阿魏酸對CT-26的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬相關(guān)通路的影響

陳杉彬,趙東,欒春光*,喬宗偉,鄭佳,張強,馮政,王德良

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司,北京,100015)

2(宜賓五糧液股份有限公司,四川 宜賓,644000)

3(酒類品質(zhì)與安全國際聯(lián)合研究中心,北京,100015)

阿魏酸(ferulic acid,FA),能夠抗氧化和抗自由基活性,是較多物質(zhì)的前體物質(zhì)。其中阿魏酸鈉作為藥物或制劑的輔料組成,通常被用來治療心腦血管,具有抗炎、護(hù)肝等功效。而阿魏酸在中草藥及天然食品中含量更高,在不轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)時,阿魏酸是否具有其他的生理學(xué)功效同樣值得深入研究。阿魏酸用途廣泛,是傳統(tǒng)發(fā)酵食品如白酒、醋中的典型風(fēng)味物質(zhì)[1]。盡管阿魏酸得到了廣泛的應(yīng)用,但其對細(xì)胞生理活性的影響及分子機(jī)理目前尚不十分明確。

CT-26細(xì)胞系培養(yǎng)條件簡單,無需特殊培養(yǎng)基,且具有造模成瘤快的特點[2]。利用CT-26細(xì)胞系構(gòu)建BALB/c小鼠直腸癌模型已經(jīng)成為一種通用的小鼠模型[3]。目前,CT-26細(xì)胞系已經(jīng)被應(yīng)用到新藥開發(fā)、細(xì)胞代謝通路研究、毒理學(xué)[4]和免疫應(yīng)答[5]等研究中。因此,該細(xì)胞系也被用來考察生物活性物質(zhì)對細(xì)胞生理活性影響和生物活性物質(zhì)篩選的一種手段。

細(xì)胞凋亡(apoptosis)是細(xì)胞自主的死亡,在多數(shù)疾病中發(fā)揮作用,針對細(xì)胞凋亡能夠改善疾病的發(fā)生[6-7]。同樣,細(xì)胞自噬也是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)所必需的,它對于腫瘤等疾病的病理生理過程具有一定的調(diào)控作用[8-9]。細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬是2種顯著不同的細(xì)胞形式,兩者緊密結(jié)合,密切相關(guān)[10-14]。兩者的動態(tài)平衡對細(xì)胞的生理活性至關(guān)重要。細(xì)胞自噬能夠?qū)⑹軗p的細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為細(xì)胞所需的營養(yǎng);此外,自噬能夠調(diào)控細(xì)胞凋亡,當(dāng)自噬使細(xì)胞內(nèi)蛋白和細(xì)胞器過量消耗,致使細(xì)胞無法繼續(xù)生存時,即影響細(xì)胞的死亡[15-17]。因此,深入研究阿魏酸對細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬的影響有利于明晰其對細(xì)胞生理的作用機(jī)制。

基于此,本研究利用不同濃度阿魏酸處理CT-26細(xì)胞系,考察阿魏酸對細(xì)胞生理活性影響的分子機(jī)理,在分子生物學(xué)角度揭示阿魏酸的生物活性物質(zhì)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CT-26.WT(ATCC CRL-2638)、RPMI-1640培養(yǎng)基,普諾賽公司;阿魏酸,99%,阿拉丁公司; BCAkit,索萊寶公司;胎牛血清、胰蛋白酶、青鏈霉素,Hyclone公司;cck8,日本同仁公司;一抗LC3,PM036,P62,PM045,MBL公司; Bcl-2(15071S)、Bax(2772S)、GAPDH(5174S)、二抗(anti-rabbit,7074S;anti-Mouse,7076S),美國CST公司;caspase 3(19677-1-AP,一抗),三鷹生物公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Mini-PROTEAN Tetra,Bio-Rad公司;SpectraMax?iD3,Molecular Devices公司;ChemiScope 6000 Exp,中國勤翔公司;7500 Fast/7500(qRT-PCR)系統(tǒng),Thermo Fisher公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

