基于高通量實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)探究銅對(duì)豬糞厭氧發(fā)酵產(chǎn)物中抗生素抗性基因的分布特征影響*

龔陳盼 張然然,2# 莊海峰 周柳媛

(1.浙江科技學(xué)院浙江省廢棄生物質(zhì)循環(huán)利用與生態(tài)處理技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 杭州 310023;2.西北工業(yè)大學(xué)生態(tài)環(huán)境學(xué)院,陜西 西安 710129)

隨著養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模的不斷擴(kuò)大,為了增強(qiáng)畜禽免疫力,提高養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益,抗生素和重金屬被廣泛作為飼料添加劑,這些添加劑濫用導(dǎo)致重金屬和抗生素含量遠(yuǎn)超生物生長(zhǎng)所需,動(dòng)物腸胃中抗生素和重金屬無(wú)法被完全吸收,過(guò)量的抗生素在動(dòng)物腸道中會(huì)誘導(dǎo)出抗性微生物,最終通過(guò)排泄物排出體外,造成畜禽糞便中抗生素殘留,誘導(dǎo)出抗生素抗性基因(ARGs),因此畜禽糞便成為了ARGs的重要儲(chǔ)存庫(kù)[1]。ZHU等[2]研究發(fā)現(xiàn)豬糞中ARGs種類(lèi)多樣,共檢測(cè)出149種ARGs亞型。ARGs傳播擴(kuò)散會(huì)誘導(dǎo)環(huán)境介質(zhì)中微生物獲得抗性,進(jìn)而出現(xiàn)“超級(jí)細(xì)菌”嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康,臨床衛(wèi)生安全也將面臨巨大的挑戰(zhàn)[3-4]。

厭氧發(fā)酵是糞肥資源化利用的主要處理方式[5],糞污通過(guò)發(fā)酵可以生產(chǎn)沼氣等清潔能源,產(chǎn)物中的沼渣、沼液也是優(yōu)質(zhì)有機(jī)原料,可改良土壤。然而有研究發(fā)現(xiàn)厭氧發(fā)酵處理后的發(fā)酵產(chǎn)物中存在部分ARGs富集現(xiàn)象[6]。例如SUN等[7]研究發(fā)現(xiàn)牛糞厭氧發(fā)酵過(guò)程中氟喹諾酮抗性基因具有較高的持久性和富集動(dòng)態(tài)。LU等[8]研究發(fā)現(xiàn)牛糞厭氧發(fā)酵后的沼渣沼液中多數(shù)ARGs豐度均要高于牛糞,且沼渣貯藏1個(gè)月后,磺胺類(lèi)抗性基因富集程度顯著升高。發(fā)酵產(chǎn)物的沼渣沼液施用于農(nóng)田會(huì)增加ARGs輸入食物鏈的風(fēng)險(xiǎn),進(jìn)而影響農(nóng)作物生長(zhǎng)和農(nóng)產(chǎn)品安全[9]。

重金屬銅作為主要的飼料添加劑廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖場(chǎng),研究發(fā)現(xiàn)豬糞中有大量的銅殘留[10-11],可達(dá)286.7～1 905.0 mg/kg[12]。與抗生素相比,重金屬污染對(duì)ARGs的影響更為深遠(yuǎn),因?yàn)橹亟饘僭诃h(huán)境介質(zhì)中不易降解,同時(shí)還會(huì)對(duì)ARGs施加選擇性壓力,使得微生物對(duì)重金屬也產(chǎn)生抗性,進(jìn)而誘導(dǎo)出重金屬抗性基因[13],在提高環(huán)境中ARGs多樣性的同時(shí)也加劇了多重ARGs的傳播風(fēng)險(xiǎn)。楊統(tǒng)一等[14]研究發(fā)現(xiàn)施用糞肥后的土壤重金屬含量顯著增加,尤其是銅、鋅,其含量與多種ARGs豐度呈顯著正相關(guān),說(shuō)明重金屬的賦存可能參與了ARGs共選擇。SUN等[15]研究發(fā)現(xiàn)受到抗生素和重金屬?gòu)?fù)合污染的糞肥中,sul1和sul2豐度顯著升高,但其研究使用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)技術(shù)測(cè)得的ARGs數(shù)量較為單一,僅是測(cè)定了兩種四環(huán)素類(lèi)抗性基因和兩種磺胺類(lèi)抗性基因。在厭氧發(fā)酵體系下,關(guān)于重金屬銅對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中多種ARGs的分布特征研究較少,張然然[16]研究發(fā)現(xiàn)鋅、銅都顯著提高了豬糞厭氧發(fā)酵過(guò)程及產(chǎn)物中ARGs和可移動(dòng)基因元件(MGEs)豐度,但僅測(cè)定了15種ARGs和4種MGEs,不能全面解釋各類(lèi)ARGs的分布特征。現(xiàn)實(shí)污染環(huán)境條件多樣且復(fù)雜,以往多數(shù)研究采用傳統(tǒng)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù),側(cè)重于對(duì)有限種類(lèi)的ARGs的定性與定量,但對(duì)各類(lèi)ARGs的分布特征缺乏系統(tǒng)性解讀。

