王俊躍,桑煜龍,王賀飛,凌婉婷(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)土壤有機(jī)污染控制與修復(fù)研究所,江蘇 南京 210095)
研究表明,在極低濃度下雌激素就可擾亂野生動(dòng)物和人類內(nèi)分泌系統(tǒng)的正常功能[1].多種魚類的發(fā)育與繁衍、性別分化、卵黃原蛋白的產(chǎn)生都受到環(huán)境中雌激素的影響[2-3].雌激素也對(duì)其他生物產(chǎn)生毒害,受環(huán)境雌激素的影響,野生青蛙后代種群中性別比例失調(diào)[4].高水平雌激素與男性生殖障礙和精子數(shù)量、質(zhì)量下降有關(guān),還會(huì)導(dǎo)致女性不孕不育和乳腺癌等疾病發(fā)病率增加[5].
環(huán)境中的雌激素包括動(dòng)物體內(nèi)合成的天然雌激素(雌酮、雌二醇、雌三醇等)和以醫(yī)療、飼養(yǎng)、加工等為用途的合成雌激素(炔雌醇、己烯雌酚、雙酚A 等).環(huán)境中大部分雌激素源自于動(dòng)物產(chǎn)生的天然雌激素,尤其是集中飼養(yǎng)的畜禽.世界上分布最廣泛的動(dòng)物類型是牛、羊、豬和家禽[6].天然雌激素按形態(tài)劃分可分為自由態(tài)和結(jié)合態(tài),相關(guān)畜禽體內(nèi)未被代謝的雌激素隨糞尿排放進(jìn)入環(huán)境中,結(jié)合態(tài)雌激素通常隨尿液排出,而糞便中存在的雌激素多為自由態(tài)[7].有大量研究報(bào)道了水環(huán)境[8]中,例如,工業(yè)廢水、生活污水和地下水中含有雙酚A,而Zhang 等[9]在研究畜禽糞便中雌激素種類的過程中也發(fā)現(xiàn)了雙酚A,這可能是畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)中動(dòng)物的食盆或者盛放糞便的塑料容器內(nèi)表面材料中釋放出來的.炔雌醇、己烯雌酚作為人工合成的口服生物活性雌激素,是牲畜養(yǎng)殖活動(dòng)中用以促進(jìn)生長、育肥、誘導(dǎo)發(fā)情、預(yù)防和治療牲畜生殖障礙比較常見的藥物[10-11],這類藥物經(jīng)過生物代謝后殘留于畜禽糞便中.不同種類畜禽糞便中雌激素的種類含量不同,明確其污染特征將更有利于推進(jìn)風(fēng)險(xiǎn)防控和治理工作.
在施加畜禽糞便中的農(nóng)田土壤和地下水中都檢測(cè)到雌激素及其代謝產(chǎn)物[12],在施用糞便農(nóng)田鄰近的河流、湖泊中也檢測(cè)到不同濃度的雌激素,說明雌激素可以在環(huán)境中不斷遷移與轉(zhuǎn)化[13].吸附、膜分離、傳統(tǒng)氧化等物理和化學(xué)方法能夠去除環(huán)境中的雌激素[14-15].但生物修復(fù)因其高效、環(huán)保被認(rèn)為是一種更先進(jìn)的處理技術(shù).
本文概括了國內(nèi)外畜禽糞便中雌激素的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)、污染特征和遷移過程的研究進(jìn)展.列舉了除傳統(tǒng)堆肥之外,高級(jí)氧化、微生物等雌激素控制技術(shù),介紹了雌激素降解功能細(xì)菌、降解功能菌群和固定化菌劑,評(píng)價(jià)了功能菌群和固定化菌劑的顯著降解效果和應(yīng)用潛力.
