miR-105-5p靶向SIRT1調(diào)控脂肪酸代謝影響胃癌細胞生物學行為的研究

羅慶元 閆軍 孫國輝 楊陽

胃癌是胃腸道最常見惡性腫瘤之一,近年來我國胃癌發(fā)病率逐年升高,很多患者就診時已經(jīng)達到晚期,盡管近年來放化療、免疫治療等方法層出不窮,但患者總體預后不佳[1]。因此,尋找新的治療靶點迫在眉睫。微小RNA(microRNA,miRNA)是近年來研究的熱點,在調(diào)控腫瘤進展中扮演著重要角色。miR-105-5p是一種抑癌基因,在卵巢癌、宮頸癌、非小細胞肺癌組織中差異表達,調(diào)控腫瘤細胞惡性表型[2-4]。但最近研究發(fā)現(xiàn),胃癌組織高表達miR-105-5p,上調(diào)miR-105-5p可增強胃癌細胞增殖、侵襲及遷移能力[5]。腫瘤細胞代謝在調(diào)控腫瘤進展、免疫微環(huán)境中發(fā)揮重要作用,其中脂肪酸代謝是腫瘤細胞代謝最重要的領域之一。研究發(fā)現(xiàn),多種miRs可通過調(diào)節(jié)脂肪酸代謝影響胃癌進展,如miR-23b、miR-1275[6-7]。但miR-105-5p是否同樣通過調(diào)控脂肪酸代謝影響胃癌惡性表型,目前尚不清楚。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1,SIRT1)負責調(diào)控細胞新陳代謝,與腫瘤的代謝異常密切相關,也是腫瘤診斷及治療的潛在靶點[8]。研究發(fā)現(xiàn),SIRT1參與調(diào)控腫瘤細胞脂肪酸代謝[9-10]。本研究探討miR-105-5p對胃癌增殖、侵襲、遷移及脂肪酸代謝的影響,及其與SIRT1的靶向關系,希望為胃癌的靶向治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 人胃黏膜上皮細胞GES-1、人胃癌HepG2細胞(中國北納生物公司),RPMI-1640培養(yǎng)基(安徽白鯊生物科技有限公司),胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(百克賽斯生物科技有限公司),lipofectamine 8000(上海碧云天生物有限公司),TRizol(美國Invitrogen公司),引物序列,sh-SIRT1(敲低)質(zhì)粒、敲低空載體(Scramble)、miR-105-5p模擬物(mimic)質(zhì)粒、miR-105-5p抑制劑(inhibitor)質(zhì)粒、mimic空載體及inhibitor空載體,野生型(WT)-SIRT1載體、突變型(MUT)-SIRT1載體(北京博爾邁生物技術(shù)有限公司),PCR試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司);CCK-8(Cell counting kit-8)試劑盒(杭州赫貝科技有限公司);雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(武漢科謹生物科技有限公司);磷脂、三酰甘油酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)試劑盒(上海惠誠生物有限公司);兔抗人β-actin、SIRT1、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FASN)、乙酰輔酶a羧化酶(acetyl-CoA carboxylase,ACC1)及脂肪酸結(jié)合蛋白5(fatty acid binding protein 5,FABP5)(上海碧云天生物有限公司),酶標儀(美谷分子,中國),NANOdrop 2000儀(Bio-rad公司,美國),聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)電泳器械(上海懋康生物科技有限公司),天能VE-586曝光機(上海天能科技有限公司),ABI 7900 PCR儀(美國ABI公司),ARM200F原子級分辨率透射電子顯微鏡(日本電子株式會社)。

1.2 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組 HepG2細胞使用RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng),條件:37℃、5%CO2,每隔2 d更換新鮮培養(yǎng)液。取傳代3次對數(shù)生長期的HepG2細胞接種到6孔板,細胞鋪滿50%板面積時使用lipofectamine 8000將不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞分為miR-105-5p組(轉(zhuǎn)染miR-105-5p mimic)、si-miR-105-5p組(轉(zhuǎn)染miR-105-5p inhibitor)、miR-NC組(轉(zhuǎn)染mimic NC),NC組(轉(zhuǎn)染inhibitor NC),Scramble組(轉(zhuǎn)染Scramble)、miR-105-5p+Scramble組(轉(zhuǎn)染miR-105-5p mimic、Scramble)及miR-105-5p+sh-SIRT1組(轉(zhuǎn)染miR-105-5p mimic、sh-SIRT1),繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進行后續(xù)實驗。

