PTBP3對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖與遷移的影響及機(jī)制研究

呂瑩 郝明碩 錢陽(yáng) 王蕊 相龍全

1濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，濟(jì)寧 272067；2濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院病理科，濟(jì)寧 272002

食管癌是全球最常見(jiàn)惡性腫瘤，尤其在亞洲一些地區(qū)，其發(fā)病率和病死率均居高不下。食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）占食管癌的90%，隨著手術(shù)、放療、化療等多種治療手段的發(fā)展，5年生存率不足20%［1-2］。ESCC早期癥狀不明顯，疾病進(jìn)展迅速，大多數(shù)患者在診斷時(shí)已進(jìn)入晚期，治療效果差。多嘧啶束結(jié)合蛋白3（PTBP3）屬于RNA結(jié)合蛋白PTB家族，與多種腫瘤發(fā)生過(guò)程密切相關(guān)，包括RNA的剪接、穩(wěn)定和轉(zhuǎn)運(yùn)等。既往研究發(fā)現(xiàn)，PTBP3在肺癌、胰腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌中蛋白水平升高［3-4］。本研究探討PTBP3在ESCC中的表達(dá)情況及其作用機(jī)制，為ESCC的診斷及治療提供新思路和方法。

材料與方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

本研究使用的人ESCC細(xì)胞株有ECA109（北納生物）、KYSE150（諾普賽生物）、KYSE30（上海中喬新舟生物科技有限公司）。細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清（FBS，Gibco Australia）的RPMI 1640培養(yǎng)基（Gibco Australia）中，在37 ℃的5% CO2加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染小干擾siRNA時(shí)，將細(xì)胞接種于6孔板中，24 h后細(xì)胞密度40%～60%時(shí)用riboFECTTMCP轉(zhuǎn)染試劑（Ribobio）轉(zhuǎn)染miRNA mimic（Ribobio）。

2.組織樣本

收集2021年1月至2023年5月濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院的6例ESCC標(biāo)本及其癌旁正常組織標(biāo)本。所有患者均經(jīng)病理診斷，手術(shù)切除前均未接受化療或放療。ESCC組織標(biāo)本均通過(guò)組織病理學(xué)檢查確定腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。本研究符合《赫爾辛基宣言》要求，所有患者均簽署知情同意書。

3.慢病毒感染

感染前24 h將細(xì)胞接種于6孔板，按照感染倍數(shù)加入PTBP3 shRNA的慢病毒。轉(zhuǎn)染72 h后用2 mg/L嘌呤霉素處理，選擇穩(wěn)定的細(xì)胞系。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）檢測(cè)PTBP3的轉(zhuǎn)染效率。

4.Western blotting

細(xì)胞在含有1%磷酸酶和蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液中裂解，并用BCA Protein Assay Kit（Beyotime）測(cè)定蛋白濃度。使用10% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，并將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。將膜置于5%脫脂牛奶中，在旋轉(zhuǎn)搖床上放置1 h，阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)，然后與一抗特異性抗體在4 ℃下孵育過(guò)夜。用1× TBST緩沖液洗滌3次（10 min/次）后，加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h。再次洗滌后，使用電化學(xué)發(fā)光（ECL）檢測(cè)試劑（Beyotime）進(jìn)行免疫印跡分析。

5.qRT-PCR

用TRIZOL（Invitrogen，USA）提取RNA，用SupersmartTM6 min耐熱首鏈cDNA合成試劑盒（中實(shí)基因科技有限公司）合成cDNA。采用Ribo mRNA qRT-PCR Starter Kit試劑盒（Ribobio）進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。U6、miR29a-3p、miR29b-3p及miR29c-3p引物購(gòu)自銳博生物，使用miDETECT A TrackTMmiRNA qRT-PCR Starter Kit試劑盒（Ribobio）進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，其余用于RT-PCR分析引物如下：GAPDH Forward Primer：GAACGGGAAGCTCACTGG；GAPDH Reverse Primer：GCCTGCTTCACCACCTTCT；PTBP3 Forward Primer：TGTCCCACCAACTATTCATCCA；PTBP3 Reverse Primer：CTCTGGAACATATGCCTCAGGT。

6.細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）

CCK-8（Dojindo，日本）檢測(cè)細(xì)胞增殖。將慢病毒感染24 h的腫瘤細(xì)胞以每孔1 000個(gè)細(xì)胞密度接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，體積為100 μl，在正常條件下培養(yǎng)24 h，然后每孔加入10 μl CCK-8試劑，2 h后，使用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)量吸光度值。每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

7.細(xì)胞劃痕試驗(yàn)

