魚(yú)肉中硝基呋喃類(lèi)藥物殘留的測(cè)定能力驗(yàn)證結(jié)果與分析

朱雨田,黎燕玲,李瑩瑩,鄭燕燕,何麗香,李錦才

(深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院 國(guó)家營(yíng)養(yǎng)食品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)中心(廣東),深圳 518131)

硝基呋喃類(lèi)藥物因具有良好的抑菌殺菌作用而廣泛用于水產(chǎn)及畜禽等動(dòng)物疾病的防治[1-3]。呋喃唑酮作為最典型的一種硝基呋喃類(lèi)抗生素,其在動(dòng)物體內(nèi)代謝消除快,生物半衰期短,但其代謝產(chǎn)物3-氨基-2-唑烷酮(AOZ)具有很強(qiáng)的蛋白結(jié)合性[4],可長(zhǎng)時(shí)間殘存在動(dòng)物內(nèi)臟及肌肉等組織中,且AOZ有很強(qiáng)的毒副作用,長(zhǎng)期攝入AOZ超標(biāo)的食品可能會(huì)對(duì)人體胃腸道、肝臟等器官造成一定損傷[5-8]。出于安全性考慮,世界上大部分國(guó)家均嚴(yán)禁使用該類(lèi)藥物。早在2002年我國(guó)就已將硝基呋喃類(lèi)藥物列為禁用藥物,并不得在動(dòng)物性食品中檢出,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部250號(hào)公告也再次將呋喃唑酮列入食品動(dòng)物禁用化合物名錄[9]。但是,由于該類(lèi)藥物藥效好、價(jià)格低廉,一些養(yǎng)殖戶(hù)依然違規(guī)使用。近幾年,水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中違規(guī)使用硝基呋喃類(lèi)藥物問(wèn)題頻頻爆出,根據(jù)2021年1月農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管司發(fā)布的《2020年食用農(nóng)產(chǎn)品市場(chǎng)監(jiān)管部門(mén)抽檢不合格情況》簡(jiǎn)報(bào)顯示[10],水產(chǎn)品中硝基呋喃類(lèi)代謝物檢出情況較為突出,其中不合格AOZ就有40批次。此外,根據(jù)各級(jí)地方政府監(jiān)管抽檢通報(bào)信息顯示[11-15],畜禽水產(chǎn)品中AOZ檢出問(wèn)題也頻頻發(fā)生,其中水產(chǎn)品中AOZ不合格情況尤為明顯。AOZ測(cè)定是檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)開(kāi)展食品中獸藥殘留分析所必備的能力之一,從事該項(xiàng)目檢測(cè)的機(jī)構(gòu)數(shù)量龐大,且近5年總局未組織過(guò)該類(lèi)項(xiàng)目的國(guó)家級(jí)檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)能力驗(yàn)證。因此,為了了解和評(píng)價(jià)參加實(shí)驗(yàn)室在水產(chǎn)品中藥物殘留方面的檢測(cè)能力和水平,識(shí)別實(shí)驗(yàn)室間存在的差異,受?chē)?guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局委托,本單位負(fù)責(zé)承擔(dān)2022年國(guó)家級(jí)檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)能力驗(yàn)證計(jì)劃《魚(yú)肉中硝基呋喃類(lèi)藥物殘留的測(cè)定》(計(jì)劃編號(hào):CNCA-22-04)的具體實(shí)施工作,該項(xiàng)目的實(shí)施完成將助力相關(guān)監(jiān)管部門(mén)強(qiáng)化對(duì)食品及食用農(nóng)產(chǎn)品承檢機(jī)構(gòu)的考核評(píng)價(jià),也可進(jìn)一步驅(qū)動(dòng)和提升參加實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)能力,對(duì)規(guī)范實(shí)驗(yàn)室的管理水平具有重要意義。

1 試驗(yàn)方法

1.1 儀器與試劑

AB 5500+型液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀;Pilot7-12E型真空冷凍干燥機(jī);QUINTIX313-1CN型電子天平;IKA MS3型漩渦混合器;Milli-Q型純水機(jī);3K15型離心機(jī);Turbo Vap LV型氮吹儀。