1.3 CCK-8測定細胞活力 首先,消化細胞后制備單細胞懸液,將5 000個細胞/孔接種在96孔板,常規(guī)條件,培養(yǎng)基孵育24、48和72 h后終止培養(yǎng),去除舊培養(yǎng)基,每孔加入含有10 μL CCK-8溶液的新鮮培養(yǎng)基,繼續(xù)孵育3 h。然后上機檢測450 nm波長處組細胞的光密度(Optical density,OD)。每組實驗獨立重復3次,每次3個樣本。

1.4 Tanswell實驗測定細胞侵襲、遷移能力

1.4.1 侵襲實驗:先用無血清DMEM培養(yǎng)基配置Matrigengel膠,然后將基質(zhì)膠按照每孔100 μL量鋪到Tanswell小室的上室,37℃培養(yǎng)箱放置1 h,下室中加入600 μL 10%胎牛血清,消化細胞后制備成單細胞懸液,向上室中加入2×104個細胞,孵育48 h后棉簽拭去上室未穿的細胞,洗滌3次后用4%多聚甲醛固定10 min,0.1%結(jié)晶紫染色,顯微鏡下低倍鏡下拍照,計數(shù)。

1.4.2 遷移實驗:除了上室中不加入基質(zhì)膠,其他步驟參考侵襲實驗。

1.5 ELISA檢測細胞磷脂、三酰甘油含量 收集各組細胞,1 200 r/min離心10 min,去上清液,沉淀進行超聲1 min,按照試劑盒說明書檢測細胞磷脂、三酰甘油含量。

1.6 實時定量PCR(qRT-PCR)檢測miR-105-5p和SIRT1-mRNA的表達 使用TRizol從各組細胞中提取總RNA,測定濃度、純度。根據(jù)試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后PCR,體系:cDNA 2 μL,上下游引物各0.2 μL,2×Tip Green qPCR Sper Mix 5 μL,DEPC水 2.6 μL。條件:95℃ 2 min、95℃ 15 s、60℃ 15 s、共40循環(huán),構(gòu)建溶解曲線。2-ΔΔCt法表示基因相對含量。內(nèi)參選擇GAPDH、U6。見表1。

表1 qRT-PCR引物

1.7 Western blot檢測SIRT1、FASN、ACC1及FABP5蛋白表達 細胞中加入蛋白裂解物提取總蛋白,通過BCA法進行總蛋白濃度測定,沸煮后按照1∶4的比例蛋白液中加入5×蛋白loading,沸煮10 min變性。取50 μg的蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳進行蛋白分離,采用濕轉(zhuǎn)法將分離的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上,5%的脫脂牛奶于室溫下封閉2 h后,分別加入SIRT1(1∶1 000)、FASN(1∶1 000)、ACC1(1∶1 000)及FABP5(1∶1 000)一抗,4℃搖床孵育過夜。TBST溶液清洗3次,5 min/次,以辣根酶標記的二抗(1∶1 000)室溫孵育1 h,以TBST溶液清洗3次,5 min/次。最后均勻滴加ECL發(fā)光液后于凝膠成像儀進行曝光拍照。采用Image J 軟件測定條帶灰度值,以目標蛋白與內(nèi)參β-actin的比值作為其相對表達量。以上實驗重復3次。

1.8 在線網(wǎng)站預測miR-105-5p與SIRT1的靶向關系 使用TargetScan在線網(wǎng)站(httP://www.targetscan.org/)預測miR-105-5p與SIRT1的靶向關系。

1.9 雙熒光素酶報告 在轉(zhuǎn)染前24 h,將HepG2細胞以每孔1×104/mL細胞接種在24孔板中。將miR-NC或miR-105-5p mimics分別與WT-SIRT1、MUT-SIRT1載體(突變序列:ACGGAGGCTGAGGCACGAGGATTGCT)共轉(zhuǎn)染到HepG2細胞中,分為miR-NC+WT-SIRT1、miR-105-5p+WT-SIRT1組、miR-NC+MUT-SIRT1組及miR-105-5p+MUT-SIRT1組。使用雙熒光素酶報告分析系統(tǒng)在轉(zhuǎn)染后24 h進行熒光素酶分析。熒火蟲熒光素酶活性被標準化為每個反應的海腎熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 GES-1、HepG2細胞miR-105-5p、SIRT1表達水平 HepG2細胞miR-105-5p表達水平高于GES-1細胞,SIRT1蛋白、基因mRNA表達水平低于GES-1細胞(P<0.01)。見圖1,表2。

