利用拉曼技術(shù)檢測抗原抗體的研究與進(jìn)展

陳海云，凌偉航，林曉，吳惠文

（南寧壯博生物科技有限公司，廣西 南寧 530007）

1 拉曼技術(shù)檢測抗原抗體的原理

抗原(antigen,Ag)是指能與T 細(xì)胞、B 細(xì)胞抗原受體或抗體特異性結(jié)合，具有啟動免疫應(yīng)答潛能的物質(zhì)，抗體(Ig)是由抗原刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)后產(chǎn)生，并能與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)?？乖瓩z測的是病原體的組成蛋白，如果檢測結(jié)果為陽性，說明生物體內(nèi)含有病原體的組成成分，可直接確認(rèn)為感染病例?？乖瓩z測樣本類型一般為感染部位的樣本，例如，口咽拭子、鼻咽拭子、痰液、血清、血漿等。抗體檢測的是生物體內(nèi)免疫系統(tǒng)為應(yīng)對病毒感染而產(chǎn)生的抗體，如果檢測結(jié)果為陽性，說明生物體內(nèi)存在針對病毒的抗體，生物體正處于感染期或已經(jīng)康復(fù)，可作為輔助手段幫助確診感染，抗體檢測樣本類型一般為血液，包括血清、血漿和全血。傳統(tǒng)的抗原抗體檢測方法主要有免疫膠體金技術(shù)、ELISA技術(shù)、表面凝集技術(shù)等，這些技術(shù)操作簡單，不需要額外儀器，反應(yīng)迅速，一般在5min 內(nèi)出結(jié)果，但大多只能定性，僅可判斷陰陽性，無法數(shù)據(jù)化，且質(zhì)量參差不齊，病原檢測敏感性差。近年來，很多科技工作者研究利用拉曼技術(shù)檢測抗原抗體，有望應(yīng)用于臨床，實(shí)現(xiàn)更精準(zhǔn)的定性定量的檢測。拉曼光譜是散射光譜，是一種對分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行識別的檢測技術(shù),根據(jù)特征峰的位置和強(qiáng)度反映出物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與含量信息。傳統(tǒng)拉曼光譜信號極弱，必須能排除瑞利散射光，才能高效地收集拉曼光譜，易受熒光干擾,檢測靈敏度低，限制了其應(yīng)用范圍，而且抗原抗體本身拉曼信號及其微弱，直接采用拉曼光譜儀照射的方法，并不能檢測出抗原抗體。為克服這些缺點(diǎn)，科研人員相繼研發(fā)了輔助技術(shù)來增強(qiáng)拉曼信號強(qiáng)度。目前，在檢測抗原抗體中最常用的是表面增強(qiáng)拉曼光譜（surface enhanced Raman spectroscopy, SERS）芯片技術(shù)，大多應(yīng)用的原理是利用金屬納米顆粒包裹抗原抗體再與芯片結(jié)合，形成一個(gè)三明治結(jié)構(gòu)，以此提高拉曼圖譜的信噪比，增強(qiáng)不同拉曼峰圖的差異性,合成高靈敏的SERS 標(biāo)記物是提高SERS 靈敏性的關(guān)鍵因素。金/銀納米顆粒是最常用作SERS 標(biāo)記物的材料。SERS 信號的增強(qiáng)主要依賴電磁場增強(qiáng)和化學(xué)增強(qiáng)，使其熒光背景低、不受水干擾，可實(shí)現(xiàn)痕量無損檢測，近年來，隨著研究者不斷的研究與技術(shù)更新，利用SERS 芯片技術(shù)搭配拉曼激光的檢測手段已成為生物醫(yī)學(xué)檢測的最有力技術(shù)之一。

2 基于拉曼技術(shù)檢測抗原抗體的相關(guān)研究

病毒抗原抗體的快速檢測對疾病的診斷與預(yù)防有著重要意義。近年來，不少科研學(xué)者不斷嘗試?yán)美す饨Y(jié)合信號增強(qiáng)SERS 芯片對各種病毒的檢測進(jìn)行研究與優(yōu)化，同時(shí)在醫(yī)學(xué)癌癥和相關(guān)免疫疾病的檢測中也有大量的研究成果，其中，C 反應(yīng)蛋白（CRP）作為誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的早期生物指標(biāo)，2018 年，Rong Z 等合成了具有內(nèi)置熱點(diǎn)的拉曼報(bào)告分子，將其嵌入金核-銀殼納米顆粒，然后再與CRP 檢測抗體綴合，通過金銀顆粒包裹抗體后產(chǎn)生增強(qiáng)的拉曼信號，經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證可定量檢測最低限為0.01ng/mL-1，顯示出了較強(qiáng)的定量檢測能力。癌胚抗原(carcino-embryonic antigen CEA),是大腸癌組織產(chǎn)生的一種糖蛋白，作為抗原可引起患者的免疫應(yīng)答反應(yīng)，癌胚抗原是一個(gè)廣譜性腫瘤標(biāo)志物，它能向人們反映出多種腫瘤的存在，對大腸癌、乳腺癌和肺癌的療效判斷、病情發(fā)展、監(jiān)測和預(yù)后估計(jì)是一個(gè)較好的腫瘤標(biāo)志物，但其特異性不強(qiáng)，靈敏度不高，對腫瘤早期診斷作用不明顯。2014 年，Chunyuan Song，Linghua Min 等人，利用拉曼光譜結(jié)合SERS 芯片標(biāo)記金納米顆粒增強(qiáng)抗原信號，超靈敏地檢測癌胚胎抗原。在這項(xiàng)研究中，利用新型金納米作為SERS 標(biāo)記和SERS活性磁性納米顆粒支持底物，開發(fā)出了一種癌癥標(biāo)記物CEA 檢測方法。在0.01fg/mL 至1ng/mL 濃度范圍內(nèi)，檢測出的拉曼SERS 信號強(qiáng)度光譜圖呈良好的線性關(guān)系，可達(dá)到最低檢出限為0.01fg/mL。