CT-26細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)液中,添加胎牛血清和青鏈霉素,正常培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長至80%～90%左右融合度時,胰蛋白酶傳代處理。

1.3.2 細(xì)胞存活率實驗

接種CT-26細(xì)胞,每孔2.0×104,96孔板,24 h后細(xì)胞貼壁,用阿魏酸分別處理24 h和48 h。使用CCK-8檢測細(xì)胞[18]。細(xì)胞存活率的計算如公式(1)所示:

(1)

式中:A處理組為不同萜烯類化合物測定的吸光度;A對照組為正常培養(yǎng)基測定的吸光度。

1.3.3 細(xì)胞劃痕實驗

CT-26細(xì)胞提前鋪板,正常生長后將移液槍頭垂直于孔板進(jìn)行平穩(wěn)豎直劃線,棄舊培養(yǎng)液,用PBS清洗2次?？瞻捉M加入無血清培養(yǎng)液,實驗組加入無血清培養(yǎng)液配制的不同濃度阿魏酸,置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在顯微鏡下觀察大約同一位置,不同時間點(0、12、24、48 h)的狀態(tài),并拍照計算[19],細(xì)胞遷移率的計算如公式(2)所示:

細(xì)胞遷移率/%=

(2)

1.3.4 Western blotting試驗

將CT-26細(xì)胞按照1.6×105/孔放置6孔板中,阿魏酸處理24 h后,用蛋白質(zhì)裂解液裂解CT-26細(xì)胞,添加裂解液后放置在冰箱在4 ℃中10 min,并離心15 min,以10 000×g。對總蛋白質(zhì)濃度定量。加5× sample buffer制樣。樣品在98 ℃下加熱10 min,然后以12 000×g離心。將10 μL上清液加到10% SDS-PAGE凝膠上。電泳約1 h,觀察溴酚藍(lán)位置,停止電泳,通過濕轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至膜上,轉(zhuǎn)膜條件為120 V、60 min,并用封閉緩沖液室溫封閉1 h,添加不同一抗4 ℃孵育過夜。過夜后用TBST洗膜3次5 min,對應(yīng)二抗孵育1 h后,繼續(xù)洗膜,顯色后定量分析。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行多組間方差分析和T檢驗,所有實驗數(shù)據(jù)均為3個平行試驗的平均值。用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(standard error,SE)表示;圖表由Origin 2018繪制;半定量分析和比較由ImageJ軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 阿魏酸對細(xì)胞存活率的影響

本研究首先考察了阿魏酸濃度對細(xì)胞活力的影響,用以篩選處理細(xì)胞的最適阿魏酸濃度,研究結(jié)果見圖1。研究結(jié)果表明,與對照組比較,在使用阿魏酸處理CT-26細(xì)胞24 h和48 h[20]后,各組細(xì)胞的活力均受到顯著抑制,且抑制率呈顯出濃度和時間依賴性,阿魏酸處理濃度越大,細(xì)胞存活率越低;處理時間越長,細(xì)胞存活率越低。但在阿魏酸處理濃度為100 μmol/L時,處理時間為24 h與48 h,反而會在一定程度上促進(jìn)CT-26細(xì)胞的增殖;同時,在阿魏酸處理濃度為800 μmol/L時,處理時間(24 h或48 h)對CT-26細(xì)胞存活率沒有明顯區(qū)別。采用SPSS 23.0軟件分析的結(jié)果表明,阿魏酸作用24和48 h的IC50均在800 μmol/L以上,阿魏酸濃度為0～400 μmol/L時,對細(xì)胞增殖沒有明顯影響。因此,后續(xù)研究中選用阿魏酸濃度為0～400 μmol/L,處理時間為24 h作為細(xì)胞的處理條件。

