谷胱甘肽生產(chǎn)及在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用

■ 李 敏 殷述亭 遲曉丹

（威海海洋職業(yè)學(xué)院，山東威海 264300）

谷胱甘肽是一種由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的一種含有巰基的三肽，是細胞中合成的最重要的低分子量抗氧化劑。在自然界中的存在形式有兩種，分別是還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）和氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG）。通常所說的谷胱甘肽指的是GSH[1]。GSH 具有巰基和γ-谷氨酰胺健，這使GSH 具有很多生理功能，比如清除自由基、增強免疫能力及螯合解毒等[2]。

隨著高密度養(yǎng)殖的不斷發(fā)展，水產(chǎn)疾病日益嚴重，并且國家對食品安全越來越重視。安全、高效的飼料添加劑成為解決水產(chǎn)養(yǎng)殖動物健康問題、提升水產(chǎn)動物產(chǎn)量和質(zhì)量的關(guān)鍵。近年來，谷胱甘肽在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域的應(yīng)用研究廣泛，成為飼料添加劑開發(fā)的熱點。文章總結(jié)了國內(nèi)外谷胱甘肽的生產(chǎn)及在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面應(yīng)用的最新研究進展，旨在通過闡明谷胱甘肽對水產(chǎn)動物不同方面的應(yīng)用原理及效果，為谷胱甘肽在水產(chǎn)動物中的應(yīng)用提供新的科學(xué)思路。

1 谷胱甘肽的來源及代謝

1.1 谷胱甘肽的來源

機體內(nèi)谷胱甘肽主要來自合成和還原兩條途徑。GSH 的合成主要是在肝臟細胞內(nèi)，以谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸為底物，在γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-glutamylcysteine synthetase，GSHI 或γGCS）和谷胱甘肽合成酶（glutathione synthetase，GSHII 或者GS）的催化下經(jīng)兩步酶促反應(yīng)合成的[3]；GSH 的還原途徑主要是細胞內(nèi)GSSG 經(jīng)谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）還原成GSH[4]。

此外，GSSG 可以在巰基轉(zhuǎn)移酶的作用下生成GSH，也可以與抗壞血酸發(fā)生反應(yīng)生成GSH；當GSH耗竭或不足時，哺乳動物可以利用蛋氨酸生成GSH[5]。

1.2 谷胱甘肽的代謝

谷胱甘肽可以被小腸完整吸收并運輸[6]，經(jīng)過血液進入胰腺、肝臟等部位進行代謝，完成清除自由基、解毒及營養(yǎng)運輸?shù)裙δ躘7]，腎臟能夠從血液中攝取GSH，是清除血漿中GSH 的重要場所。機體衰老、中毒、感染以及氧化應(yīng)激等不良狀況都會導(dǎo)致細胞內(nèi)GSH的合成能力降低，進一步造成機體內(nèi)GSH含量下降，外源補充GSH可以緩解或終止相關(guān)問題。

2 谷胱甘肽的生產(chǎn)方法

2.1 直接萃取法

直接萃取法主要是利用有機溶劑以富含谷胱甘肽的動植物組織（如玉米胚芽或小麥胚芽）為原料，經(jīng)淀粉酶、蛋白酶等處理后，經(jīng)過分離、濃縮、干燥等步驟獲得谷胱甘肽[8]。但是直接萃取法存在著純度低、得率低等問題，不適合工業(yè)化生產(chǎn)與應(yīng)用。

2.2 化學(xué)合成法

化學(xué)合成法生產(chǎn)谷胱甘肽始于20 世紀70 年代，以谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸為原料，經(jīng)過基團保護、縮合及脫保護等階段，合成谷胱甘肽[9]。該方法較早應(yīng)用于谷胱甘肽生產(chǎn)，但是也存在較多問題，如操作復(fù)雜、成本高昂、耗時長、環(huán)保問題較嚴重等。