為了管控有機(jī)肥施用導(dǎo)致ARGs在土壤生態(tài)系統(tǒng)中的擴(kuò)散傳播,考慮到重金屬賦存可能會(huì)提高ARGs的傳播擴(kuò)散風(fēng)險(xiǎn),更全面更系統(tǒng)地探討受銅污染的發(fā)酵產(chǎn)物中ARGs多樣性及分布特征顯得尤為重要。本研究模擬了兩種水平銅污染(75、227 mg/L)對(duì)豬糞厭氧發(fā)酵產(chǎn)物中ARGs和MGEs分布特征的影響,采用高通量實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(HT-qPCR)技術(shù),共使用354組引物檢測(cè)296個(gè)ARGs、57個(gè)MGEs,定量分析發(fā)酵產(chǎn)物中ARGs的豐度變化及各類(lèi)ARGs之間的相關(guān)性特征。本研究為評(píng)價(jià)銅在誘導(dǎo)微生物抗生素抗性中的作用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù),對(duì)防控糞肥施用于農(nóng)田的風(fēng)險(xiǎn)提供了理論評(píng)估依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及實(shí)驗(yàn)設(shè)置

本研究使用的豬糞來(lái)自西北農(nóng)林科技大學(xué)的一個(gè)中型農(nóng)場(chǎng)。豬糞pH為7.87,總固體質(zhì)量分?jǐn)?shù)為41%,含碳量為398.29 g/kg,含氮量為26.57 g/kg。小麥秸稈pH為5.37,總固體質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%,含氮量為6.77 g/kg,含碳量為493.63 g/kg。將豬糞和小麥秸稈按一定比例混合后調(diào)節(jié)C/N(質(zhì)量比)為20∶1,用去離子水使厭氧發(fā)酵體系的最初總固體質(zhì)量分?jǐn)?shù)維持在8%。厭氧發(fā)酵裝置參考文獻(xiàn)[17]、[18],實(shí)驗(yàn)每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)所用的CuCl2純度為99.0%,ACS級(jí)。參考文獻(xiàn)[19]的操作(設(shè)置豬糞中銅平均質(zhì)量濃度為500 mg/kg(基于豬糞干質(zhì)量,下同),最大質(zhì)量濃度為1 500 mg/kg),本研究在厭氧發(fā)酵體系中共設(shè)置了1個(gè)對(duì)照組(CK,不添加銅)和兩個(gè)銅處理組(CuL中含銅75 mg/L,CuH中含銅227 mg/L)。厭氧發(fā)酵體系混合均勻后立即采集CK的3個(gè)平行作為0 d樣品。所有3種處理在52 d后收集100 mL樣品于棕色瓶中用于后續(xù)分析。

1.2 脫氧核糖核酸(DNA)提取和HT-qPCR

DNA的提取:冷干樣品利用FastDNA SPIN Kit for Soils試劑盒(MP Biomedicals)由 100 mg樣品中提取總基因組DNA,用低共熔溶劑(DES)洗脫總DNA。采用1.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))凝膠電泳和酶板儀(Biotek Elx808)檢測(cè)分析DNA提取物的質(zhì)量和濃度。HT-qPCR采用廣東某科技有限公司的SmartChip實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)進(jìn)行?？偣彩褂?54組引物檢測(cè)296個(gè)ARGs、34個(gè)轉(zhuǎn)座子、11個(gè)質(zhì)粒、9個(gè)插入序列、3個(gè)整合子。所有HT-qPCR均進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。