寨卡(Zika)單股正鏈RNA 病毒，和我們平時(shí)熟知的登革熱(dengue fever)、西尼羅病毒病以及丙肝病毒屬于同一類病毒。這些病毒的基因組均是通過蚊蟲叮咬感染和傳播，罕見血液傳播和性傳播。導(dǎo)致的病癥通常是較輕微的。但是，一旦嬰幼兒感染會引發(fā)嚴(yán)重的疾病，導(dǎo)致死亡常見癥狀包括輕微發(fā)熱或皮疹，一般在被受感染蚊子叮咬幾天后才出現(xiàn)，利用傳統(tǒng)的檢測技術(shù)難以檢測到如此低濃度的病毒含量。2017 年，S NCHEZ-PURR M，CARR-CAMPS M，PUIG H 利用拉曼激光結(jié)合表面增強(qiáng)SERS 芯片的高靈敏度對寨卡病毒和登革熱病毒進(jìn)行多重分析，基于這個(gè)技術(shù)區(qū)分出了寨卡和登革熱非結(jié)構(gòu)蛋白1（NS1）的生物標(biāo)志物。經(jīng)過SERS 編碼的金納米顆粒能與這兩種疾病的特異性抗體結(jié)合，利用抗原抗體包被金顆粒相結(jié)合的原理檢測出2 種病毒非結(jié)構(gòu)蛋白，并利用試紙免疫定性，拉曼儀器定量，其對寨卡NS1 和登革熱NS1 的檢測限分別能較傳統(tǒng)膠體金免疫層析技術(shù)，分別提高了感染寨卡病毒和登革熱病毒的陽性檢出率15倍和7 倍，而且可以在感染后生物標(biāo)志物水平較低時(shí)都能盡早檢測出這兩種病。

在流行病毒方面，2019 年，KUKUSHKIN V I，IVANOV N M 等學(xué)者采用表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）技術(shù)，建立了流感病毒檢測的適體傳感器。為了獲得高靈敏度，組裝了一級適體、流感病毒和二級適體的“三明治”。將一級適體連接到SERS 底物的金屬顆粒上，捕獲流感病毒并與用拉曼活性分子標(biāo)記的二級適體結(jié)合。信號受初級和次級適體濃度的影響。檢出限低至10-4，每個(gè)探針4個(gè)血凝單位，用于檢測H3N2 病毒（A/England/42/72）?；谶m體的傳感器可識別各種流感病毒株，包括H1、H3和H5 血凝素亞型。SERS 將拉曼信號放大106 ～109 倍，產(chǎn)生極好的靈敏度。Ralbovsky NM, Halámková L 等利用拉曼高光譜技術(shù)結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)開發(fā)了一種基于唾液分析的阿爾茲海默癥診斷新方法。使用拉曼高光譜技術(shù)分析從正常人、阿爾茲海默癥和輕度認(rèn)知障礙（MCI）個(gè)體收集的唾液樣本。將遺傳算法和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)應(yīng)用于拉曼光譜數(shù)據(jù)集以構(gòu)建診斷算法。其研究結(jié)果示，區(qū)分這三類的準(zhǔn)確率達(dá)到99%。

除了可以檢測以上提到的病毒與疾病，因其利用拉曼技術(shù)可以直接對生物樣本進(jìn)行檢測，無須對組織、唾液、血清等樣本進(jìn)行復(fù)雜的處理，大大提高其檢測效率與成本，其價(jià)值促使科研學(xué)者對這項(xiàng)技術(shù)表現(xiàn)出了極高的研發(fā)狂潮，近年來，研究出了利用拉曼技術(shù)快速檢測鼻咽癌、胰腺癌、胃癌和食管癌等方法。由此可見，拉曼技術(shù)作為一種無創(chuàng)、高效、準(zhǔn)確的診斷方法具有顯著的潛力。