AOZ標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度為99.14%;AOZ-d4同位素內(nèi)標(biāo)的純度為99.7%;甲醇、乙酸銨、2-硝基苯甲醛、乙腈為色譜純;乙酸乙酯為分析純;試驗(yàn)用水符合GB/T 6682—2008一級(jí)水指標(biāo)。

1.2 樣品設(shè)計(jì)及制備

本次能力驗(yàn)證共設(shè)計(jì)3個(gè)濃度水平(I、II、III組)的魚(yú)肉凍干粉,3組樣品中AOZ濃度水平均不同。每組濃度水平制備500份左右,共制備1 405份樣品,包括均勻性檢驗(yàn)、穩(wěn)定性檢驗(yàn)、測(cè)試用樣品等。樣品選用草魚(yú)魚(yú)肉為基質(zhì),市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)活魚(yú)后進(jìn)行宰殺,取肌肉組織(去皮、剔除骨刺),斬拌成魚(yú)糜,根據(jù)預(yù)設(shè)各組樣品的AOZ濃度水平和魚(yú)糜質(zhì)量,分別向各組魚(yú)糜中加入3,4,7.5 mL的5 mg·L-1的AOZ標(biāo)準(zhǔn)溶液,充分?jǐn)嚢杈鶆?采用真空冷凍干燥工藝進(jìn)行制備,凍干后粉碎、過(guò)篩、混勻,制成凍干粉,采用7 mL西林瓶密封包裝,再放入鋁箔袋真空密封包裝,并粘貼帶有唯一性隨機(jī)編號(hào)的標(biāo)簽,制備成符合要求的能力驗(yàn)證樣品,每瓶2 g左右。制備完成的魚(yú)肉凍干粉樣品按質(zhì)量比1…4加水復(fù)原后等同于新鮮的魚(yú)肉糜樣品,最小取樣量為0.4 g。3組樣品分別于不同日期進(jìn)行分裝并加貼標(biāo)簽,以免混淆,于-18 ℃冷凍儲(chǔ)存。

1.3 樣品均勻性檢驗(yàn)

采用隨機(jī)方式從3組樣品最小包裝單元各抽取10份,按照農(nóng)業(yè)部783號(hào)公告-1—2006《水產(chǎn)品中硝基呋喃類(lèi)代謝物殘留量的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》[16](以下簡(jiǎn)稱(chēng)“農(nóng)業(yè)部783號(hào)公告-1—2006”)測(cè)定,運(yùn)用單因子方差分析,F檢驗(yàn)判斷各組樣品的均勻情況。待參加者回報(bào)結(jié)果后,再利用0.3σ(σ表示能力評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)差)準(zhǔn)則再次評(píng)價(jià)樣品均勻性。

1.4 樣品穩(wěn)定性檢驗(yàn)

本次能力驗(yàn)證項(xiàng)目穩(wěn)定性檢測(cè)方法也采用農(nóng)業(yè)部783號(hào)公告-1—2006。將樣品儲(chǔ)存在40℃環(huán)境條件下7 d,模擬樣品的運(yùn)輸穩(wěn)定性。分別在樣品制備完成后、發(fā)樣前、回收結(jié)果后進(jìn)行儲(chǔ)存穩(wěn)定性檢驗(yàn)。按照CNAS-GL003:2018 《能力驗(yàn)證樣品均勻性和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)指南》要求,采用t檢驗(yàn)法及0.3σ準(zhǔn)則進(jìn)行評(píng)定。

1.5 樣品發(fā)放

向每家參加實(shí)驗(yàn)室隨機(jī)發(fā)放兩份不同的考核樣品,記錄樣品信息,同時(shí)隨樣品一同發(fā)放相關(guān)資料,再放入冰袋進(jìn)行包裝,并加貼快遞面單。

1.6 推薦檢測(cè)方法

本項(xiàng)目可選用GB/T 20752—2006《豬肉、牛肉、雞肉、豬肝和水產(chǎn)品中硝基呋喃類(lèi)代謝物殘留量的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》、GB/T 21311—2007《動(dòng)物源性食品中硝基呋喃類(lèi)藥物代謝物殘留量檢測(cè)方法 高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法》、GB 31656.13—2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 水產(chǎn)品中硝基呋喃類(lèi)代謝物多殘留的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》、農(nóng)業(yè)部781號(hào)公告-4—2006《動(dòng)物源食品中硝基呋喃類(lèi)代謝物殘留量的測(cè)定 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》及農(nóng)業(yè)部783號(hào)公告-1—2006等國(guó)家及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

