枸杞籽油對(duì)中波紫外線誘導(dǎo)人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞光損傷的防護(hù)作用

王學(xué)紅,尹星星,陸杰,張靖鵬,2,楊永晶*

1(青海大學(xué) 生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院,青海 西寧,810016)

2(青海康普生物科技股份有限公司,青海 西寧,810003)

紫外線輻射是引起皮膚外源性老化的重要因素之一,中波紫外線(ultraviolet B,UVB)的穿透力較淺,對(duì)表皮細(xì)胞的毒性更強(qiáng)、損傷程度更大[1]。過度暴露于UVB會(huì)引起皮膚粗糙、色素沉著和炎癥反應(yīng),甚至導(dǎo)致皮膚惡性腫瘤的發(fā)生[2]。皮膚長期遭受UVB輻射會(huì)造成細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)的積累。一方面,ROS的過量積累可上調(diào)皮膚細(xì)胞內(nèi)促凋亡因子Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)的表達(dá),下調(diào)抗凋亡因子B淋巴細(xì)胞瘤/白血病-2(B cell lymphoma-2,Bcl-2)的表達(dá),并激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cystein-asparate protease-3,caspase-3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(cystein-asparate protease-9,Caspase-9)和p53,進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,加速皮膚衰老[3-4]。另一方面,ROS的過量積累促使核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)的激活,導(dǎo)致腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)等炎性細(xì)胞因子的分泌,誘發(fā)皮膚炎癥反應(yīng)進(jìn)而引起皮膚光損傷[5]?？梢?細(xì)胞凋亡與炎癥反應(yīng)是UVB誘導(dǎo)皮膚光損傷的重要因素。

皮膚長期暴露于紫外線照射產(chǎn)生過多ROS,引起細(xì)胞凋亡與炎癥反應(yīng),加快皮膚衰老的速度。人們可通過減少與紫外線的接觸或涂抹防曬劑來防止皮膚光損傷的發(fā)生[6]。防曬劑分為傳統(tǒng)的物理防曬劑、化學(xué)防曬劑和新型天然植物防曬劑。物理防曬劑一般停留在皮膚表面,沉積形成白色層,會(huì)影響皮脂腺及汗腺分泌而給皮膚造成負(fù)擔(dān),化學(xué)防曬劑易破壞皮膚屏障、引起皮膚過敏等,且使用時(shí)要充分考慮與皮膚的結(jié)合度[7]。天然植物活性成分對(duì)皮膚作用溫和、安全性高且藥效持久穩(wěn)定,已成為抗光損傷物質(zhì)開發(fā)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[8]。研究表明,植物油脂具有抗炎、抗氧化等多種活性,加之其綠色環(huán)保、使用安全和易被皮膚吸收等優(yōu)勢(shì),可作為天然防曬劑的理想原料進(jìn)一步開發(fā)和利用。例如,山茶油、牡丹籽油、橄欖油等植物油脂已被作為防曬劑原料應(yīng)用于化妝品中[9-10]。

枸杞(LyciumbarbarumL.)為茄科、枸杞屬植物,卵狀菱形,有“紅寶”之稱,作為我國傳統(tǒng)的藥食同源植物,主要分布在我國寧夏、青海等西北地區(qū)[11-12]。隨著枸杞汁、枸杞酒等產(chǎn)品產(chǎn)量的增長,大量枸杞廢渣(含有大量枸杞籽)帶來的環(huán)境污染和資源浪費(fèi)問題日益突出。枸杞籽油是從枸杞籽中提取獲得的一種功能性油脂,含有不飽和脂肪酸、維生素E、類胡蘿卜素和磷脂等天然活性成分,具有抗氧化、延緩衰老、緩解抑郁和增強(qiáng)免疫功能的藥理作用[13-16]。研究和開發(fā)枸杞籽油不僅能解決廢渣污染問題,而且具有較大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。LI等[13]證明枸杞籽油具有自由基清除能力,因此,它具有一定抗皮膚光損傷的潛力。然而,關(guān)于枸杞籽油對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞的抗光損傷作用研究尚未見報(bào)道。