2 結(jié) 果

2.1 ARGs和MGEs數(shù)量的變化

3組不同處理下ARGs和MGEs數(shù)量如圖1所示,總共檢測(cè)到152個(gè)ARGs,涵蓋11個(gè)主要類(lèi)別(包括氨基糖苷類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、多藥類(lèi)、磺胺類(lèi)等抗性基因)和33個(gè)MGEs(16個(gè)轉(zhuǎn)座子、7個(gè)插入序列、7個(gè)質(zhì)粒和3個(gè)整合子)。

注:相對(duì)豐度由絕對(duì)豐度除以16S rDNA總量計(jì)算得出,圖2和圖3同。

CK、CuL和CuH中分別檢測(cè)到118、152和138個(gè)ARGs。銅處理組檢測(cè)到的ARGs數(shù)量多于CK。產(chǎn)物中檢測(cè)出多藥類(lèi)和氨基糖苷類(lèi)抗性基因最為豐富,均占所有處理中檢測(cè)到的ARGs數(shù)量總和的20%以上,其次是大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)和四環(huán)素類(lèi)抗性基因。CK、CuL和CuH中分別檢測(cè)到28、35和31個(gè)MGEs,大多數(shù)MGEs在3組處理中均被檢測(cè)出。

2.2 ARGs和MGEs相對(duì)豐度的分布特征

CuH中ARGs總相對(duì)豐度高于CuL和CK。與CK相比,CuL和CuH中ARGs總相對(duì)豐度分別提高了86%和91%。氨基糖苷類(lèi)抗性基因相對(duì)豐度最高,其次就是四環(huán)素類(lèi)抗性基因。CuH中四環(huán)素類(lèi)抗性基因相對(duì)豐度分別是CK和CuL的3.6、1.5倍。多藥類(lèi)和磺胺類(lèi)抗性基因在銅處理組中的相對(duì)豐度占比明顯高于CK。在銅處理組中的MGEs相對(duì)豐度顯著(P<0.05,下同)高于CK,其中部分轉(zhuǎn)座子(如IS6100、IS613)和整合子(如intI1)的相對(duì)豐度在CuL中高于CuH?？傮w來(lái)看,受到銅污染的發(fā)酵體系中所檢測(cè)出的ARGs和MGEs相對(duì)豐度要顯著高于CK,且同一基因?qū)Σ煌瑵舛茹~的響應(yīng)不同,以下分別對(duì)各大類(lèi)別的ARGs和MGEs進(jìn)行分布特征分析,結(jié)果見(jiàn)圖2與圖3。

圖2 3組處理下的ARGs相對(duì)豐度的變化

圖3 3組處理下的MGEs相對(duì)豐度的變化

2.2.1 氨基糖苷類(lèi)抗性基因

銅處理組下的氨基糖苷類(lèi)抗性基因相對(duì)豐度要顯著高于CK,一些氨基糖苷類(lèi)抗性基因的相對(duì)豐度在CuH中較高,尤其是aadA99、aadA17和aadA21,除此之外的大部分氨基糖苷類(lèi)抗性基因相對(duì)豐度普遍表現(xiàn)為CuL高于CuH。

2.2.2 四環(huán)素類(lèi)抗性基因

在四環(huán)素類(lèi)抗性基因中,CuH中tetM的相對(duì)豐度最高,分別是CK和CuL的4.1、1.3倍。CuH中tet(44)、tetA(P)和tetG的相對(duì)豐度高于CK和CuL。在四環(huán)素類(lèi)抗性基因中,只有tet(32)相對(duì)豐度表現(xiàn)為CuL高于CuH和CK。

2.2.3 多藥類(lèi)抗性基因

與CK相比,多藥類(lèi)抗性基因的相對(duì)豐度在銅處理組中均得到富集。CuL和CuH的qacH351相對(duì)豐度分別是CK的14.0、12.6倍。CuH的mefB相對(duì)豐度分別是CuL和CK的2.4、7.0倍。

2.2.4 β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗性基因

對(duì)于β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗性基因,其在CuL的相對(duì)豐度均高于CuH和CK,且ant(6)-Ia和aph(3”)-ia相對(duì)豐度在銅處理組中較高。