2.3 酶法

酶法合成谷胱甘肽參照谷胱甘肽在機體內(nèi)的合成過程，以L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸為底物，添加從天然生物體內(nèi)獲得γGCS 和GS 兩種谷胱甘肽合成酶，經(jīng)過兩個合成酶分步完成合成，這兩步反應(yīng)都需要添加三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）提供能量[10]。因此，雖然酶法合成谷胱甘肽效率較高，但是容易受到酶活性、ATP價格等因素的影響。

2.4 微生物發(fā)酵法

與萃取法、化學(xué)合成法和酶法相比，生物發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽，具有生產(chǎn)速率快、反應(yīng)條件溫和、成本低、污染少等優(yōu)點，如今已成為生產(chǎn)谷胱甘肽的主要方法，具有極大的發(fā)展?jié)摿?。生產(chǎn)谷胱甘肽的菌種可分為兩種，一種是常規(guī)誘變育種選育得到的高產(chǎn)菌株，如：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）及熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）等[11-13]；第二種則是基因工程菌，利用基因重組技術(shù)將合成谷胱甘肽的基因?qū)肓硪环N微生物中進行谷胱甘肽的生產(chǎn)，如今多是以釀酒酵母菌或大腸桿菌(Escherichia coli)為載體的基因工程菌[14-15]。除菌種外，影響微生物發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽的因素還有微生物發(fā)酵調(diào)控技術(shù)和谷胱甘肽提純技術(shù)，微生物發(fā)酵調(diào)控技術(shù)的研究包括培養(yǎng)基的優(yōu)化、培養(yǎng)條件優(yōu)化及發(fā)酵過程控制等；谷胱甘肽提純技術(shù)包括溶劑提取法，熱水抽提法及高壓均質(zhì)法等[16]。如今微生物發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽的技術(shù)已經(jīng)相對成熟，能夠進行大規(guī)模的工廠化生產(chǎn)，并有極大的發(fā)展空間。

3 谷胱甘肽在水產(chǎn)動物中的應(yīng)用

3.1 谷胱甘肽在水產(chǎn)動物生長性能方面的應(yīng)用

在中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）[17]、青魚（Mylopharyngodon piceusRichardson）[18]、南美白對蝦（Litopenaeus vannamei）[19]等水產(chǎn)動物中的研究表明，谷胱甘肽具有促進生長的作用。谷胱甘肽對水產(chǎn)動物生長的促進作用可能是多方面的。首先，飼料中添加谷胱甘肽對水產(chǎn)動物的內(nèi)分泌具有積極影響，能夠上調(diào)類胰島素生長因子I 和生長激素基因的表達，從而促進生長激素、甲狀腺激素等的分泌，從而進一步促進水產(chǎn)動物的生長。Ming等[20]的試驗表明，在飼料中添加407.45 mg/kg GSH，可以促進草魚（Ctenopharyngodon idella）肝臟中類胰島素生長因子I的表達，提高草魚的增重率。其次，谷胱甘肽中含有的半胱氨酸是輔酶a的組成成分之一，能夠破壞生長抑制激素分子的二硫鍵，緩解生長抑制激素對生長激素的抑制作用從而促進生長[21]。Xiao 等[22]向草魚腹膜注射半胱胺鹽酸鹽（CSH）發(fā)現(xiàn)，CSH能夠顯著提高血清生長激素水平，從而促進幼草魚短期生長。此外，GSH 還可以通過增強營養(yǎng)物質(zhì)的吸收來促進水產(chǎn)動物生長。馮具攀等[23]的研究表明飼料中添加0.30 g/kg 的GSH 能夠降低克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）的飼料系數(shù)，同時增加其體重。在虹鱒（Oncorhynchus mykiss）中的研究表明，飼料中添加200 mg/kg 的GSH 可以增加其攝食量、增重率和特定生長率[24]。Wang等[19]的研究表明，飼料中添加75～150 mg/kg GSH 能夠增加南美白對蝦（Litopenaeus vannamei）的腸壁厚度和特定生長率。飼料中添加320 mg/kg 的GSH 能夠顯著提高吉富羅非魚（GIFTOreochromis niloticus）的蛋白質(zhì)效率，從而促進生長[25]。