將細(xì)胞接種到6孔板上，孵育24 h后，用100 μl無(wú)菌吸管尖劃傷融合細(xì)胞單層，加入無(wú)血清培養(yǎng)基。0 h、24 h和48 h倒置顯微鏡測(cè)量劃痕間隙距離，顯微鏡拍攝圖片經(jīng)Image J軟件計(jì)算細(xì)胞遷移距離。

8.生信數(shù)據(jù)分析

使用UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//ualcan.path.uab.edu/）、癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)分析食管癌組織及正常食管組織PTBP3的表達(dá)差異及PTBP3與miR29家族的關(guān)系。

9.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)采用配對(duì)t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.ESCC組織中PTBP3基因表達(dá)水平

利用TCGA數(shù)據(jù)研究ESCC組織和正常食管組織PTBP3的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，ESCC組織中PTBP3基因的表達(dá)量高于正常食管組織（P＜0.001），且與食管腺癌及正常食管組織相比，ESCC組織中的PTBP3表達(dá)水平較高（P＜0.05）。PTBP3表達(dá)水平和臨床分期、病理分化程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度關(guān)系不明顯（圖1A～D）。正常食管鱗狀上皮組織以及ESCC組織中PTBP3蛋白和mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果表明，與正常食管鱗狀上皮組織相比，PTBP3在ESCC組織中高表達(dá)，與TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中數(shù)據(jù)一致（圖1E～G）。

圖1 PTBP3在ESCC組織中高表達(dá)。A為TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中PTBP3在食管癌與正常食管組織中的表達(dá)差異，B為TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中PTBP3基因表達(dá)與臨床分期的關(guān)系，C為TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中PTBP3基因表達(dá)與腫瘤分化程度的關(guān)系，D為TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與PTBP3基因表達(dá)關(guān)系，E為qRT-PCR檢測(cè)ESCC和食管鱗狀上皮組織中PTBP3 mRNA的表達(dá)情況，F(xiàn)、G為Western blotting檢測(cè)ESCC和食管鱗狀上皮組織中的PTBP3蛋白表達(dá)水平

2.PTBP3敲低抑制ESCC細(xì)胞株遷移和增殖

慢病毒感染構(gòu)建PTBP3穩(wěn)定敲低的ESCC細(xì)胞，qRT-PCR和Western blotting結(jié)果顯示，ECA109細(xì)胞、KYSE150細(xì)胞、KYSE30細(xì)胞中PTBP3 mRNA和蛋白水平降低（圖2A～C）。CCK-8試驗(yàn)結(jié)果顯示，敲低PTBP3能抑制ECA109細(xì)胞、KYSE150細(xì)胞及KYSE30細(xì)胞增殖能力（圖2D）。細(xì)胞劃痕試驗(yàn)結(jié)果顯示，PTBP3敲低能抑制ESCC細(xì)胞遷移能力（圖2E～F）。

圖2 感染PTBP3敲低病毒能降低ESCC細(xì)胞活力和遷移能力。A、B為Western blotting檢測(cè)細(xì)胞中PTBP3蛋白表達(dá)情況，C為qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中PTBP3 mRNA表達(dá)情況，D為CCK-8試驗(yàn)檢測(cè)ESCC細(xì)胞活力，E、F為細(xì)胞劃痕試驗(yàn)檢測(cè)ESCC細(xì)胞的遷移能力

3.PTBP3敲低可降低ESCC細(xì)胞miR-29a-3p與miR-29c-3p的表達(dá)水平

PTBP3在miRNA前體轉(zhuǎn)錄過(guò)程中發(fā)揮作用。通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)篩選PTBP3潛在的下游靶點(diǎn)分子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在食管癌組織中，PTBP3基因表達(dá)與hsa-miR29-3p的表達(dá)相關(guān)。qRT-PCR結(jié)果表明，與對(duì)照病毒組相比，3種ESCC細(xì)胞（KYSE30、ECA109、KYSE150）的PTBP3敲低組中miR-29a-3p與miR-29c-3p表達(dá)水平下調(diào)（t=29.007、7.057、4.844、12.625、15.612、18.861，均P＜0.05），而miR-29b-3p的表達(dá)在KYSE30、ECA109細(xì)胞中差別較大（圖3A～C）。

圖3 PTBP3敲低可降低ESCC細(xì)胞中miR-29a-3p與miR-29c-3p的表達(dá)量。A～C為qRT-PCR檢測(cè)ESCC細(xì)胞中miR-29家族表達(dá)情況

4.ESCC組織中miR-29與PTBP3的表達(dá)水平

qRT-PCR結(jié)果表明，與正常食管鱗狀上皮組織相比，miR-29家族在ESCC組織中高表達(dá)（圖4A～C）。ESCC組織中miR-29a-3p、miR-29b-3p、miR-29c-3p相對(duì)表達(dá)量與PTBP3相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明，ESCC組織中miR-29a-3p和miR-29c-3p表達(dá)量與PTBP3表達(dá)量相關(guān)。

