基于網絡藥理學分析羌活的藥理作用機制

萬亭君

(西南民族大學民族學博士后科研流動站,成都 610041;新華文軒出版?zhèn)髅焦煞萦邢薰静┦亢罂蒲泄ぷ髡?成都 610036)

0 引言

羌活NotopterygiuminchumTing ex H,T- Chang是一種傘形科植物的干燥根莖和根,又名護羌使者、羌青、胡王使者、退風使者等,在《中國藥典》中記載其味辛、苦,性溫,歸膀胱、腎經,具有解表散寒、祛風除濕、止痛的功效[1]。羌活傳統(tǒng)產區(qū)主要是藏族、羌族和其他少數(shù)民族聚居的高寒山區(qū)[2],是中、藏、羌醫(yī)藥體系常用藥物,具有悠久的藥用歷史和廣泛的應用范圍?，F(xiàn)代藥理研究表明,羌活具有抗炎、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、解熱鎮(zhèn)痛等作用,對心腦血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和中樞神經系統(tǒng)有顯著影響[3]。網絡藥理學為中藥研究帶來了新的技術與方法,推進了藥物發(fā)現(xiàn)、開發(fā)和治療機制的理解過程,其系統(tǒng)性、整體性的研究理念與中藥復方多組分、多功效、協(xié)同作用等特點不謀而合,在中藥藥理機制研究、新藥發(fā)現(xiàn)及不良反應研究等方面取得了良好成效[4]。本研究為拓展羌活的現(xiàn)代藥理學內涵,選用網絡藥理學方法對其藥理成分進行篩選、分析,以期為更有針對性地深入探索其藥理機制奠定基礎。

1 研究方法

1.1 數(shù)據(jù)庫的選擇

中藥分子機制的生物信息學分析工具(BATMAN-TCM)、中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺(TCMSP)、STITCH 5.0、SwissTargetPrediction、通用蛋白質知識庫(Uniprot)、String 11.5、DAVID 6.8生物信息學資源。

1.2 優(yōu)效化合物的篩選

通過TCMSP檢索羌活的所有化學成分,設置化合物口服生物利用度(OB)閾值為≥30%,設定化合物類藥性(DL)閾值為≥0.18,獲得羌活的優(yōu)效化合物。

1.3 化合物靶點的預測

將羌活的優(yōu)效化合物分別輸入TCMSP、BATMAN-TCM、STITCH 5.0、SwissTargetPrediction檢索成分靶點,合并、刪除重復靶點,再應用Uniprot數(shù)據(jù)庫轉換靶點蛋白名為基因名。

1.4 化合物-靶點網絡的構建

應用Cytoscape 3.9.1將篩選出的優(yōu)效化合物和預測得到的靶點基因進行可視化呈現(xiàn),構建化合物—靶點網絡。

1.5 蛋白質間相互作用(PPI)網絡的構建

在String 11.5數(shù)據(jù)庫中導入篩選所得的優(yōu)效化合物對應的靶基因,設置最低相互作用分數(shù)要求為0.900,獲得靶點間的相互作用網絡,進一步應用CytoHubba分析獲得排名前10的核心基因。

1.6 基因本體論(GO)功能富集分析

將篩選出來的靶基因輸入DAVID數(shù)據(jù)庫進行GO功能富集分析。

2 結果

2.1 優(yōu)效化合物的篩選

通過TCMSP檢索羌活的所有化學成分,共得到185個化學成分,閾值設定OB≥30%,DL≥0.18,結果共篩選出羌活優(yōu)效化合物15個(表1)。

表1 羌活優(yōu)效化合物篩選

2.2 化合物-靶點作用網絡的構建

通過TCMSP檢索獲得相關靶點,合并上述優(yōu)效化合物輸入至BATMAN-TCM、STITCH、SwissTargetPrediction獲得的靶點,共檢索得到170個靶點蛋白,通過Uniprot數(shù)據(jù)庫轉換基因后應用Cytoscape 3.9.1構建化合物-靶點作用網絡(圖1)。圖中共有183個節(jié)點,包含13個化合物節(jié)點、170個靶點節(jié)點、246條連接線。圓形節(jié)點代表靶點,菱形節(jié)點代表化合物,連接線代表化合物-靶點的相互作用。圖中可見有多處同一靶點與不同化合物之間存在關聯(lián),進一步印證了中藥多成分、多靶點的特點。