1.7 不確定度計(jì)算

本項(xiàng)目以穩(wěn)健平均值為指定值,根據(jù)GB/T 28043—2019《利用實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)進(jìn)行能力驗(yàn)證的統(tǒng)計(jì)方法》第7.7.3條要求,指定值不確定度(ux)可以按下式估計(jì)獲得。

式中:s*表示穩(wěn)健標(biāo)準(zhǔn)差;p表示結(jié)果數(shù)。

1.8 結(jié)果統(tǒng)計(jì)方法

結(jié)果回收匯總后,依據(jù)原始記錄和結(jié)果上報(bào)表,剔除小數(shù)點(diǎn)錯(cuò)誤、單位錯(cuò)誤、計(jì)算錯(cuò)誤等存在粗大誤差的結(jié)果。采用穩(wěn)健統(tǒng)計(jì)技術(shù)算法A對(duì)參加者結(jié)果進(jìn)行處理,穩(wěn)健平均值用作指定值,穩(wěn)健標(biāo)準(zhǔn)差用作能力評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)差。該計(jì)劃統(tǒng)計(jì)量包括結(jié)果提交數(shù)量、穩(wěn)健平均值、穩(wěn)健標(biāo)準(zhǔn)差、不確定度、變異系數(shù)。該項(xiàng)目選擇z值作為各參加者的能力評(píng)定統(tǒng)計(jì)量,當(dāng)兩個(gè)樣品的AOZ項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果均符合|z|<3,則判定為滿(mǎn)意實(shí)驗(yàn)室,當(dāng)兩個(gè)樣品的任一AOZ項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果|z|≥3,則判定為不滿(mǎn)意實(shí)驗(yàn)室。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品均勻性和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

本次能力驗(yàn)證所制備的3組不同濃度水平的樣品均勻性F值分別為1.89,1.66,1.43,均小于臨界值[F0.05(9,10)=3.02];穩(wěn)定性檢驗(yàn)t值為0.755～1.33,均小于臨界值[t0.05(30)=2.042];均勻性平均值與各穩(wěn)定性平均值的絕對(duì)差值小于0.3σ;回收結(jié)果后,樣品間不均勻性標(biāo)準(zhǔn)差Ss分別為0.182,0.127,0.067 1,均小于0.3σ。以上結(jié)果表明樣品的均勻性和穩(wěn)定性完全滿(mǎn)足本次能力驗(yàn)證的要求。

2.2 能力驗(yàn)證結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.2.1 參加實(shí)驗(yàn)室概況

該項(xiàng)目共收到339家實(shí)驗(yàn)室報(bào)名,最終327家參與,12家因故未能參加。參加者地域及行業(yè)覆蓋范圍廣,全國(guó)除港澳臺(tái)外的31個(gè)省(直轄市、自治區(qū))均有實(shí)驗(yàn)室報(bào)名參加,實(shí)驗(yàn)室類(lèi)型包括海關(guān)、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部、市場(chǎng)監(jiān)督管理、疾病控制等系統(tǒng)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室及科研院所、第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)等。參加者具體地域和行業(yè)分布見(jiàn)表1和表2。

表1 實(shí)驗(yàn)室地域分布

表2 實(shí)驗(yàn)室的行業(yè)分布及占比

2.2.2 能力驗(yàn)證結(jié)果統(tǒng)計(jì)量

該項(xiàng)目統(tǒng)計(jì)量具體見(jiàn)表3,由表3可知,指定值不確定度均小于0.3s*,說(shuō)明該項(xiàng)目的不確定度可忽略。根據(jù)3組參加者結(jié)果繪制頻率分布直方圖,見(jiàn)圖1。由圖1可知,該項(xiàng)目參加者結(jié)果服從近似正態(tài)分布,說(shuō)明該項(xiàng)目可以采用穩(wěn)健統(tǒng)計(jì)技術(shù)算法A分析。