1.1 畜禽糞便中雌激素的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)
畜禽糞便中3 種天然雌激素都是由一個(gè)酚環(huán)、兩個(gè)環(huán)己烷和一個(gè)環(huán)戊烷構(gòu)成的環(huán)戊烷并多氫菲結(jié)構(gòu),又稱甾體母核.區(qū)別在于環(huán)戊烷上C16和C17所連基團(tuán)的位置和數(shù)量不同[6],如表1 所示,雌酮在C17上連接一個(gè)羰基,雌二醇與雌酮的差異在于C17的羰基變?yōu)榱u基,羥基在空間位置上的不同形成了兩種立體構(gòu)型17α-E2 和17β-E2,而雌三醇在C16和C17上都連接一個(gè)羥基[16].合成雌激素中炔雌醇由甾體雌激素衍生,具有環(huán)戊烷并多氫菲結(jié)構(gòu).在雌二醇的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上C17上的氫被乙炔基取代,使得炔雌醇的結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定,在環(huán)境中的降解難度更大.雙酚A 的結(jié)構(gòu)與塑化劑較為類似,主要由2 個(gè)剛性平面芳環(huán)和可塑非線性脂肪鏈構(gòu)成[17],分子空間結(jié)構(gòu)對(duì)稱具有非極性.己烯雌酚是一類合成非甾體雌激素,具有乙烯平面結(jié)構(gòu),3、4 號(hào)位上的氫被兩個(gè)羥基苯基取代,p-Π 共軛的結(jié)構(gòu)使得芳香環(huán)具備高抗性.
表1 畜禽糞便中雌激素的理化性質(zhì)[6,15-16]Table 1 Physicochemical properties of estrogens in manure[6,15-16]
如表1 所示,無論是天然或者是人工合成的雌激素,飽和蒸汽壓都較低,揮發(fā)作用可忽略不計(jì).天然雌激素的Log Kow(辛醇-水分配系數(shù))較高且水中的溶解度(Sw)較低,因此暴露于環(huán)境中易被土壤、糞便中的有機(jī)質(zhì)及其水中的沉積物吸附,而合成雌激素像炔雌醇和己烯雌酚也具有相似的性質(zhì).雙酚A 可作為某些塑料制品的原材料和抗氧化劑,A 對(duì)小鼠具備雌激素的效應(yīng)[18],能夠與人體細(xì)胞的雌激素受體結(jié)合,產(chǎn)生雌激素活性,因此雙酚A 被列為雌激素.
1.2 畜禽糞便中雌激素的種類和含量
畜禽糞便中雌激素的種類和含量因畜禽類型的不同而產(chǎn)生差異,對(duì)比國內(nèi)外不同畜禽糞便中雌激素的污染特征,結(jié)果如表2.根據(jù)調(diào)查的數(shù)據(jù)(采用均值作比較)發(fā)現(xiàn)牛糞中的雌激素主要為E1 和17β-E2,濃度分別為265.56,102.52μg/kg,這與Li 等[19]的研究結(jié)果相符,他們發(fā)現(xiàn)牛糞便中90%的雌激素為E1 和E2.與其他畜禽相比,豬糞便中雌激素的濃度普遍偏高,E1 和E2 濃度高達(dá)1052.81,266.29μg/kg,這可能是因?yàn)樨i的尿液和糞便長期共存,導(dǎo)致檢測(cè)的雌激素含量偏高.雞鴨糞便中雌激素主要以E3 為主,濃度均值可達(dá) 121.01,111.6μg/kg.為了提高畜禽產(chǎn)量和質(zhì)量,EE2、BPA 等合成雌激素通常被添加到飼料中,因此在畜禽糞便中可以檢測(cè)到合成雌激素的存在,畜禽糞便中合成雌激素的量遠(yuǎn)低于天然雌激素,這與大部分關(guān)于畜禽糞便中雌激素含量的研究結(jié)果相符.