因此,本研究在測(cè)定枸杞籽油中主要活性成分含量的基礎(chǔ)上,以UVB誘導(dǎo)的人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞(human immortalized keratinocytes,HaCaT)為光損傷模型,通過檢測(cè)細(xì)胞存活率、ROS含量、細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞凋亡相關(guān)因子和炎癥因子來探討枸杞籽油對(duì)UVB誘導(dǎo)的光損傷HaCaT細(xì)胞的防護(hù)作用,以期為天然抗光損傷物質(zhì)的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù),為枸杞籽油的有效利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

HaCaT細(xì)胞,武漢普諾賽生命科技有限公司;枸杞籽油,青?？灯丈锟萍加邢薰尽?/p>

1.1.2 試劑

HaCaT專用培養(yǎng)基[含體積分?jǐn)?shù)為15%的胎牛血清(fetal calf serum,FBS)]、胰蛋白酶、磷酸緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)、MEM培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素混合液,武漢普諾賽生命科技有限公司;增強(qiáng)型細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒(cell counting kit-8,CCK-8)、ROS熒光法試劑盒、一步法TUNEL流式凋亡檢測(cè)試劑盒、TNF-α、IL-1β和IL-6酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked-immuno-sorbent assay,ELISA)試劑盒,武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司;總RNA提取試劑盒、FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑、SuperReal彩色熒光定量預(yù)混試劑,天根生化科技(北京)有限公司;Tween-80,生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HF100細(xì)胞培養(yǎng)箱,上海力申科學(xué)儀器有限公司;Happy-TL21臺(tái)式高速冷凍離心機(jī),長沙東旺實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;Ti2熒光倒置顯微鏡,伯泰科技有限公司;L125紫外輻射儀,深圳市林上科技有限公司;1510酶標(biāo)儀,賽默飛世爾科技(中國)科技有限公司;KH-600E超聲波清洗儀,昆山禾創(chuàng)儀器有限公司;B90883流式細(xì)胞儀,貝克曼庫爾特生物科技(蘇州)有限公司;SYNERGY LX多功能酶標(biāo)儀,美國伯騰儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 枸杞籽油主要活性成分的測(cè)定

分別按照GB 5009.168—2016、GB 5009.83—2016、DB64/T 1514—2017、《保健食品中功效成分檢測(cè)方法》和GB 5009.82—2016(第一法)提供的方法測(cè)定枸杞籽油中脂肪酸、β-胡蘿卜素、玉米黃質(zhì)、葉黃素、谷甾醇以及維生素E的含量。

1.3.2 HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)

HaCaT細(xì)胞采用含15% FBS的HaCaT細(xì)胞專用培養(yǎng)基于37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2的三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞融合度至80%進(jìn)行傳代,取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)[17]。

1.3.3 HaCaT細(xì)胞UVB光損傷模型的構(gòu)建

參考KUNCHANA等[18]的方法并略有改動(dòng)。HaCaT細(xì)胞以1.5×104個(gè)/孔接種于96孔板,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h,將原有的HaCaT細(xì)胞專用培養(yǎng)基更換為無血清MEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去,用少量PBS覆蓋HaCaT細(xì)胞,進(jìn)行UVB照射,照射劑量分別為0、20、40、60、80、100 mJ/cm2,每個(gè)劑量設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。照射結(jié)束后將PBS更換為無血清MEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后每孔加入10 μL CCK-8,于37 ℃,5% CO2孵育1 h,450 nm處測(cè)定HaCaT細(xì)胞存活率,將細(xì)胞存活率為正常細(xì)胞存活率50%的UVB劑量作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)照射劑量[17]。

1.3.4 HaCaT細(xì)胞存活率的測(cè)定

1.3.4.1 枸杞籽油對(duì)HaCaT細(xì)胞存活率的影響

HaCaT細(xì)胞以1.5×104個(gè)/孔接種于96孔板,于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。將原有的HaCaT細(xì)胞專用培養(yǎng)基更換為含有質(zhì)量濃度為75、150、300、600、1 200 μg/mL枸杞籽油的無血清MEM培養(yǎng)基(0.01% Tween-80助溶)和0.01%Tween-80(溶于無血清MEM培養(yǎng)基)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)4 h,將上清更換為無血清MEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h,每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)重復(fù)。采用CCK-8法檢測(cè)HaCaT細(xì)胞存活率,方法同1.3.3節(jié)。