3.2 谷胱甘肽在水產(chǎn)動物抗氧化應(yīng)激方面的應(yīng)用

隨著集約化養(yǎng)殖的不斷發(fā)展，引起水產(chǎn)動物出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)的因素也越來越多。應(yīng)激反應(yīng)會引起其機體內(nèi)氧自由基含量增加，破壞機體內(nèi)氧化與抗氧化平衡，因此形成氧化應(yīng)激[26-27]。氧化應(yīng)激會降低水產(chǎn)動物的免疫力、引起組織損傷、減緩生長等負面影響，最終降低水產(chǎn)品產(chǎn)量與品質(zhì)。

谷胱甘肽作為一種內(nèi)源性的抗氧化物質(zhì)，在機體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)中具有重要作用。首先，谷胱甘肽是機體內(nèi)含量最多的非蛋白質(zhì)巰基化合物，GSH 的巰基能夠?qū)⒁粋€還原電子直接提供給自由基將其還原為無毒物質(zhì)，然后自身與另一個活性谷胱甘肽反應(yīng)形成GSSG，達到減少自由基的作用，使機體內(nèi)維持自由基代謝平衡[28]。此外，由于機體內(nèi)的GSH 和GSSG 之間可以相互轉(zhuǎn)換，從而可以作為氧化還原緩沖物以保持細胞氧化還原狀態(tài)的平衡[29]。飼料中添加GSH 可增加水產(chǎn)動物體內(nèi)GSH的積累，從而降低機體內(nèi)氧化應(yīng)激水平，提高抗氧化酶活力，增強機體抗氧化能力。在大菱鲆（Scophthalmus maximus）、中華絨螯蟹、青魚、南美白對蝦、花鱸（Lateolabrax japonicus）等水產(chǎn)動物中的研究表明，飼料中添加適量的GSH能夠提高機體內(nèi)的抗氧化活性，增強其抗氧化能力[5，17-18，30-31]。但是過量的谷胱甘肽則會對水產(chǎn)動物的抗氧化能力產(chǎn)生負面影響，這可能是由于高濃度的谷胱甘肽會造成DNA損傷，導(dǎo)致其具有促氧化作用[32-33]。

3.3 谷胱甘肽在水產(chǎn)動物免疫性能方面的應(yīng)用

在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，養(yǎng)殖密度過高、飼料氧化酸敗以及水環(huán)境惡化等問題導(dǎo)致水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的免疫性能不斷下降，發(fā)病率大幅上升[34]。GSH 可以從多個方面提高水產(chǎn)動物的免疫性能，首先，動物機體內(nèi)的免疫力下降往往與氧化應(yīng)激相關(guān)，GSH 作為體內(nèi)重要的抗氧化物質(zhì)，可以直接參與多余自由基的清除，從而達到抑制氧化應(yīng)激，提高免疫性能的作用[35]。

其次，GSH 通過調(diào)節(jié)動物體內(nèi)的活性因子來增強機體的免疫功能。周艷玲等[36]的研究表明，飼料中添加357.69 mg/kg GSH 能夠提高黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）幼魚體內(nèi)溶菌酶（lysozyme，LZM）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）及酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）的活性，增加免疫球蛋白M 和補體4 的含量。在中華絨螯蟹的研究中表明，飼料中添加600 mg/kg 或900 mg/kg 的GSH 能夠提高其體內(nèi)的溶菌酶等免疫酶活性，降低Toll樣受體1（Toll like receptor 1，TLR1）、Toll樣受體2（Toll like receptor 2，TLR2）及髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，Myd88）等免疫因子基因的表達，提高中華絨螯蟹的免疫性能[17]。Xue 等[21]研究表明，飼料中添加500 mg/kg的谷胱甘肽可以通過調(diào)節(jié)白細胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）、白細胞介素-6 （Interleukin-6，IL-6）及腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等炎癥相關(guān)基因的表達，減輕氨脅迫引起的鰓和肝組織炎癥，增強鯉魚（Cyprinus carpio）的免疫力。