2.2.5 大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)與磺胺類(lèi)抗性基因

大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗性基因ermF在所有處理中相對(duì)豐度均最高,表現(xiàn)為CuL>CuH>CK。大多數(shù)抗性基因在CuL中的相對(duì)豐度高于CuH和CK。此外,erm(36)和mphA、vatE、ermG僅在銅處理組中檢測(cè)到?；前奉?lèi)抗性基因sul1在CuL中的相對(duì)豐度高于CK和CuH,總體來(lái)看,磺胺類(lèi)抗性基因在銅處理組中得到了富集。

2.2.6 MGEs

CuH和CuL中intI1和intI2相對(duì)豐度高于CK。CuH和CuL中部分質(zhì)粒的相對(duì)豐度高于CK,尤其是CuH的pBS228-IncP-1α相對(duì)豐度分別是CuL和CK的2.0、5.0倍。此外,大部分插入序列的相對(duì)豐度在銅處理組中保持較高相對(duì)豐度,但TN5只在CK中被檢測(cè)出。大多數(shù)轉(zhuǎn)座子在CuH和CuL中的相對(duì)豐度均高于CK。

2.3 相關(guān)性分析結(jié)果

對(duì)厭氧發(fā)酵產(chǎn)物中ARGs與MGEs相對(duì)豐度進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析,繪制相關(guān)性氣泡圖(見(jiàn)圖4),氨基糖苷類(lèi)、磺胺類(lèi)、β-內(nèi)酰胺類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、多藥類(lèi)、氯霉素類(lèi)、甲氧芐氨嘧啶類(lèi)抗性基因之間的相對(duì)豐度都呈顯著正相關(guān)。

注:圖中氨基糖苷類(lèi)抗性基因簡(jiǎn)寫(xiě)為氨基糖苷類(lèi),其余以此類(lèi)推。

對(duì)比厭氧發(fā)酵產(chǎn)物中ARGs與MGEs相對(duì)豐度的相關(guān)性可以得出,氨基糖苷類(lèi)、磺胺類(lèi)、β-內(nèi)酰胺類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、多藥類(lèi)、氯霉素類(lèi)、甲氧芐啶類(lèi)抗性基因總和與MGEs呈極顯著(P<0.01)正相關(guān),四環(huán)素類(lèi)抗性基因與MGEs呈顯著正相關(guān)。

3 討 論

從ARGs數(shù)量水平上來(lái)看,發(fā)酵產(chǎn)物中ARGs種類(lèi)非常豐富,其中檢測(cè)到多藥類(lèi)抗性基因數(shù)量最多,其次為氨基糖苷類(lèi);但在相對(duì)豐度水平上,氨基糖苷類(lèi)抗性基因的相對(duì)豐度最高,約占ARGs總相對(duì)豐度60%以上,其次是四環(huán)素類(lèi)、多藥類(lèi)和磺胺類(lèi)抗性基因。氨基糖苷類(lèi)抗性基因的高相對(duì)豐度特征主要?dú)w因于氨基糖苷類(lèi)是較為廣泛和高使用率的抗生素[20-21],可能在發(fā)酵過(guò)程中存在較高的持久性。QIAO等[22]發(fā)現(xiàn)四環(huán)素類(lèi)、磺胺類(lèi)抗生素在畜禽糞便中檢出率較高,這與本研究測(cè)得的結(jié)果相佐。