圖1 Western blot檢測SIRT1蛋白

表2 GES-1、HepG2細胞miR-105-5p、SIRT1表達水平

2.2 miR-105-5p對HepG2細胞脂肪酸代謝的影響 miR-105-5p組細胞磷脂含量、三酰甘油含量、FASN、ACC1、FABP5蛋白水平均高于miR-NC組,si-miR-105-5p組細胞磷脂含量、三酰甘油含量及FASN、ACC1、FABP5蛋白水平均低于NC組(P<0.01)。見圖2,表3。

圖2 miR-105-5p對HepG2細胞脂肪酸代謝的影響

表3 miR-105-5p對HepG2細胞脂肪酸代謝的影響

2.3 miR-105-5p對HepG2細胞增殖、侵襲及遷移的影響 miR-105-5p組細胞48、72 h OD值,侵襲及遷移細胞數(shù)量高于miR-NC組,si-miR-105-5p組細胞48、72 h OD值,侵襲及遷移細胞數(shù)量低于NC組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖3,表4。

圖3 miR-105-5p對HepG2細胞增殖、侵襲及遷移的影響;A CCK-8結(jié)果;B 侵襲實驗(結(jié)晶紫染色×20);C 遷移實驗(結(jié)晶紫染色×20)

表4 miR-105-5p對HepG2細胞增殖、侵襲及遷移的影響

2.4 下調(diào)SIRT1逆轉(zhuǎn)miR-105-5p對HepG2細胞增殖、侵襲及遷移的影響 miR-105-5p+Scramble組細胞48 h、72 h OD值、侵襲及遷移細胞數(shù)量高于Scramble組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01);miR-105-5p+sh-SIRT1組細胞48 h、72 h OD值、侵襲及遷移細胞數(shù)量低于miR-105-5p+Scramble組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖4,表5。

圖4 下調(diào)SIRT1逆轉(zhuǎn)miR-105-5p對HepG2細胞增殖、侵襲及遷移的影響;A CCK-8結(jié)果;B 侵襲、遷移實驗(結(jié)晶紫染色×20)

表5 下調(diào)SIRT1逆轉(zhuǎn)miR-105-5p對HepG2細胞增殖、侵襲及遷移的影響 個,

2.5 下調(diào)SIRT1逆轉(zhuǎn)miR-105-5p對HepG2細胞脂肪酸代謝的影響 miR-105-5p+Scramble組細胞磷脂含量、三酰甘油含量及FASN、ACC1、FABP5蛋白水平均高于Scramble組,miR-105-5p+sh-SIRT1組細胞磷脂含量、三酰甘油含量及FASN、ACC1、FABP5蛋白水平均低于miR-105-5p+Scramble組(P<0.01),Scramble組和miR-105-5p+sh-SIRT1組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖5,表6。

圖5 下調(diào)SIRT1逆轉(zhuǎn)miR-105-5p對HepG2細胞脂肪酸代謝的影響

表6 下調(diào)SIRT1逆轉(zhuǎn)miR-105-5p對HepG2細胞脂肪酸代謝的影響

2.6 miR-105-5p與SIRT1的靶向關系 miR-105-5p組細胞SIRT1蛋白水平低于miR-NC組,si-miR-105-5p組細胞SIRT1蛋白水平高于NC組(P<0.01)。信息學網(wǎng)站預測發(fā)現(xiàn),miR-105-5p與SIRT1 3’UTR存在堿基互補配對位點。熒光素酶實驗報告發(fā)現(xiàn),miR-105-5p+WT-SIRT1組細胞熒光素酶活性低于miR-NC+WT-SIRT1組(P<0.01),miR-105-5p+MUT-SIRT1組細胞熒光素酶活性與miR-NC+MUT-SIRT1組差異無統(tǒng)計學意義。見圖6,表7、8。