表2 畜禽糞便的雌激素濃度(μg/kg)[9,20-28]Table 2 Concentration of estrogens in manure(μg/kg)[9,20-28]
對(duì)于同種畜禽,生長階段和性別差異等因素對(duì)其糞便中雌激素含量也有很大影響.在Abdellah 等[6]的研究中發(fā)現(xiàn)懷孕期間牛糞便中總雌激素的日排泄量為256~7300μg/d,而未懷孕牛的雌激素日排泄量低于200μg/d,說明懷孕期間雌激素排泄量遠(yuǎn)高于平時(shí).由于人類的需求,家養(yǎng)畜禽往往會(huì)有不同用途,這也影響了其糞便中雌激素的含量,奶牛產(chǎn)生的雌激素明顯高于肉牛,蛋雞的游離激素含量也高于肉雞.在Zhang 等[20]的研究中發(fā)現(xiàn)雄性肉雞糞便中雌激素日排泄量低于檢出限,而雌性肉雞和蛋雞糞便中的游離雌激素排泄量為 2.79~3.28 和 2.04~8.59μg/d.在表3 中根據(jù)文獻(xiàn)總結(jié)了不同畜禽在不同差異下的雌激素日排泄量的估計(jì)值,但這些數(shù)據(jù)只代表了少數(shù)幾類動(dòng)物,并且如飲食習(xí)慣、季節(jié)變化、健康狀況等情況都很難考慮進(jìn)去,對(duì)于了解動(dòng)物雌激素的貢獻(xiàn)有限,未來還需更多關(guān)于此方面的研究.
表3 不同生理階段的畜禽糞便中雌激素日排泄量(μg/d)[9,20,25,28]Table 3 Daily excretion of manure at different physiological stages(μg/d)[9,20,25,28]
1.3 畜禽糞便中雌激素的遷移特征
畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)以及施用過糞肥的農(nóng)田周圍的土壤、地下水、地表徑流中都發(fā)現(xiàn)了不同程度的雌激素污染.比如,在施用動(dòng)物糞便的地區(qū)地下水中發(fā)現(xiàn)17β-E2[29].全球多個(gè)國家都報(bào)道了不同程度的地表水雌激素污染,尤其集中在人口眾多、經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)的國家和地區(qū).在中國,Li 等[30]預(yù)測(cè)了長江流域糞源性雌激素濃度,長江上中下游的平均雌激素活性當(dāng)量(EEQ)分別為2.13,3.49,9.36ng/L,其中江蘇省的EEQ預(yù)測(cè)值最高,為16.65ng/L.Luo[31]調(diào)查了美國喬治亞州流域受家禽排泄物影響的河流中4 種雌激素污染狀況,約有1/6 的水樣中檢測(cè)到雌激素的量高于定量限,E1、E2、E3 的平均濃度分別為1.85,4.69,5.04ng/L,尚未檢測(cè)到EE2 的存在.然而,世界范圍內(nèi)對(duì)畜禽糞便中雌激素的遷移機(jī)制的研究還很有限.
雌激素在遷移過程中易受環(huán)境中多種因素的影響.Chambers 等[32]研究發(fā)現(xiàn)糞便中的溶解性組分和膠體組分對(duì)于雌激素的遷移及生物活性有顯著影響,在高含量有機(jī)質(zhì)的影響下,雌激素更傾向于與其中的溶解性組分結(jié)合,且結(jié)合后仍具有較高的生物活性,這也解釋了畜禽糞便中雌激素易向其他環(huán)境發(fā)生遷移的原因.殘留在農(nóng)田中的雌激素會(huì)隨著淋溶作用向下層土壤遷移,Xu 等[33]發(fā)現(xiàn)土壤的有機(jī)質(zhì)含量和水利條件是影響雌激素遷移的主要因素,土壤有機(jī)質(zhì)含量高的土壤通常具有較高的淋溶性.Langwaldt 等[34]的研究中發(fā)現(xiàn)雌激素向土壤下層遷移時(shí)會(huì)在含水層以溶解的形式滲入到地下水,由于溶解氧不足等不利的條件,地下水中的雌激素難以消減而導(dǎo)致持續(xù)存在長達(dá)數(shù)月.遷移過程中雌激素在不同環(huán)境中活性和形態(tài)發(fā)生轉(zhuǎn)變,未來對(duì)于畜禽糞便中雌激素的環(huán)境行為研究具有重要的環(huán)境意義.