1.3.4.2 枸杞籽油對(duì)UVB誘導(dǎo)的光損傷HaCaT細(xì)胞存活率的影響

HaCaT細(xì)胞以1.5×104個(gè)/孔接種于96孔板,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h。對(duì)照組:HaCaT細(xì)胞既不進(jìn)行UVB照射,也不加入枸杞籽油;模型組:HaCaT細(xì)胞只進(jìn)行UVB照射,不加入枸杞籽油;枸杞籽油組:HaCaT用含有不同質(zhì)量濃度枸杞籽油(75、150、300、600 μg/mL,0.01% Tween-80助溶)的無血清MEM培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2孵育4 h。模型組和枸杞籽油組HaCaT細(xì)胞棄去上清液后加入少量PBS,以40 mJ/cm2的UVB劑量進(jìn)行照射。照射結(jié)束后,將各組HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)液更換為無血清MEM培養(yǎng)基,繼續(xù)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h,每組分別設(shè)置6個(gè)復(fù)孔[17]。CCK-8法檢測(cè)HaCaT細(xì)胞存活率,方法同1.3.3節(jié)。

1.3.5 枸杞籽油對(duì)UVB誘導(dǎo)的光損傷HaCaT細(xì)胞中ROS水平的影響

HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)、不同濃度枸杞籽油孵育及UVB處理同1.3.4.2節(jié),用2′,7′-二氯熒光素二乙酸酯(2′,7′-dichlorofuorescin diacetate,DCFH-DA)熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的ROS水平[19]。用緩沖液按1∶750(體積比)稀釋DCFH-DA,棄去無血清MEM培養(yǎng)基,用緩沖液(試劑三)洗滌3次,加入適當(dāng)體積的DCFH-DA(試劑一),于37 ℃避光孵育40 min,采用熒光酶標(biāo)儀于500 nm/525 nm處測(cè)定熒光強(qiáng)度。

1.3.6 枸杞籽油對(duì)UVB誘導(dǎo)的光損傷HaCaT細(xì)胞凋亡率的影響

HaCaT細(xì)胞以5×105個(gè)/孔接種于6孔板,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h,不同濃度枸杞籽油孵育及UVB處理同1.3.4.2節(jié)。棄去無血清MEM培養(yǎng)基,收集HaCaT細(xì)胞,按照一步法TUNEL流式凋亡檢測(cè)試劑盒說明書操作,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)HaCaT細(xì)胞凋亡情況[20]。

1.3.7 枸杞籽油對(duì)UVB誘導(dǎo)的光損傷HaCaT細(xì)胞炎癥因子含量的影響

HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)、不同濃度枸杞籽油孵育及UVB處理同1.3.4.2節(jié),按ELISA檢測(cè)試劑盒操作說明書分別測(cè)定對(duì)照組、模型組和枸杞籽油組HaCaT細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量,于450 nm處測(cè)定吸光值。

1.3.8 枸杞籽油對(duì)UVB誘導(dǎo)的光損傷HaCaT細(xì)胞凋亡和炎癥相關(guān)因子mRNA相對(duì)表達(dá)的影響

HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)同1.3.6節(jié),不同濃度枸杞籽油孵育及UVB處理同1.3.4.2節(jié)。棄去無血清MEM培養(yǎng)基,每孔加入適量PBS沖洗2～3次,棄去PBS后加入1 mL裂解液RZ裂解細(xì)胞,抽打若干次至溶液透明。按照總RNA提取試劑盒說明書提取RNA,依據(jù)cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。RT-PCR反應(yīng)檢測(cè)HaCaT細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、p53和促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表達(dá)。RT-PCR反應(yīng)體系為正向和反向引物各0.6 μL,ddH2O 6.3 μL,cDNA 2.5 μL,2×SuperReal Color Premix(SYBR Green)10 μL進(jìn)行反應(yīng),反應(yīng)條件:95 ℃ 15 min(預(yù)變性),95 ℃ 10 s(變性),60 ℃ 20 s(退火/延伸),40個(gè)循環(huán)。在擴(kuò)增程序中讀取Ct值,按照2-ΔΔCt分析法,計(jì)算各組mRNA的相對(duì)表達(dá)[21]。計(jì)算如公式(1)所示:

