19]使用辣椒素激活Fas/FasL信號通路,誘導(dǎo)為癌細(xì)胞的凋亡。朱垠等[20]研究發(fā)現(xiàn),Fas/FasL信號通路通路的激活可以抑制大腸癌惡性生物學(xué)特性。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是腫瘤遷移的關(guān)鍵,EMT的發(fā)生伴隨著間質(zhì)細(xì)胞蛋白N-cadherin、Vimentin表達(dá)上調(diào),阻止EMT進(jìn)程可以抑制癌細(xì)胞的增殖與遷移[21-22]。本研究中益母草堿處理組4T1細(xì)胞Fas、FasL表達(dá)顯著上調(diào),N-cadherin、Vimentin表達(dá)顯著下調(diào);Leo-H+sh-Fas組中抑制Fas表達(dá),可以逆轉(zhuǎn)益母草堿對4T1細(xì)胞增殖、遷移的抑制作用,細(xì)胞凋亡率降低。

綜上所述,益母草堿可以上調(diào)4T1細(xì)胞Fas、FasL表達(dá),抑制細(xì)胞的增殖、遷移與EMT進(jìn)程,具有治療乳腺癌疾病的潛力。但抗癌作用機制復(fù)雜,其臨床引用仍需進(jìn)一步研究。