圖1 羌活優(yōu)效化合物-靶點作用網絡Fig.1 Notopterygiuminchum compound-target action network

2.3 羌活靶點的PPI網絡構建與核心基因的獲得

以“置信分數(shù)≥0.900”作為條件構建羌活靶點PPI網絡圖(圖2)。圖中有128個節(jié)點、560條邊,其中節(jié)點表示靶點,邊表示靶點與靶點之間的相互作用關系。應用Cytoscape 3.9.1將數(shù)據(jù)進行可視化呈現(xiàn),進一步采用MCODE模塊,以“score cutoff =0.2、 k core=2、 maximum depth = 100和degree cutoff=2”為條件進行聚類分析,共獲得9個子網絡,取分值最高的前5個聚類(圖3)。應用Cytohubba對網絡中的節(jié)點進行排名,通過MCC的拓撲學分析方法獲得排名前10的核心基因網絡(圖4)。

圖2 羌活優(yōu)效化合物靶點PPI網絡Fig.2 Notopterygiuminchum compound target PPI network

圖3 聚類分值前5的子網絡Fig.3 Subnetworks of top 5 cluster

圖4 排名前10的核心基因網絡Fig.4 Top 10 core gene networks

圖3a～圖3e依次為分值降序的聚類子網絡。

2.4 羌活靶點的GO分析

將數(shù)據(jù)導入DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫,對羌活靶點的生物過程、細胞成分和分子功能進行富集分析,按照顯著性程度P<0.01獲得了GO條目333條,靶點涉及的生物過程條目有200條,細胞成分43條,分子功能90條。其中,生物過程主要富集在對藥物的反應、外源代謝過程及對外源刺激的反應等;分子功能主要富集在RNA聚合酶II轉錄因子活性、配體活化序列特異性DNA結合、血紅素結合及細胞色素-c氧化酶活性等;細胞成分主要富集在線粒體呼吸鏈復合體Ⅳ、線粒體和大分子復合體等。

3 討論

現(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn),羌活具有抗心律失常、抗腫瘤、抗缺血缺氧、抗血栓、調節(jié)中樞神經、抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌及抗病毒等作用[5]。為進一步闡釋羌活的藥理作用機制,利用網絡藥理學方法,基于篩選出的羌活的優(yōu)效化合物構建化合物-靶點網絡和PPI網絡進一步對靶點進行基因本體的功能注釋,為羌活優(yōu)效化合物的多靶點、多功效藥理作用機制提供研究基礎。

研究證實,香豆素糖苷、達萵瑟苷、羌活酚等香豆素類化合物是羌活發(fā)揮抗炎、抗氧化應激損傷等作用的有效成分[6]。羌活的甾體類化合物,如谷甾醇、β-谷甾醇也表現(xiàn)出廣泛的藥理活性,如抗炎、降血脂、抗腫瘤、抗血栓[7]等。此外,香葉木素等羌活的黃酮類化合物被證實有強烈的抗氧化、抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗阿爾茨海默病及調節(jié)免疫作用[8]。

香豆素類化合物是羌活中主要的非揮發(fā)性成分,也是發(fā)現(xiàn)最早、最多的一類成分[9],該結論與TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選出來的分子靶標基本一致,說明通過網絡藥理學篩選的羌活主要分子靶標的準確性較高。

研究共預測得到羌活優(yōu)效化合物的靶點183個,進一步將其進行PPI分析得到排名前10的核心基因,從化合物-靶點網絡可以推測,羌活對疾病的治療或調節(jié)作用可能通過優(yōu)效化合物與關鍵靶點之間的相互作用而發(fā)揮。

這10個核心基因均為細胞色素c氧化酶的組分,驅動氧化磷酸化[10]。研究顯示,COX6B1具有增強能量消耗、抑制脂肪生成的作用[11]。COX7C對線粒體蛋白質組的維持和線粒體功能的穩(wěn)定至關重要[12]。COX6C表達的變化在心血管疾病、腎臟疾病、腦損傷和腫瘤中都廣泛存在[13]。COX5A具有減少心肌細胞死亡并促進心臟恢復的作用[14],具有保護皮質神經元受到缺血缺氧損傷的作用[15]。COX4I1具有預防短暫性局灶性腦缺血損傷的作用[16],并與肥胖和2型糖尿病相關[17]。MT-CO1與腫瘤[18]、發(fā)生新心血管事件風險相關[19]。COX5B通過自噬途徑協(xié)調以平衡抗病毒信號傳導活性[20],與膿毒癥有著顯著關聯(lián)[21]。研究證實,其與年齡依賴性肥胖相關[22]。MT-CO2的表達與腫瘤預后[23]、冠狀動脈性疾病[24]相關。COX7B與癌癥的化學敏感性和耐藥性相關[25]。COX8A與脂質代謝[26]、腫瘤相關[27]。

應用網絡藥理學方法初步探索了羌活的優(yōu)效化合物、關鍵靶點、核心基因等,既驗證了羌活的傳統(tǒng)藥理學作用,又有助于羌活潛在藥理作用和作用靶點等的挖掘,下一步還可對羌活的優(yōu)效單體成分進行深入研究,為新藥開發(fā)、成藥優(yōu)化、臨床闡釋等提供數(shù)據(jù)支持和研究基礎。