3 國內(nèi)外制備拉曼相關(guān)產(chǎn)品情況

近年來，為了獲得最優(yōu)的拉曼增強(qiáng)信號，研究者發(fā)現(xiàn)控制粒子的團(tuán)聚變得非常重要。常用于制備拉曼芯片的剛性基底材料有玻璃、石英、聚二甲基硅氧烷(POMS)、晶體硅等，其中石英芯片的透光性好、拉曼背景低，但價(jià)格昂貴，玻璃和晶體硅機(jī)械強(qiáng)度大、通道表面易修飾，聚二甲基硅氧烷(POMS)，其成本價(jià)格較低，但針對病毒檢測效果不太理想，易產(chǎn)生記憶效應(yīng)。近年來，利用柔性材料替代剛性材料作為芯片基底越來越普遍。楊峰、文枰等人采用滴鑄法來制備柔性的SERS 芯片，發(fā)現(xiàn)了鋁箔在波長為532nm 激發(fā)光具有很高的反射率，選擇了鋁箔作為襯底，使增強(qiáng)效果高至1.32×108。ZengFY 等基于常用濾紙和銀納米顆粒（AgNP）制備了紙基SERS 芯片，成功用于檢測低濃度的典型SERS 分析物模分子，包括羅丹明6G 和結(jié)晶紫。Reokrungruang P 等研制出了一種簡單且成本效益高的等離子體紙作為拉曼表面增強(qiáng)SERS 柔性基底，將普通濾紙浸入金納米棒溶液中制備等離子體激元紙，結(jié)合磁分離成功用于癌癥的檢測與篩查。Oliveira M J 等利用兩種不同類型的紙制備SERS 襯底：高孔隙率紙和低孔隙率紙。將含有銀納米星（AgNSs）的溶液滴鑄在紙上圖案化的親水孔上。大多數(shù)納米顆粒保留在辦公紙基材的照明表面。經(jīng)過驗(yàn)證，沉積AgNs 的辦公紙基材，拉曼信號顯著增強(qiáng)且在儲存5 周后保持穩(wěn)定，但紙張本身的拉曼信號會造成干擾。綜上，在工藝簡單和低成本的要求下,制備具有穩(wěn)定、均一、普適性強(qiáng)，能顯著減少咖啡環(huán)效應(yīng)的SERS 基底仍然處于一個(gè)研發(fā)成果全面開花但并未實(shí)現(xiàn)商業(yè)化的狀態(tài)，依舊面臨巨大的挑戰(zhàn)，成功之路道阻且長。

國外的拉曼光譜檢測系統(tǒng)研發(fā)起步較早，技術(shù)方面相對較成熟，市場已普遍存在滿足科研測量要求的臺式拉曼光譜儀器和便攜式的手持拉曼光譜儀，但價(jià)格還相對昂貴。拉曼光譜儀市場容量近幾年不斷增長，主要市場情況為應(yīng)用在毒品檢測和藥品檢測、發(fā)酵工藝實(shí)時(shí)監(jiān)測等方面。應(yīng)用于商業(yè)化檢測抗原抗體尚未有任何例子，即主要原因即為對抗原抗體與金銀納米粒子的包被與結(jié)合，包被好的粒子還要考慮拉曼增強(qiáng)芯片的結(jié)合與干擾，雖檢測這方面快速便捷，但這道前處理的過于復(fù)雜的工序和要搭建的龐大拉曼光譜數(shù)據(jù)庫就讓很多學(xué)者望而卻步。

4 結(jié)語

綜上，拉曼檢測技術(shù)作為前景廣闊、便利快捷的檢測技術(shù)，可幫助更快捷便利地檢測出抗原抗體，并能實(shí)時(shí)定量地檢測出病毒在生物體內(nèi)的變化過程，然而，拉曼光譜技術(shù)想在檢驗(yàn)行業(yè)真正地、廣泛地應(yīng)用于臨床與商業(yè)化，仍然存在諸多挑戰(zhàn)。其中，研制出能直接不借助輔助芯片就能提高信號的拉曼光譜儀是走向廣闊市場，走向人民的關(guān)鍵，而且現(xiàn)在的儀器分析圖譜算法過于復(fù)雜，需要配備拉曼檢測儀器標(biāo)準(zhǔn)化且可靠易操作的數(shù)據(jù)分析方法，將復(fù)雜的拉曼光譜數(shù)據(jù)算法轉(zhuǎn)化為簡單易懂的可視結(jié)果，并且建立其龐大的不同物質(zhì)的全面的拉曼光譜特征峰數(shù)據(jù)庫是一項(xiàng)復(fù)雜且長遠(yuǎn)的工作。當(dāng)然，這個(gè)數(shù)據(jù)庫一旦能建立起來，也將成為一類相當(dāng)寶貴的資源。而對于最常用的輔助增強(qiáng)芯片SERS 方法來說，目前是仍舊無法獲得具有良好穩(wěn)定性和適用性的SERS基底且前處理過程并不便利。相信隨著技術(shù)的進(jìn)步以及研究者的不斷努力，拉曼光譜技術(shù)可以在不久的將來廣泛應(yīng)用于生物樣本檢測，為臨床實(shí)驗(yàn)室和基層現(xiàn)場診斷提供一種顛覆性的前沿技術(shù)。