圖1 實(shí)驗(yàn)室結(jié)果頻率直方圖

表3 AOZ能力驗(yàn)證統(tǒng)計(jì)量

2.2.3 參加者結(jié)果評(píng)價(jià)

從總體分析結(jié)果看,滿(mǎn)意實(shí)驗(yàn)室為297家,占總參加數(shù)量的90.8%;不滿(mǎn)意實(shí)驗(yàn)室為30家,占總參加數(shù)量的9.2%。按不滿(mǎn)意實(shí)驗(yàn)室類(lèi)型分析,海關(guān)系統(tǒng)檢測(cè)機(jī)構(gòu)不滿(mǎn)意情況較為突出,占所有不滿(mǎn)意實(shí)驗(yàn)室總數(shù)的53%。各組樣品評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 3組樣品評(píng)價(jià)結(jié)果匯總

由表4可知:按樣品分組情況分析,本次能力驗(yàn)證共收到654個(gè)測(cè)試結(jié)果;第Ⅰ組滿(mǎn)意的結(jié)果數(shù)209個(gè),占該組結(jié)果總數(shù)的95.4%;第Ⅱ組滿(mǎn)意的結(jié)果數(shù)195個(gè),占該組結(jié)果總數(shù)的89.9%;第Ⅲ組滿(mǎn)意的結(jié)果數(shù)200個(gè),占該組結(jié)果總數(shù)的91.7%。

2.3 技術(shù)分析

2.3.1 檢測(cè)方法匯總與分析

參加本次能力驗(yàn)證計(jì)劃的機(jī)構(gòu)共計(jì)采用了6種檢測(cè)方法,109家采用GB/T 21311—2007、94家采用GB 31656.13—2021、94家采用農(nóng)業(yè)部783號(hào)公告-1—2006、15家采用GB/T 20752—2006、14家采用農(nóng)業(yè)部781號(hào)公告-4—2006、1家采用《2019年國(guó)家食品污染物和有害因素風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)工作手冊(cè)》對(duì)測(cè)試樣品中的呋喃唑酮代謝物(AOZ)進(jìn)行測(cè)定。在方法等效性方面,6種方法均為液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,原理基本一致,樣品經(jīng)過(guò)鹽酸水解、鄰硝基苯甲醛衍生后,調(diào)節(jié)酸度,提取液利用乙酸乙酯液液萃取或采用固相萃取柱等方式凈化,各檢測(cè)方法的檢出限/測(cè)定下限完全滿(mǎn)足此次計(jì)劃要求,通過(guò)對(duì)6種方法技術(shù)參數(shù)的詳細(xì)比對(duì)[見(jiàn)表5,其中實(shí)驗(yàn)室157#采用了序號(hào)6的檢測(cè)方法,實(shí)際稱(chēng)樣量為2.00 g(折算干粉為0.40 g)滿(mǎn)足該能力驗(yàn)證計(jì)劃最小稱(chēng)樣量的要求,其采用的凈化方式為乙酸乙酯液液萃取],表明6種方法技術(shù)是等效一致的。此外,為了驗(yàn)證方法之間的差異性,項(xiàng)目組還在方案設(shè)計(jì)之初,分別采用推薦的5種檢測(cè)方法對(duì)預(yù)試驗(yàn)制備的樣品各自獨(dú)立測(cè)定10次,采用兩兩配對(duì)獨(dú)立t檢驗(yàn)方式進(jìn)行分析,t值均小于臨界值t0.05(18)(2.101),結(jié)果表明本項(xiàng)目推薦的方法之間無(wú)顯著性差異。本項(xiàng)目只有1家機(jī)構(gòu)使用了推薦方法以外的檢測(cè)方法,經(jīng)過(guò)對(duì)該方法及參加者提交的原始記錄等材料的審核和比較,該參加者使用的方法與推薦方法基本一致。綜上,說(shuō)明本項(xiàng)目中參加者選擇不同的檢測(cè)方法并不會(huì)影響對(duì)結(jié)果的判斷。