2.1 好氧堆肥
堆肥因其操作便捷、處理規(guī)模大、對(duì)雌激素的降解能力強(qiáng)而受到人們的廣泛關(guān)注[6].已有部分研究揭示了好氧堆肥具有較好的雌激素去除效果,Han等[35]測(cè)定了雞糞、牛糞、豬糞堆肥后的雌激素含量變化,堆肥32d 后,雞糞中E3、17β-E2、EE2 去除率分別為90.0%、54.5%、93.3%,而豬糞中17β-E2、E3 的去除率為91.2%和63.7%,牛糞在堆肥16d時(shí),17β-E2 和E3 的去除率為90.3%和87.4%,32d 后已經(jīng)檢測(cè)不到雌激素存在,并且發(fā)現(xiàn)堆肥過程中雌激素的降解速度呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì).
目前已有報(bào)道指出堆肥時(shí)外加微生物和吸附材料可以顯著提高堆肥效果[36].Sun 等[37]通過外加微生物菌劑和腐殖酸來提高堆肥的溫度和加速雌激素的降解,他們?cè)诘蜏貤l件下將雌激素降解菌和腐殖酸加入到堆肥糞便中,雌激素降解菌增加了總菌群中具有降解和轉(zhuǎn)化雌激素能力的菌屬,加快了堆肥進(jìn)程并提高了雌激素降解率,腐殖酸不僅可以加速雌激素的吸附和積累,還能減少氨氮的揮發(fā)和豐富糞肥中的養(yǎng)分.Li[38]在研究中發(fā)現(xiàn)外加硫也會(huì)增加堆肥溫度和減少氨氮的消散,添加量低于5%還促進(jìn)了對(duì)4 種雌激素(E1、17β-E2、E3、EE2)的降解.李欣[39]利用固定化菌劑處理牛糞12h,牛糞中天然雌激素E3、E2、E1 去除96.06%以上,合成雌激素DES 也去除了93.83%.近年來,也有許多關(guān)于堆肥與生物炭相互作用[40]的報(bào)道,添加生物炭能夠減少溫室氣體的排放、減少肥料需求,同時(shí)能增加微生物活性,影響微生物菌群[41].因此,堆肥時(shí)添加生物炭固定的雌激素降解菌群將是很有前景的研究方向.
2.2 高級(jí)氧化
高級(jí)氧化技術(shù)應(yīng)用于新型污染物的降解方面的研究目前受到廣泛關(guān)注,污水處理中通常采用過硫酸鹽氧化、芬頓試劑氧化、TiO2光催化氧化、臭氧氧化等技術(shù)來去除雌激素,但畜禽糞便中作為雌激素的一個(gè)重要源頭,卻很少有關(guān)于高級(jí)氧化技術(shù)直接降解畜禽糞便中雌激素的研究.Sun 等[15]利用芬頓試劑對(duì)牛糞中進(jìn)行處理,反應(yīng)24h 后糞便中初始濃度為 97.40,96.54,100.22,95.01,72.49mg/kg 的E3、BPA、DES、E2 和EE25 種雌激素去除率分別達(dá)到84.9%、99.5%、99.1%、97.8%和84.5%.Wang等[42]優(yōu)化了芬頓氧化工藝并應(yīng)用于多種畜禽糞便中雌激素和抗生素的降解,目標(biāo)污染物的降解率都能達(dá)到70%以上.將芬頓氧化工藝與傳統(tǒng)好氧堆肥相結(jié)合不僅能更有效去除雌激素,而且綠色環(huán)保于環(huán)境無害.只有從源頭將雌激素加以控制,才能防止因遷移而造成更嚴(yán)重的環(huán)境影響.