圖4 ESCC組織中miR-29家族表達(dá)升高，且與PTBP3表達(dá)相關(guān)。A～C為qRT-PCR檢測(cè)ESCC組織中miR-29家族表達(dá)情況，D～F為ESCC組織中miR-29家族與PTBP3表達(dá)情況相關(guān)性

討論

PTBP家族成員主要參與RNA剪接，可以在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核之間穿梭，優(yōu)先結(jié)合富含多嘧啶的RNA片段［5］。PTBP1和PTBP2的相關(guān)研究較多，而PTBP3的相關(guān)功能近年來(lái)才引起學(xué)者們的關(guān)注［6-8］。Yamamoto等［7］文獻(xiàn)表明，PTBP3能夠作為調(diào)節(jié)蛋白參與細(xì)胞分化。也有文獻(xiàn)證實(shí)，PTBP3與多種惡性腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)，并且可能具有組織特異性，在肺癌、乳腺癌、胃癌中PTBP3蛋白水平升高，而膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中PTBP3表達(dá)水平低于周圍正常組織［3，8-10］。PTBP3通過(guò)選擇性剪接參與胃癌轉(zhuǎn)移、分化和遷移，抑制PTBP3可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期阻滯，增強(qiáng)5-氟尿嘧啶對(duì)胃癌細(xì)胞的毒性［11-12］。另外，PTBP3能夠通過(guò)調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)因子-1α翻譯激活，維持UBE4A mRNA穩(wěn)定性，從而調(diào)控P53表達(dá)，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖與遷移［4，13］。本研究證實(shí)PTBP3在ESCC患者中高表達(dá)，PTBP3表達(dá)可抑制ESCC細(xì)胞增殖和遷移。

Treiber等［14］研究提示，PTBP3對(duì)miR-29家族成員進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，促進(jìn)pre-miRNA剪接在miRNA成熟過(guò)程中發(fā)揮作用。miR-29家族由miR-29a、miR-29b和miR-29c組成，它們?cè)诨蛐蛄泻蜕飳W(xué)功能上有很高的保守性。miR-29家族已被證明在多種癌癥中起著重要作用，主要通過(guò)與靶基因3'非編碼區(qū)域結(jié)合，抑制靶基因表達(dá)，發(fā)揮抑癌或促癌作用，如磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號(hào)通路中的重要蛋白位點(diǎn)［15］。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)miR-29被沉默時(shí)，食管癌細(xì)胞增殖能力降低，細(xì)胞周期被阻斷在G1期，與食管癌進(jìn)展和預(yù)后相關(guān)［16-17］。在miR-29家族中，miR-29-3p是主要發(fā)揮功能的片段，因此，選擇miR-29-3p作為主要研究對(duì)象［18-19］。本研究結(jié)果表明，PTBP3敲低之后，ESCC細(xì)胞中miR-29a-3p與miR-29c-3p表達(dá)降低。miR-29b-3p的表達(dá)具有個(gè)體差異性，在KYSE30細(xì)胞中表達(dá)升高，ECA109 細(xì)胞中表達(dá)降低，KYSE150細(xì)胞中差異不明顯，深層次的表達(dá)差異機(jī)制需要我們更進(jìn)一步探索。此外，在ESCC組織中，我們發(fā)現(xiàn)PTBP3表達(dá)與miR-29家族成員表達(dá)均呈正相關(guān)性。因此，我們猜測(cè)PTBP3可以參與pre-miR-29家族成員的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，促進(jìn)成熟miR-29形成，而其中的具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

本研究初步探討PTBP3在ESCC細(xì)胞中的表達(dá)水平以及PTBP3在ESCC細(xì)胞增殖和遷移方面的功能作用，并且證明PTBP3可通過(guò)與前體miRNA結(jié)合調(diào)控miR-29家族表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)ESCC細(xì)胞活性和遷移。PTBP3是ESCC的一個(gè)重要分子標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn)，可為ESCC早期診斷和治療提供新思路和方法。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明呂瑩：實(shí)施研究，采集、分析/解釋數(shù)據(jù)，起草文章，對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱，統(tǒng)計(jì)分析；郝明碩：醞釀和設(shè)計(jì)試驗(yàn)，實(shí)施研究，起草文章，指導(dǎo)，支持性貢獻(xiàn)；錢陽(yáng)：實(shí)施研究，采集、分析/解釋數(shù)據(jù)，起草文章，統(tǒng)計(jì)分析；王蕊：實(shí)施研究，采集數(shù)據(jù)，起草文章，統(tǒng)計(jì)分析；相龍全：醞釀和設(shè)計(jì)試驗(yàn)，實(shí)施研究，對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱，行政、技術(shù)或材料支持，指導(dǎo)，支持性貢獻(xiàn)