2.3.2 檢測(cè)過(guò)程質(zhì)量控制

檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度的影響因素有很多方面,主要涉及人-檢測(cè)員、機(jī)-關(guān)鍵設(shè)備、料-試劑耗材、法-檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)、環(huán)-試驗(yàn)環(huán)境、測(cè)-檢測(cè)環(huán)節(jié)等。基于該項(xiàng)目開(kāi)展情況及參加者提交資料分析,檢測(cè)機(jī)構(gòu)在測(cè)定AOZ過(guò)程中應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注以下幾點(diǎn)。

(1) 前處理操作方面:目標(biāo)物上機(jī)前需要經(jīng)過(guò)水解衍生、提取凈化等步驟,檢測(cè)員應(yīng)嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)及參試指導(dǎo)書(shū)要求進(jìn)行。AOZ檢測(cè)的前處理過(guò)程中,按標(biāo)準(zhǔn)要求調(diào)節(jié)酸度是關(guān)鍵步驟,未控制好提取液的酸度會(huì)嚴(yán)重影響AOZ的提取效率。同時(shí),衍生過(guò)程要控制好溫度,避光,衍生時(shí)間要滿(mǎn)足標(biāo)準(zhǔn)要求。

(2) 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)方面:AOZ的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)多為固體形式,在配制標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)應(yīng)根據(jù)證書(shū)上提供的純度進(jìn)行折算。采用經(jīng)過(guò)檢定合格的天平、移液管、容量瓶等器具進(jìn)行配制。配制后,儲(chǔ)存條件要符合標(biāo)準(zhǔn)要求。1家實(shí)驗(yàn)室偏離標(biāo)準(zhǔn)要求,直接使用了AOZ的衍生物作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)樣品中AOZ含量進(jìn)行檢測(cè),導(dǎo)致報(bào)送錯(cuò)誤結(jié)果。

(3) 儀器參數(shù)設(shè)定方面:該項(xiàng)目測(cè)定均為液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,色譜條件和質(zhì)譜條件都會(huì)影響到結(jié)果準(zhǔn)確度。從參加者提供譜圖記錄可以看出,個(gè)別實(shí)驗(yàn)室結(jié)果峰形拖尾,積分不準(zhǔn)確,影響結(jié)果的準(zhǔn)確定量。質(zhì)譜參數(shù)的設(shè)置也會(huì)直接影響結(jié)果準(zhǔn)確度,質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集點(diǎn)設(shè)置不合理,且積分未做平滑處理時(shí),峰形差,峰面積積分可能會(huì)存在誤差,也會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度。

(4) 檢測(cè)方法使用方面:部分實(shí)驗(yàn)室偏離方法要求,且未采用相應(yīng)的質(zhì)控方式對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。個(gè)別實(shí)驗(yàn)室選用GB 31656.13—2021、GB/T 21311—2007等檢測(cè)方法,但未按方法要求采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量,偏離方法要求,這可能是導(dǎo)致最終測(cè)試結(jié)果偏離較大的主要原因。

3 結(jié)論

作為2022年國(guó)家級(jí)檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)食品領(lǐng)域能力驗(yàn)證計(jì)劃之一,該項(xiàng)目對(duì)我國(guó)327家檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室魚(yú)肉中AOZ殘留量測(cè)定的能力進(jìn)行了驗(yàn)證比對(duì)分析,從統(tǒng)計(jì)分析情況看,總體滿(mǎn)意率達(dá)90.8%,說(shuō)明我國(guó)食品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室在水產(chǎn)品中藥物殘留檢測(cè)方面具備較高的水平。本項(xiàng)目實(shí)施過(guò)程中,也發(fā)現(xiàn)個(gè)別檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室在人員能力、設(shè)備維護(hù)、記錄合規(guī)性、標(biāo)準(zhǔn)理解等方面的水平有待進(jìn)一步提高,建議不滿(mǎn)意的實(shí)驗(yàn)室和結(jié)果評(píng)價(jià)偏差在臨界值附近的實(shí)驗(yàn)室利用本次能力驗(yàn)證分析結(jié)果,依據(jù)檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)要求,聯(lián)系機(jī)構(gòu)自身情況,仔細(xì)查找分析可能存在的問(wèn)題,并按質(zhì)量管理體系要求進(jìn)行整改,持續(xù)強(qiáng)化對(duì)實(shí)驗(yàn)室人員檢測(cè)技能的監(jiān)督和評(píng)價(jià)。