2.3 微生物降解
微生物降解在去除環(huán)境雌激素方面的應(yīng)用受到廣泛關(guān)注,據(jù)報(bào)道的雌激素降解細(xì)菌多為厚壁菌門、變形菌門、放線菌門,擬桿菌門相對(duì)較少[43].其中如表4 所示,紅球菌屬(Rhodococcus sp.)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas sp.)、新鞘氨醇桿菌屬(Novosphingobium sp.)、芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)、沙雷氏菌屬(Serratia sp.)、假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter sp.)、亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas sp.)和叢毛單胞菌屬(Comamonas sp.)等為常見的雌激素降解菌.而近8 年內(nèi)國內(nèi)外學(xué)者又先后分別從深海沉積物、活性污泥、沙子、土壤、咸水湖、雞糞等環(huán)境中分離出枝芽孢桿菌屬(Virgibacillus sp.)、賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus sp.)、農(nóng)桿菌屬(Agromyces sp.)、窄食單胞菌屬(Stenotrophomonas sp.)、戈登氏菌屬(Gordonia sp.)、蒼白桿菌屬(Ochrobactrum sp.)、交替赤桿菌屬(Altererythrobacter sp.)等新雌激素降解菌屬,分離環(huán)境也不再局限于傳統(tǒng)的污泥與土壤,在一些極端環(huán)境中分離出新菌株.研究者[44-45]從深海沉積物和人工咸水湖中分離的耐鹽枝芽孢桿菌、交替赤桿菌作為耐鹽株,對(duì)于天然雌激素的降解效率高于部分從淡水環(huán)境分離的雌激素菌,這一發(fā)現(xiàn)表明在某些極端環(huán)境中亦存在雌激素,探索新環(huán)境將有利于發(fā)現(xiàn)更多雌激素降解新菌屬,推動(dòng)雌激素生物降解的研究進(jìn)程.
表4 雌激素降解功能細(xì)菌Table 4 The estrogens-degrading bacteria
目前對(duì)于雌激素降解單菌的研究和報(bào)道較多,但在實(shí)際應(yīng)用中單菌的環(huán)境適應(yīng)性仍較低且底物降解譜窄.因此,功能菌群的篩選與構(gòu)建成為雌激素生物降解的研究熱點(diǎn),表5 所示為應(yīng)用功能菌群降解雌激素的最新研究進(jìn)展.其中前4 組菌群屬于人工復(fù)合菌群,復(fù)合菌群相對(duì)于組成菌群的菌株雌激素降解效率更高.韓施寧[46]研究發(fā)現(xiàn)組成BC-2 的2種菌株對(duì)于EE2 的降解率皆低于25%,而將二者復(fù)合之后的降解率能達(dá)到36.4%;Ke 等[47]所構(gòu)建的菌群BC-3 在2d 之內(nèi)就將3 種天然雌激素完全去除,菌群中多株菌的協(xié)同作用與多種酶的參與,顯著提高了雌激素的降解效率.除了人工復(fù)合菌群,從雌激素污染環(huán)境中分離的天然菌群,在原位修復(fù)方面更具優(yōu)勢(shì),一方面大部分菌都是屬于土著菌,馴化后投加能減少菌間拮抗的風(fēng)險(xiǎn),另一方面天然菌群的菌數(shù)量遠(yuǎn)高于人工菌群,相對(duì)來說更加穩(wěn)定.BC-5 和BC-6 是分別從豬糞污水和活性污泥中分離的天然菌群,Isabelle 等[48]發(fā)現(xiàn)BC-5 中高效降解E2 和E1的主要菌屬是甲基桿菌屬(Methylobacterium sp.)、蒼白桿菌屬(Ochrobactrum sp.) 、 假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)和分枝桿菌屬(Mycobacterium sp.),Bernardelli 等[49]應(yīng)用活性污泥反應(yīng)器降解雌激素,反應(yīng)器運(yùn)行30d 后E2、E1 被完全降解,此時(shí)污泥中的主要菌屬是假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)和硝化螺旋菌屬(Nitrospira sp.),這兩種菌在降解天然雌激素時(shí)發(fā)揮主要作用,而當(dāng)E2 和E1 消耗完時(shí),擬桿菌門中的Emticicia sp., Nubsella sp., Sphingobacterium sp.屬以及變形菌門中的 Novosphingobium sp.,Sphingomonas sp., Altererythrobacter sp., Acinetobacter sp.屬成為降解EE2 的主要菌屬.目前對(duì)于雌激素降解菌群的報(bào)道仍然較少,人工復(fù)合菌群或是天然菌群的研究只停留在效果驗(yàn)證和菌群組成的階段,對(duì)于細(xì)菌之間的互作關(guān)系和機(jī)制方面可以成為未來研究的新方向.