ΔΔCt=處理組(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)-對(duì)照組(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)

(1)

表1 qRT-PCR引物序列

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 枸杞籽油主要活性成分含量

枸杞籽油中含有大量不飽和脂肪酸,其中亞油酸和油酸含量最高,分別達(dá)到67.4%和19.2%;此外,谷甾醇和維生素E分別含有42%和27.4 mg/100 g;還含有少量的β-胡蘿卜素、玉米黃質(zhì)和葉黃素。這些活性成分可為枸杞籽油抗UVB誘導(dǎo)的皮膚光損傷提供良好的物質(zhì)基礎(chǔ),結(jié)果見表2。

表2 枸杞籽油活性成分含量

2.2 不同UVB照射劑量對(duì)HaCaT細(xì)胞存活率的影響

如圖1所示,與對(duì)照組(0 mJ/cm2)相比,不同UVB照射后HaCaT細(xì)胞存活率極顯著降低(P<0.01),且UVB照射劑量越強(qiáng),細(xì)胞存活率越低。經(jīng)40 mJ/cm2UVB照射后,細(xì)胞存活率為對(duì)照組的50%左右,因此,本實(shí)驗(yàn)采用UVB照射強(qiáng)度為40 mJ/cm2作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)照射劑量。

圖1 不同UVB照射劑量對(duì)HaCaT細(xì)胞存活率的影響

2.3 枸杞籽油對(duì)HaCaT細(xì)胞存活率的影響

2.3.1 不同濃度枸杞籽油和0.01% Tween-80對(duì)HaCaT細(xì)胞存活率的影響

由圖2可知,相比于對(duì)照組,質(zhì)量濃度為75、150、300、600、1 200 μg/mL的枸杞籽油(0.01% Tween-80助溶)和0.01% Tween-80對(duì)HaCaT細(xì)胞存活率均無明顯影響。選擇0.01% Tween-80助溶的75、150、300、600 μg/mL的枸杞籽油進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 不同濃度枸杞籽油和0.01% Tween-80對(duì)HaCaT細(xì)胞存活率的影響

2.3.2 不同濃度枸杞籽油對(duì)UVB誘導(dǎo)的光損傷HaCaT細(xì)胞存活率的影響

如圖3所示,與對(duì)照組相比,經(jīng)UVB(40 mJ/cm2)照射后,模型組HaCaT細(xì)胞存活率極顯著下降(P<0.01),為正常細(xì)胞的50%左右。與模型組相比,75 μg/mL枸杞籽油處理后的細(xì)胞存活率顯著升高(P<0.05),150、300、600 μg/mL枸杞籽油處理后的細(xì)胞存活率極顯著升高(P<0.01),且細(xì)胞存活率隨著枸杞籽油濃度的增加而升高。可見,枸杞籽油可明顯提高UVB誘導(dǎo)的光損傷HaCaT細(xì)胞存活率。

圖3 枸杞籽油對(duì)UVB誘導(dǎo)的光損傷HaCaT細(xì)胞存活率的影響

2.4 枸杞籽油對(duì)UVB誘導(dǎo)的光損傷HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

圖4顯示,與對(duì)照組相比,模型組HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS水平極顯著升高(P<0.01)。而相比模型組,經(jīng)75、150、300、600 μg/mL枸杞籽油處理后細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著降低(P<0.05)。說明枸杞籽油可明顯降低UVB誘導(dǎo)的光損傷HaCaT細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。

圖4 枸杞籽油對(duì)UVB誘導(dǎo)的光損傷HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