圖1 不同濃度阿魏酸對細(xì)胞活力的影響

2.2 阿魏酸對細(xì)胞遷移能力的影響

遷移能力也是癌癥細(xì)胞活力的重要指標(biāo),抑制癌癥細(xì)胞的遷移能力能夠一定程度地緩解癌癥進(jìn)程[21]。然而,阿魏酸是否會對癌癥細(xì)胞的遷移能力產(chǎn)生影響尚不清楚。本研究采用細(xì)胞劃痕實驗對阿魏酸對癌癥細(xì)胞遷移能力進(jìn)行了初步研究。細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果表明(圖2),與對照組相比較,不同濃度的阿魏酸可顯著抑制CT-26細(xì)胞的遷移,降低了結(jié)腸癌細(xì)胞CT-26的遷移能力;而且,隨著藥物濃度增加,作用時間延長,細(xì)胞遷移速率降低越顯著(P<0.05)。該結(jié)果與阿魏酸對細(xì)胞存活率的影響基本一致。同時,該結(jié)果提示細(xì)胞存活率與細(xì)胞遷移速率呈正相關(guān)。

a-劃痕實驗結(jié)果;b-劃痕實驗半定量結(jié)果

2.3 阿魏酸對細(xì)胞凋亡關(guān)鍵信號通路Bcl-2/Bax的影響

細(xì)胞凋亡是由自我控制的細(xì)胞死亡,對腫瘤的抑制有積極作用。其中Bcl-2/Bax通路是影響細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵通路之一[22-23]。研究中使用磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)作為內(nèi)參,使用不同濃度(0～400 μmol/L)阿魏酸處理來考察阿魏酸對細(xì)胞凋亡的影響。研究結(jié)果見圖3。圖3中的結(jié)果顯示,與0 μmol/L處理組相比較,在GAPDH(內(nèi)參)表達(dá)量基本一致的情況下,隨著阿魏酸處理濃度的增加,抑制凋亡的關(guān)鍵蛋白Bcl-2的表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢,而促凋亡關(guān)鍵蛋白Bax的表達(dá)量則逐漸增加。雖然在100 μmol/L處理后,抑制凋亡關(guān)鍵蛋白Bcl-2相比200 μmol/L處理組其灰度值反而有一定程度的減少,但并不影響隨阿魏酸濃度增加Bcl-2蛋白表達(dá)量降低的整體趨勢。同時,半定量結(jié)果也表明,阿魏酸可能是通過調(diào)控Bcl-2/Bax途徑對細(xì)胞凋亡進(jìn)行調(diào)控的,阿魏酸能夠在一定程度上促進(jìn)細(xì)胞凋亡并導(dǎo)致細(xì)胞存活率下降。

半胱氨酸蛋白酶(caspases)屬于半胱氨酸蛋白酶家族,它是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵[24]。本研究對凋亡通路上游的Cleaved caspase3和caspase3的蛋白表達(dá)情況也進(jìn)行了考察。研究結(jié)果表明(圖3-c、圖3-d,半定量分析),在GAPDH(內(nèi)參)表達(dá)量沒有受到影響的情況下,隨著阿魏酸處理濃度的增加,caspase3被切割為Cleaved caspase3蛋白的量也在增加,從而進(jìn)一步導(dǎo)致更多的Cleaved caspase3蛋白聚集和表達(dá)。該研究結(jié)果提示,阿魏酸在一定程度上通過caspase3通路對細(xì)胞凋亡進(jìn)行調(diào)控。

2.4 阿魏酸對細(xì)胞自噬調(diào)控關(guān)鍵蛋白的影響

LC3和P62是調(diào)控細(xì)胞自噬的關(guān)鍵蛋白[25]。研究中以GAPDH為內(nèi)參,通過阿魏酸處理,考察其對結(jié)腸癌CT-26細(xì)胞中LC3和P62蛋白的表達(dá)影響。如圖4-a所示,內(nèi)參GAPDH的表達(dá)量一致,LC3Ⅱ的表達(dá)量隨著阿魏酸處理濃度的增加而增加,400 μmol/L阿魏酸處理組LC3II表達(dá)量最高;同時,P62的表達(dá)水平則隨隨著阿魏酸處理濃度的增加具有略微下降的趨勢。半定量分析結(jié)果(圖4-b)提示,低濃度的阿魏酸(<100 μmol/L)對CT-26細(xì)胞細(xì)胞自噬沒有造成顯著影響;而較高濃度的阿魏酸能夠促進(jìn)細(xì)胞自噬。