表5 雌激素降解菌群Table 5 The estrogen-degrading bacterial consortiums
實(shí)際環(huán)境中,生物降解很多情況下會(huì)面臨極端條件,例如干旱、過酸過堿、高溫等.土著菌存在于任何環(huán)境中,游離菌株在不良環(huán)境或是土著菌的影響下,其降解效率都會(huì)大幅降低.采用適當(dāng)?shù)墓潭ɑ牧衔?、包埋微生?既能避免微生物直接接觸不良環(huán)境,載體中的營養(yǎng)物質(zhì)又能促進(jìn)生物降解,某些多孔介質(zhì)還能富集環(huán)境中的污染物,提高降解效果.表6 所列舉的是目前報(bào)道的雌激素固定化菌劑,大部分較游離菌劑的降解效果都有所提升.Wu等[50]制備的Lysinibacillus sp. GG242 的固定化菌劑是在pH 值為5.0 的條件下進(jìn)行降解,在該酸性條件下,游離菌劑對(duì)E2 降解效果只有38%,但固定化之后降解效果維持在92.3%,說明固定化材料能在菌和實(shí)際環(huán)境中起到緩沖的作用,維持菌的活性.合成雌激素通常降解時(shí)間長、難度大,研究者[39,51]將Pseudomonas putida SJTE-3 和實(shí)驗(yàn)室分離得到的菌群固定,固定后促進(jìn)了合成雌激素如炔雌醇、己烯雌酚等的降解效果,固定化提高了菌和酶的穩(wěn)定性并保持其降解的高效性.可見固定化能夠有效促進(jìn)雌激素生物降解,提高穩(wěn)定性,制備時(shí)有針對(duì)性地選擇固定材料,優(yōu)化固定時(shí)間和配比更有利于增強(qiáng)雌激素降解效果.
3.1 畜禽糞便中雌激素的降解途徑及分子機(jī)制.畜禽糞便中雌激素的降解受到有機(jī)質(zhì)、酸堿度、溫度等因素的影響,而且雌激素的種類繁多,特別是像BPA 和DES 等合成雌激素,對(duì)于其降解途徑與具有雌激素效應(yīng)的產(chǎn)物研究尚少.因此在關(guān)心畜禽糞便中天然雌激素環(huán)境危害的同時(shí),也應(yīng)控制合成雌激素的用量和降解過程.近些年,雌激素降解的研究逐步向分子領(lǐng)域過渡,為雌激素微生物降解尋求更科學(xué)的理論支撐,如雌激素降解菌的基因調(diào)控、功能基因注釋、雌激素降解菌基因組學(xué)研究和雌激素降解酶研究等.
3.2 畜禽糞便中雌激素的生態(tài)和人群健康風(fēng)險(xiǎn).采集多種環(huán)境中的畜禽糞便樣本,并對(duì)所在場(chǎng)地周圍的土壤、徑流、地下水等環(huán)境實(shí)行多點(diǎn)分析,采用實(shí)際測(cè)定值進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估,更能科學(xué)地反映雌激素生態(tài)危害的真實(shí)情況.未來研究雌激素在不同環(huán)境中遷移的同時(shí),應(yīng)關(guān)注不同種類雌激素的生理毒性,評(píng)估糞便-土壤-蔬菜-人體或糞便-水體-水生生物等多條實(shí)際遷移途徑所造成的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)和對(duì)人體健康的影響.
3.3 開發(fā)雌激素生物降解新技術(shù).單菌難以適應(yīng)實(shí)際環(huán)境,解決實(shí)際污染問題,將單菌復(fù)配成菌群,一方面菌與菌之間的協(xié)同作用能夠提高降解的效果,另一方面針對(duì)實(shí)際環(huán)境中復(fù)雜且苛刻的條件,菌群中具有更廣底物譜.功能菌群與合適的材料固定為菌劑,提高雌激素的生物降解效果的同時(shí),也便于工程化量產(chǎn)和使用.
3.4 應(yīng)用菌劑去除畜禽糞便中雌激素.雌激素降解菌的應(yīng)用大都在水體或土壤環(huán)境中,使用菌劑增強(qiáng)畜禽糞便雌激素降解的研究仍然較少,倘若在畜禽糞便堆肥的同時(shí)外加菌劑輔助降解,則能夠在源頭最大程度降低雌激素的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn),為畜禽糞便資源化安全利用提供保障.