2.5 枸杞籽油對(duì)UVB誘導(dǎo)的光損傷HaCaT細(xì)胞凋亡率的影響

由圖5可知,模型組HaCaT細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組相比極顯著升高(P<0.01),而與模型組相比,經(jīng)75、150、300、600 μg/mL枸杞籽油處理后的細(xì)胞凋亡率極顯著降低(P<0.01)。說明40 mJ/cm2UVB照射能增加HaCaT細(xì)胞凋亡率,而枸杞籽油可有效抑制UVB誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

a-對(duì)照組;b-模型組;c-75 μg/mL;d-150 μg/mL;e-300 μg/mL;f-600 μg/mL;g-枸杞籽油對(duì)UVB誘導(dǎo)的光損傷HaCaT細(xì)胞凋亡率的影響

2.6 枸杞籽油對(duì)UVB誘導(dǎo)的光損傷HaCaT細(xì)胞中凋亡相關(guān)因子mRNA相對(duì)表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比,模型組細(xì)胞中Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平極顯著降低(P<0.01),Bax、Caspase-3、Caspase-9和p53極顯著升高(P<0.01);與模型組相比,經(jīng)枸杞籽油處理的各組細(xì)胞中Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平極顯著升高(P<0.01),Bax、Caspase-3、Caspase-9和p53 mRNA相對(duì)表達(dá)極顯著降低(P<0.01)(圖6)。該結(jié)果表明,枸杞籽油可通過增加UVB誘導(dǎo)的光損傷HaCaT細(xì)胞中抗凋亡因子Bcl-2 mRNA的表達(dá),減少促凋亡因子Bax和Caspase-3、Caspase-9、p53 mRNA的表達(dá)抑制UVB照射引起的細(xì)胞凋亡。

a-Bcl-2;b-Bax;c-Caspase-3;d-Caspase-9;e-p53

2.7 枸杞籽油對(duì)UVB誘導(dǎo)的光損傷HaCaT細(xì)胞炎癥因子的影響

圖7-a～圖7-c顯示,與對(duì)照組相比,經(jīng)UVB照射后,HaCaT細(xì)胞中TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白含量極顯著升高(P<0.01);而與模型組相比,75、150、300、600 μg/mL枸杞籽油處理后細(xì)胞中TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白含量極顯著下降(P<0.01)。圖7-d～圖7-f結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,模型組HaCaT細(xì)胞TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)極顯著升高(P<0.01);與模型組相比,枸杞籽油則極顯著降低了TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA的相對(duì)表達(dá)(P<0.01)。說明枸杞籽油能降低HaCaT細(xì)胞中炎癥因子的含量和mRNA相對(duì)表達(dá)減輕UVB引起的炎癥反應(yīng)。

a-TNF-α含量;b-IL-1β含量;c-IL-6含量;d-TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá);e-IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá);f-IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)

3 結(jié)論與討論

枸杞籽油具有不飽和脂肪酸、類胡蘿卜素、維生素E和植物甾醇等活性成分[22-23],這些活性成分可通過不同途徑緩解皮膚損傷。研究表明,油酸和亞油酸都具有良好的抗衰老作用,油酸與人體脂肪酸結(jié)構(gòu)相似,可改變皮膚角質(zhì)層脂質(zhì)結(jié)構(gòu),增加脂質(zhì)流動(dòng)性,促進(jìn)有效物質(zhì)的滲透;亞油酸則在阻止脂質(zhì)過氧化損傷方面起關(guān)鍵作用[24]。葉黃素可通過降低IL-6、TNF-α和環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)這些促炎介質(zhì)發(fā)揮對(duì)紫外線輻射的HaCaT細(xì)胞的防護(hù)作用[25]。植物甾醇也能緩解皮膚炎癥反應(yīng)并保護(hù)其免受紫外線傷害[26]。維生素E可顯著減少紫外線輻射導(dǎo)致的紅斑、水腫和皮膚過敏,并抑制紫外線輻射引起的皮膚癌的發(fā)生[27]。本研究中,枸杞籽油中的油酸和亞油酸含量最高,分別為19.2%和67.4%,葉黃素、谷甾醇、維生素E含量分別為58.5 μg/100 g、42%、27.4 mg/100 g。這些活性成分可為枸杞籽油抗UVB誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞光損傷提供一定物質(zhì)基礎(chǔ)。

