平足蛋白（PDPN）在肝星狀細(xì)胞活化以及肝纖維化中的作用分析

王知意， 楊廣越， 張瑋， 浦婭瓊， 趙鑫， 馬文婷，， 劉旭凌，， 吳柳，， 陶樂，， 劉成

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院 a.肝病實(shí)驗(yàn)室， b.中心實(shí)驗(yàn)室， c.感染科， 上海 200062

肝纖維化是由多種病因引起的慢性、進(jìn)行性、彌漫性肝病，其主要病理特征是肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)過度增生與異常沉積所導(dǎo)致的肝臟結(jié)構(gòu)和/或功能異常改變，持續(xù)進(jìn)展可形成肝硬化，引起門靜脈高壓等并發(fā)癥［1］。肝星狀細(xì)胞（HSC）是肝纖維化發(fā)生的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，抑制HSC活化是抗肝纖維化的重要步驟［2］，然而抑制HSC活化的藥物仍難走向臨床［3］，提示需要從新的角度探索HSC活化機(jī)制。

平足蛋白（podoplanin，PDPN）是一種特異于淋巴系統(tǒng)的黏蛋白型跨膜糖蛋白，在多種腫瘤中均有表達(dá)，被認(rèn)為是腫瘤的標(biāo)志物［4］。研究［5］發(fā)現(xiàn)，PDPN可能通過基質(zhì)金屬蛋白酶控制甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞侵襲與遷移。然而PDPN在肝纖維化中的表達(dá)及功能罕見報(bào)道。本研究以PDPN在肝纖維化中的表達(dá)為切入點(diǎn)，探究PDPN對(duì)HSC活化的作用，為肝纖維化治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本 選取2019年9月—2022年6月首次就診于本院感染科的慢性乙型肝炎患者75例，收集患者性別、年齡等基本信息，記錄患者生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果，入院后患者簽署肝穿刺知情同意書，病理分期由本院病理科鑒定報(bào)告。

1.2 動(dòng)物及造模 12只雄性C57BL/6小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量（20±2）g，購(gòu)自上海斯貝福公司［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0010］，飼養(yǎng)于本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（滬）2019-0020］，飼養(yǎng)室溫度（22±1）℃，相對(duì)濕度30%～60%，12 h光照/12 h黑暗，自由進(jìn)食和飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為正常組和模型組，每組各6只。模型組小鼠腹腔注射10% CCl4，0.04 mL/只，每周3次；正常組小鼠注射等體積橄欖油。6周后，各組小鼠禁食不禁水12 h，麻醉小鼠，下腔靜脈采血，取出肝組織固定于10%福爾馬林進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 試劑與儀器 PDPN蛋白購(gòu)自R&D公司，貨號(hào)3670-PL；Trizol購(gòu)自Takara，貨號(hào)9190；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Takara，貨號(hào)RR037A；SYBR購(gòu)自Takara，貨號(hào)RR420；PDPN抗體購(gòu)自Abcam公司，貨號(hào)ab128994和ab11936；BAY11-7082購(gòu)自碧云天，貨號(hào)S1523；CCl4購(gòu)自上海凌峰公司，貨號(hào)051025；免疫組化二抗（貨號(hào)BA-1000）及ABC-HRP（貨號(hào)6100）試劑均購(gòu)自Vector；DAB購(gòu)自中杉金橋，貨號(hào)ZLI-9018；天狼星紅染液由上海中醫(yī)藥大學(xué)劉平教授課題組饋贈(zèng)；鏈酶蛋白酶購(gòu)自Roche，貨號(hào)9036-06-0；Ⅳ型膠原酶購(gòu)自Sigma-Aldrich，貨號(hào)V900893；透明質(zhì)酸酶購(gòu)自Sangon Biotech，貨號(hào)I621BC0413；DNase購(gòu)自Sigma-Aldrich，貨號(hào)SLBF7798V；Nycodenz購(gòu)自Alere Technologies AS，貨號(hào)1002424；Percoll購(gòu)自上海羿圣生物，貨號(hào)40501ES60。FBS購(gòu)自Gibco，貨號(hào)10270-106；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自ABI，型號(hào)VIIA 7 DX；多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自Thermo Varioskan，型號(hào)LUX；離心機(jī)購(gòu)自Thermo，型號(hào)5804R。病理脫水、包埋等設(shè)備均購(gòu)自Leica公司，具體如下：半自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（型號(hào)RM2245）、自動(dòng)脫水機(jī)（型號(hào)TP1020）、包埋機(jī)（型號(hào)EG1150H）、全自動(dòng)染色機(jī)（型號(hào)ST5010）、自動(dòng)封片機(jī)（型號(hào)CV5030）、熒光顯微鏡（購(gòu)自O(shè)lympus，型號(hào)BX43）。