在本研究中,受到銅污染的發(fā)酵體系檢測(cè)的ARGs相對(duì)豐度都高于CK,說(shuō)明銅通過(guò)協(xié)同和交叉選擇增加了ARGs豐度[23]。通過(guò)對(duì)各類(lèi)ARGs分布特征的描述,也可以發(fā)現(xiàn)不同ARGs對(duì)不同濃度的銅也表現(xiàn)出了多樣的響應(yīng)特征,其中多數(shù)的氨基糖苷類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)和β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗性基因相對(duì)豐度在CuL中較高;而四環(huán)素類(lèi)抗性基因在CuH中保持較高相對(duì)豐度。此外,同一ARGs對(duì)不同濃度的銅的響應(yīng)也不同,例如CuH中tetM、tet(44)相對(duì)豐度高于CuL,而銅處理組中tetB(p)、tetT相對(duì)豐度卻要低于CK。經(jīng)過(guò)Pearson相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)多數(shù)ARGs之間也存在顯著相關(guān)性,值得關(guān)注的是糖肽類(lèi)抗性基因與檢測(cè)到的其他ARGs相關(guān)性均較弱。萬(wàn)古霉素作為臨床醫(yī)學(xué)中用于治療細(xì)菌感染的重要抗生素,被譽(yù)為人類(lèi)的最后一道防線[24],它也是糖肽類(lèi)抗生素的一種。銅處理沒(méi)有顯著提高萬(wàn)古霉素抗性基因相對(duì)豐度?？傮w來(lái)說(shuō),銅能影響發(fā)酵體系中的ARGs分布特征,且有增加體系中大多數(shù)ARGs污染水平的趨勢(shì)。

在銅處理下的MGEs總相對(duì)豐度要顯著高于CK,其中轉(zhuǎn)座子和部分整合子(intI1和intI2)相對(duì)豐度在銅處理組中顯著增加,WU等[25]在豬糞和秸稈混合好氧堆肥研究中也發(fā)現(xiàn)整合子intI1和轉(zhuǎn)座子IS6100持續(xù)以高豐度存在。整合子是水平基因轉(zhuǎn)移的重要指標(biāo)之一,對(duì)ARGs的轉(zhuǎn)移有重要影響[26]。本研究中發(fā)現(xiàn)銅污染后的發(fā)酵產(chǎn)物中intI1相對(duì)豐度顯著增高,且通過(guò)對(duì)厭氧發(fā)酵產(chǎn)物中的ARGs和MGEs進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)了多數(shù)ARGs與MGEs之間存在著顯著相關(guān)性,這與課題組先前的研究結(jié)果[27]一致。與CK相比,CuL和CuH中MGEs的相對(duì)豐度更高。這些結(jié)果也表明,受到銅污染的發(fā)酵體系提高了ARGs基因水平轉(zhuǎn)移的能力,可能會(huì)加劇環(huán)境中ARGs的傳播風(fēng)險(xiǎn)。因此施用有機(jī)肥后農(nóng)田土壤ARGs傳播的風(fēng)險(xiǎn)不容忽視,同時(shí)也應(yīng)該關(guān)注MGEs豐度及其對(duì)ARGs轉(zhuǎn)移和傳播的影響機(jī)制。

課題組先前的研究發(fā)現(xiàn)在受到銅污染豬糞的厭氧發(fā)酵體系中,添加氧化石墨烯可顯著降低ARGs和MGEs豐度[28]。針對(duì)復(fù)雜的發(fā)酵體系,添加有效的基質(zhì)和添加劑對(duì)ARGs的響應(yīng)還有待進(jìn)一步研究。因此應(yīng)該控制飼料添加劑中重金屬含量,嚴(yán)格控制動(dòng)物糞便中重金屬含量,以減少ARGs的傳播風(fēng)險(xiǎn)。

4 結(jié) 論

未受到銅污染的豬糞經(jīng)過(guò)厭氧發(fā)酵后仍檢測(cè)到豐富的ARGs。多藥類(lèi)抗性基因數(shù)量最多,其次為氨基糖苷類(lèi)抗性基因,并且受到銅污染的發(fā)酵產(chǎn)物中新增了多種ARGs。然而在相對(duì)豐度水平上,氨基糖苷類(lèi)ARGs的相對(duì)豐度最高,其次是四環(huán)素類(lèi)、多藥類(lèi)和磺胺類(lèi)抗性基因。相較于CK,在受到銅污染的厭氧發(fā)酵產(chǎn)物中ARGs和MGEs豐度均顯著增加,不同ARGs對(duì)銅的響應(yīng)不同,同一種ARGs對(duì)不同濃度水平的銅脅迫反應(yīng)也不同。銅會(huì)提升基因水平轉(zhuǎn)移的趨勢(shì),也促進(jìn)ARGs和MGEs的共選擇。ARGs與MGEs多呈顯著正相關(guān)性,MGEs對(duì)ARGs傳播擴(kuò)散的促進(jìn)水平可能在銅的選擇壓力下被放大了。