圖6 miR-105-5p與SIRT1的靶向關系;A 4組細胞SIRT1蛋白表達;B miR-105-5p與SIRT1的堿基結(jié)合位點

表7 4組SIRT1蛋白水平

表8 4組熒光素酶活性比較

3 討論

胃癌作為消化道常見惡性腫瘤之一,在我國發(fā)病率居高不下,盡管放化療、免疫治療等手段近年來取得了一定的進展,但患者總體生存率仍較低,復發(fā)、病死率較高。因此,尋找影響胃癌進展的新分子及治療靶點迫在眉睫。

miRNA在胃癌進展中發(fā)揮重要作用[11]。miR-105-5p在多種腫瘤組織中差異表達,影響腫瘤進展,如Roseth等[12]研究發(fā)現(xiàn),原發(fā)性骨髓瘤細胞患者骨髓組織miR-105-5p高表達,是患者預后不良的危險因素。此外,研究發(fā)現(xiàn),結(jié)直腸癌組織高表達miR-105-5p,下調(diào)miR-105-5p可抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖、侵襲及遷移能力[13]。本研究結(jié)果顯示,胃癌細胞miR-105-5p高表達,提示miR-105-5p可能是胃癌的癌基因。為進一步研究miR-105-5p在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用,筆者構(gòu)建了miR-105-5p沉默和過表達胃癌細胞系,并分析了其對腫瘤細胞惡性表型的影響,結(jié)果顯示,miR-105-5p過表達的細胞增殖、侵襲及遷移能力顯著升高,反之沉默miR-105-5p的細胞增殖、侵襲及遷移能力降低。這與Miliotis等[5]的研究結(jié)果基本一致。

研究發(fā)現(xiàn),miRNA在腫瘤細胞能量代謝編程中扮演著重要角色,如miR-17通過調(diào)控小細胞肺癌脂肪酸代謝影響腫瘤進展[14]。目前普遍認為,腫瘤進展過程中存在異常的脂質(zhì)代謝過程,被認為是腫瘤的特征之一[15]。脂肪酸是脂質(zhì)重要組成部分,也是腫瘤細胞能量存儲的主要形式,參與各種膜合成、信號通路的組成[16]。在腫瘤發(fā)展過程中,脂肪酸代謝途徑會發(fā)生一定程度上的改變,因此探索脂肪酸代謝調(diào)控的機制對于腫瘤防治至關重要。為了觀察miR-105-5p對胃癌細胞脂肪酸代謝的影響,本研究檢測了磷脂、三酰甘油含量及脂質(zhì)代謝酶的表達,結(jié)果顯示,上調(diào)miR-105-5p可升高細胞磷脂和三酰甘油含水平,促進FASN、ACC1、FABP5蛋白表達,反之沉默miR-105-5p可降低細胞磷脂和三酰甘油含水平,抑制FASN、ACC1、FABP5蛋白表達,FASN、ACC1、FABP5是調(diào)控細胞脂肪酸代謝的關鍵酶,提示miR-105-5p可抑制非小細胞肺癌細胞中脂肪酸合成。

為了研究miR-105-5p調(diào)控胃癌細胞進展、脂肪酸代謝的機制,筆者首先通過TargetScan 數(shù)據(jù)庫預測發(fā)現(xiàn)miR-105-5p與SIRT1 3’UTR存在核苷酸結(jié)合位點。SIRT1是一種去乙?；?在調(diào)控細胞炎性反應、凋亡及增殖中發(fā)揮重要作用[17]。研究發(fā)現(xiàn),SIRT1同樣參與調(diào)控腫瘤細胞脂肪酸代謝[18]。鑒于miR-105-5p與SIRT1在調(diào)控胃癌細胞脂肪酸代謝中的作用,筆者隨后試圖明確兩者的靶向關系。首先雙熒光素酶報告實驗結(jié)果證實miR-105-5p與SIRT1具有負性靶向關系。隨后通過Western blot以及細胞功能實驗證實上調(diào)miR-105-5p可抑制細胞SIRT1表達,敲低miR-105-5p可促進細胞SIRT1表達,更重要的是,敲低SIRT1可逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR-105-5p對胃癌細胞惡性表型、脂肪酸合成的促進作用。上述結(jié)果證實,miR-105-5p通過負性調(diào)控SIRT1的表達,進而促進胃癌細胞的增殖、侵襲、遷移及脂肪酸合成。

綜上所述,miR-105-5p通過負性調(diào)控SIRT1促進胃癌細胞的脂肪酸代謝進而促進胃癌細胞的惡性表型,為胃癌的防治提供了潛在靶點。但本次研究結(jié)果有待進一步動物實驗、臨床樣本驗證。