第三，谷胱甘肽具有增強免疫細胞活力、促進免疫細胞增殖的作用。在奧尼羅非魚（Oreochromis niloticus×O.aureus）中的試驗表明，外源性添加適量的GSH 能夠增加奧尼羅非魚幼魚頭腎巨噬細胞的呼吸爆發(fā)活力，從而參與免疫調(diào)節(jié)[37]。趙紅霞等[38]的研究表明，草魚血液中的白細胞數(shù)目會隨飼料中GSH的含量增加而增加，從而增強草魚的非特異性免疫功能，增強其抗病能力。

3.4 谷胱甘肽在水產(chǎn)動物解毒能力方面的應(yīng)用

GSH 的解毒機制包括兩個方面：一方面，GSH 作為重要的抗氧化劑，能夠清除機體內(nèi)多余的自由基，此外，GSH 還可以通過一些酶抑制脂質(zhì)的過氧化作用，從而降低有害物質(zhì)通過氧化應(yīng)激導(dǎo)致的不良后果，減弱其毒性。周艷玲等[39]在黃顙魚幼魚中的研究表明，飼料中添加357.69 mg/kg GSH 能夠提高其抗氧化能力，增加對氨氮的抗應(yīng)激能力。在草魚中的研究表明，飼料中添加407.45 mg/kg GSH 能夠提高機體內(nèi)的抗氧化酶活性，增強機體的抗氧化能力，降低微囊藻毒素對機體的傷害，但過量GSH 也有負作用[20]。在尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）中的研究表明，GSH 可以緩解脂質(zhì)過氧化，改善肝臟功能，緩解黃曲霉素中毒[40]。

另一方面，GSH 可以與多種有毒物質(zhì)及其代謝物發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，形成無毒的加合物，然后從動物體內(nèi)排出。在黃顙魚中的研究表明，谷胱甘肽能夠與微囊藻毒素結(jié)合形成親水性更強的產(chǎn)物，因而更容易被排出體外[41]。任圣杰等[42]研究認為，谷胱甘肽可以與辛硫磷形成中間產(chǎn)物，從而降低異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）肝臟中的辛硫磷殘留值。在尼羅羅非魚中的試驗表明，飼料中添加一定濃度的鉛會引起肝胰腺中的GSH含量產(chǎn)生適應(yīng)性上升，隨著鉛含量的增加GSH含量又減少，其變化可能是由于GSH能夠快速與金屬離子形成絡(luò)合物，然后這些絡(luò)合物會聚集在一起，被迅速排出體外，從而達到快速解毒的效果[43-44]。

4 小結(jié)與展望

GSH 的生產(chǎn)方式多樣，其中化學(xué)法、酶法和生物發(fā)酵法目前都已經(jīng)實現(xiàn)了工業(yè)化應(yīng)用，為GSH在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。GSH 無論是在水產(chǎn)動物健康養(yǎng)殖方面，還是在提高水產(chǎn)品質(zhì)量方面都具有巨大潛力。國內(nèi)外研究人員對于GSH 在水產(chǎn)動物養(yǎng)殖方面的應(yīng)用進行了深入研究，特別是在水產(chǎn)動物飼料中的應(yīng)用。但是由于谷胱甘肽存在易溶于水、pH 偏低的特性限制了谷胱甘肽的開發(fā)利用。因此，在未來的研究中，可以加強對谷胱甘肽飼料加工工藝的優(yōu)化，并繼續(xù)探索GSH 與其他營養(yǎng)物質(zhì)的配合使用，進而實現(xiàn)GSH的高效利用。