1.4 小鼠肝臟原代細(xì)胞分離 小鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（LSEC）、HSC、Kupffer細(xì)胞、肝內(nèi)膽管細(xì)胞（BEC）、肝細(xì)胞分離及培養(yǎng)方法參照課題組已發(fā)表文獻(xiàn)［1］。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 小鼠原代HSC（DMEN-10% FBS）培養(yǎng)于12孔板，培養(yǎng)48 h后，換液為無血清培養(yǎng)基，PDPN蛋白處理15 min（終濃度為100 ng/mL），NF-κB抑制劑（BAY11-7082）處理1 h（終濃度1 μmol/mL），收集細(xì)胞檢測(cè)炎癥因子基因表達(dá)。

1.6 肝組織病理染色 選取肝右側(cè)最厚一葉，10%中性福爾馬林固定，自動(dòng)脫水機(jī)逐級(jí)脫水，包埋、4 μm切片。Leica全自動(dòng)染色機(jī)進(jìn)行HE染色，觀察組織學(xué)損傷。

天狼星紅染色：石蠟切片脫蠟至水，蒸餾水洗滌3次，滴加天狼星紅染色液，37 ℃孵育20 min，無水乙醇沖洗，晾干后封片。

免疫組化：石蠟切片首先脫蠟至水，再用EDTA抗原修復(fù)液＞95 ℃熱修復(fù)15 min后PBS洗3次，滴加H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，使用BSA封閉后一抗4 ℃過夜，PBS洗3次，滴加對(duì)應(yīng)二抗30 min，PBS洗凈后滴加A+B 30 min，PBS洗凈后用DAB顯色，蘇木素復(fù)染，無水乙醇脫水，二甲苯透明后封片。每組隨機(jī)100倍下拍5個(gè)視野，采用Image-Pro軟件統(tǒng)計(jì)陽性面積。

1.7 免疫印記 肝組織或細(xì)胞中加入含PMSF的RIPA裂解液，4 ℃，10 000 rpm，10 min離心后取上清。BCA法測(cè)定蛋白濃度，定量后加入Loading Buffer變性。取20 μg變性后的蛋白樣品至SDS-PAGE電泳，230 mA，1.5 h分離膠，再轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5% BSA封閉1 h，一抗（4 ℃）過夜孵育，二抗60 min室溫孵育，洗凈后顯影收集圖片。

1.8 實(shí)時(shí)定量PCR（RT-PCR） Trizol法提取肝組織和/或細(xì)胞總RNA，測(cè)定濃度后逆轉(zhuǎn)錄［Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Cat：RR037A）］至cDNA，RT-PCR采用ABIViiA? 7 Dx儀器檢測(cè)相關(guān)引物，引物序列見表1，結(jié)束采用2-ΔΔCT法分析計(jì)算相關(guān)指標(biāo)的基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 The RT-PCR primer sequences

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以表示，2組間比較采用成組t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。兩組數(shù)據(jù)相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性分析法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PDPN在肝纖維化患者肝組織中上調(diào)并與肝纖維化分期呈顯著正相關(guān) 慢性乙型肝炎患者肝活檢HE染色表明：S0期肝組織正常，S4期肝組織纖維增生、炎性浸潤(rùn)明顯（圖1a）。采用同患者的免疫組化檢測(cè)PDPN表達(dá)，發(fā)現(xiàn)S0期肝組織PDPN表達(dá)呈弱陽性，S4期患者陽性分布于肝竇，表達(dá)顯著升高（t=8.892，P=0.001）（圖1b）。為了進(jìn)一步衡量PDPN表達(dá)與肝纖維化分期的關(guān)系，檢測(cè)75例患者PDPN的mRNA表達(dá)，結(jié)果表明，PDPN mRNA在正常肝臟中表達(dá)較低，在S3、S4期肝臟中表達(dá)顯著升高，與正常組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.001）（圖1c）。相關(guān)性分析結(jié)果表明，PDPN mRNA表達(dá)與肝纖維化分期顯著正相關(guān)（r=0.655，P＜0.001）（圖1d）。

圖1 PDPN在臨床肝活檢樣本中的表達(dá)Figure 1 The expression of PDPN mRNA in liver biopsy tissue

2.2 PDPN表達(dá)在肝纖維化小鼠肝組織中升高 HE染色結(jié)果顯示：正常組小鼠肝組織正常，小葉結(jié)構(gòu)清晰，炎性浸潤(rùn)較少；模型組小鼠肝小葉中央靜脈偏離，炎性浸潤(rùn)，脂肪變等病變。天狼星紅染色結(jié)果顯示：正常組小鼠組肝臟匯管區(qū)和中央靜脈壁有少量膠原纖維著色，模型組小鼠肝組織見增生的膠原纖維分割肝小葉形成纖維間隔，部分假小葉形成（圖2）。

圖2 兩組小鼠肝組織病理染色結(jié)果Figure 2 The pathological staining of liver tissue in two groups

正常組PDPN陽性在肝竇區(qū)表達(dá)相對(duì)較少，模型組肝組織中PDPN在主要集中在纖維間隔，表達(dá)顯著增加（P＜0.001）；提示肝纖維化進(jìn)展中PDPN表達(dá)顯著增加，在纖維間隔中表達(dá)增多（表2）。