UVB輻射后使細(xì)胞產(chǎn)生過量ROS,進(jìn)而誘導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),加速細(xì)胞凋亡[28]。Bcl-2基因家族在細(xì)胞凋亡調(diào)控中起關(guān)鍵作用。其中,Bcl-2與Bax功能相互拮抗,Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡,Bax加速細(xì)胞凋亡[29]。此外,過量的ROS會(huì)激活位于線粒體膜上的Bcl-2家族,使線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C氧化酶(cytochrome C oxidase,Cyto-C)釋放到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)并激活Caspase蛋白家族,啟動(dòng)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng),進(jìn)而影響特定凋亡信號(hào)分子誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生[30]。Caspase家族中Caspase-9作為凋亡始動(dòng)子起到關(guān)鍵作用,它在Cyto-C的參與下可激活Caspase-3,活化的Caspase-3可酶解凋亡抑制蛋白,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[31]。p53在細(xì)胞凋亡過程中主要通過對(duì)線粒體膜上Bcl-2家族蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,改變線粒體膜電位,最終激活Caspase-3并啟動(dòng)細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)[32]。本研究結(jié)果顯示,枸杞籽油可通過顯著降低UVB誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞凋亡率及相關(guān)因子Bax、Caspase-3、Caspase-9和p53 mRNA的表達(dá),促進(jìn)抗凋亡因子Bcl-2 mRNA的表達(dá)來抑制UVB誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞凋亡的發(fā)生,進(jìn)而發(fā)揮抗UVB光損傷作用。MUZAFFER等[33]研究發(fā)現(xiàn)胡桃可下調(diào)UVB誘導(dǎo)的光損傷HaCaT細(xì)胞中Bax、Caspase-3、Caspase-9和p53 mRNA的表達(dá),上調(diào)Bcl-2 mRNA的表達(dá),該研究結(jié)果與本研究一致。

角質(zhì)細(xì)胞占據(jù)人皮膚表皮細(xì)胞的90%,具有分泌細(xì)胞因子的功能[34]。UVB作用于HaCaT細(xì)胞,導(dǎo)致多種炎癥因子如TNF-α、IL-1β和IL-6的產(chǎn)生[35]。機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí),TNF-α是出現(xiàn)最早的起關(guān)鍵作用的炎癥因子,它能促進(jìn)其他炎癥細(xì)胞因子的合成和釋放;IL-1β是具有免疫調(diào)節(jié)和執(zhí)行宿主防御功能的炎癥因子;IL-6具有與IL-1β相似的生物學(xué)效應(yīng)[36]。本研究證實(shí)了枸杞籽油可顯著降低UVB誘導(dǎo)的光損傷HaCaT細(xì)胞中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA的表達(dá)和蛋白含量。蘇牧楠等[37]研究發(fā)現(xiàn)納豆提取物可明顯降低UVB照射后HaCaT細(xì)胞中TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白含量,張艷晴[38]發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛超濾組分可抑制UVB誘導(dǎo)的光損傷HaCaT細(xì)胞中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)。本研究結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道相似。

綜上所述,枸杞籽油可通過調(diào)控細(xì)胞凋亡和減輕炎癥反應(yīng)緩解UVB誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞光損傷。主要通過提高HaCaT細(xì)胞存活率,抑制ROS過量生成,降低HaCaT細(xì)胞凋亡率,促進(jìn)抗凋亡因子Bcl-2、降低促凋亡因子Bax和Caspase-3、Caspase-9、p53 mRNA的表達(dá),減少炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白含量和mRNA的表達(dá),而枸杞籽油所含的不飽和脂肪酸、類胡蘿卜素、谷甾醇和維生素E為其抗UVB所致的光損傷提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。這為枸杞籽油的進(jìn)一步開發(fā)利用提供新的思路,為天然植物油脂抗光損傷提供了一定的科學(xué)理論依據(jù)。