a-自噬關(guān)鍵蛋白免疫印跡結(jié)果;b-自噬關(guān)鍵蛋白灰度值分析

3 結(jié)論與討論

為探究在傳統(tǒng)發(fā)酵食品及中草藥中含量更多的阿魏酸具體作用,以阿魏酸為研究對象,通過不同濃度的阿魏酸對CT-26細(xì)胞進(jìn)行處理,考察在不同濃度處理條件下,阿魏酸對CT-26細(xì)胞的增殖情況和遷移能力等細(xì)胞生理活性的影響。研究表明,在同一處理濃度下,細(xì)胞存活率隨時間的延長而減少,但這種減少不是無限制的,在高濃度阿魏酸處理48 h和24 h時,其細(xì)胞存活率基本一致。而當(dāng)處理時間相同時,隨著阿魏酸處理濃度增大,細(xì)胞存活率逐漸降低。雖然本研究在使用100 μmol/L阿魏酸處理時,結(jié)果提示阿魏酸在一定程度上對CT-26細(xì)胞的增殖有一定促進(jìn)作用(圖1),但并不影響隨著阿魏酸濃度增加,細(xì)胞存活率降低的趨勢。同時阿魏酸對CT-26細(xì)胞的遷移能力影響的研究結(jié)果表明,阿魏酸對細(xì)胞遷移能力具有抑制作用。

細(xì)胞凋亡在生物體中的作用主要是維持穩(wěn)定,生物體主要依靠凋亡作用對癌細(xì)胞進(jìn)行清除,一旦這種凋亡作用紊亂將導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖[26]。凋亡通路上游主要受到caspase家族的調(diào)控,在細(xì)胞凋亡出現(xiàn)后,caspase3蛋白被激活,同時被切割并活化促進(jìn)Cleaved caspase3發(fā)揮生物學(xué)作用。本研究結(jié)果表明,隨著阿魏酸處理濃度的增加,造成了Cleaved caspase3蛋白積累增加,達(dá)到調(diào)控細(xì)胞凋亡的目的。

研究表明,細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡通路相互關(guān)聯(lián),互為調(diào)控。細(xì)胞自噬能夠抑制細(xì)胞凋亡,進(jìn)行細(xì)胞的正常生命活動;二者會相互調(diào)控,相互作用[27-28]。細(xì)胞自噬也是維持生命穩(wěn)態(tài)的重要生命活動,而控制細(xì)胞自噬的主要標(biāo)志蛋白為LC3和P62。當(dāng)細(xì)胞自噬流增大的時候,LC3Ⅱ蛋白增多,而P62蛋白減少。本研究通過不同濃度阿魏酸對結(jié)腸癌細(xì)胞處理后發(fā)現(xiàn),低濃度阿魏酸對細(xì)胞自噬沒有明顯影響,在高濃度條件下,能夠一定程度上促進(jìn)細(xì)胞自噬的發(fā)生。該結(jié)果提示,在低濃度阿魏酸條件下,CT-26細(xì)胞可能能夠通過細(xì)胞自噬維持正常生理活動,甚至促進(jìn)細(xì)胞的增殖,而在高濃度條件下,一旦超過臨界點,細(xì)胞自噬與細(xì)胞凋亡進(jìn)行協(xié)同作用,抑制細(xì)胞的存活,導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡。

綜上所述,一定濃度的阿魏酸可能通過細(xì)胞自噬及細(xì)胞凋亡通路中關(guān)鍵信號蛋白的表達(dá)量抑制CT-26細(xì)胞的增殖和遷移,并導(dǎo)致CT-26細(xì)胞死亡。該結(jié)果表明,作為阿魏酸鈉等功能成分的前體物質(zhì)阿魏酸具有本身特色生物活性,能夠?qū)?xì)胞生理產(chǎn)生一定的影響。后續(xù)將圍繞中草藥及食品中不同阿魏酸衍生物的具體含量及功能作用進(jìn)行深入研究,明晰其具體協(xié)同關(guān)系及功能作用之間的強弱關(guān)系。