表2 CCl4模型中PDPN及其mRNA表達(dá)分析Table 2 Statistics of PDPN protein and mRNA expression in two groups

2.3 PDPN主要表達(dá)在LSEC 為明確PDPN在肝臟中的來源，分離了小鼠肝臟中各種類型的原代細(xì)胞，PTPCR檢測(cè)小鼠的肝細(xì)胞、LSEC、HSC、Kupffer細(xì)胞和BEC中PDPN的表達(dá)。結(jié)果表明，PDPN在LSEC中表達(dá)最高（圖3）。提示肝臟PDPN主要來源于LSEC。

圖3 小鼠肝臟各類型細(xì)胞中PDPN mRNA相對(duì)表達(dá)Figure 3 Relative expression of PDPN mRNA in various types of mouse liver cells

2.4 PDPN促進(jìn)HSC活化相關(guān)通路 PDPN（100 ng/mL）處理原代小鼠HSC 15 min，RT-PCR檢測(cè)炎癥相關(guān)因子TNF-α、CCL3、CXCL1和CXCR1的mRNA表達(dá)，與對(duì)照組（PBS）相比，上述指標(biāo)均顯著升高（P值均＜0.05），表明PDPN可促進(jìn)HSC活化。BAY11-7082（NF-κB信號(hào)抑制劑）處理后，上述炎癥指標(biāo)水平均明顯下降（P值均＜0.05），表明在BAY11-7082處理HSC后，PDPN的促炎癥效果顯著降低（表3）。

表3 小鼠原代HSC中炎癥指標(biāo)水平Table 3 Expression of inflammatory in mouse primary HSC

3 討論

肝纖維化是慢性肝損傷中的一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，各類慢性肝病和遺傳相關(guān)疾病等均可導(dǎo)致肝纖維化［6］。其特征是細(xì)胞外基質(zhì)增生與降解失衡，最終導(dǎo)致肝硬化［7］?；罨腍SC是肝纖維化發(fā)生的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，靶向HSC藥物研究是目前的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，但尚未在人體研究中突顯出療效［8］，這提示單方面將抗肝纖維化的研究聚焦在HSC上并不全面。

LSEC在維持肝內(nèi)微循環(huán)穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵作用［9］，研究［10］發(fā)現(xiàn)LSEC與維持HSC靜止和支持肝臟再生有關(guān)，但研究LSEC致肝纖維化報(bào)道較少。PDPN是一種黏蛋白跨膜蛋白［11］。最近研究［12］表明，PDPN在惡性腫瘤中高表達(dá)，如鱗狀細(xì)胞癌、惡性間皮瘤，因此，PDPN也參與了腫瘤的形成和發(fā)展。另有研究［13］表明，PDPN在小鼠膽管結(jié)扎模型中表達(dá)升高，但PDPN參與肝纖維化進(jìn)展的機(jī)制未見報(bào)道，本研究探討了PDPN在HSC活化和肝纖維化中的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，在慢性乙型肝炎患者肝組織中PDPN的表達(dá)隨著肝纖維化分期的增加而升高，并且與肝纖維化分期呈顯著正相關(guān)，提示PDPN與肝纖維化進(jìn)展密切相關(guān)。通過小鼠肝纖維化模型分析顯示，PDPN主要分布在肝竇，主要在纖維間隔表達(dá)升高，再次證實(shí)PDPN與肝纖維化進(jìn)展相關(guān)。通過對(duì)人和小鼠肝臟原代細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)，與肝細(xì)胞、HSC、Kupffer細(xì)胞及BEC相比較，PDPN高表達(dá)于LSEC。通過小鼠原代HSC發(fā)現(xiàn)，PDPN可顯著誘導(dǎo)HSC炎癥表達(dá)，提示PDPN可誘導(dǎo)HSC活化，而抑制NF-κB信號(hào)，PDPN誘導(dǎo)HSC炎癥產(chǎn)生的能力顯著被抑制，提示PDPN通過NF-κB誘導(dǎo)HSC活化促進(jìn)肝纖維化進(jìn)展。

綜上所述，肝纖維化進(jìn)展中，PDPN顯著升高，肝臟中PDPN主要來源于LSEC，肝損傷后來源于LSEC的PDPN誘導(dǎo)NF-κB信號(hào)誘導(dǎo)HSC活化，促進(jìn)肝纖維化進(jìn)展。

倫理學(xué)聲明：臨床研究于2020年8月12日經(jīng)由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，批號(hào)：PTEC-2020-32（Y）-1，符合臨床研究倫理規(guī)范。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)于2022年6月30日由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批，批號(hào)：QWEC-A-202206008，符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：王知意、楊廣越、張瑋、趙鑫負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)操作及資料分析，撰寫論文；馬文婷、劉旭凌、吳柳、浦婭瓊參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；劉成、陶樂負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。