環(huán)洞庭湖土壤抗生素抗性基因分布和潛在風(fēng)險(xiǎn)

武 晨,黃鳳蓮,劉新剛,范青青,陸海楠,李啟武,郭 倩,李 瑩,彭勇春,李 峰*(1.湘潭大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院,湖南 湘潭 41110；2.長沙環(huán)境保護(hù)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,湖南 長沙 410004；.國家環(huán)境保護(hù)城市土壤污染控制與修復(fù)工程技術(shù)中心,上海市環(huán)境科學(xué)研究院,上海 2002；4.環(huán)境生態(tài)健康湖南省普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 湘潭 41110；.湖南省長沙生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心,湖南 長沙 410001；.湖南省生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心,湖南 長沙 41002；.湖南省湘西生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心,湖南 吉首 41000；8.國家環(huán)境保護(hù)重金屬污染監(jiān)測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 長沙 410014)

洞庭湖流域是湖南省乃至全國最重要的商品糧油基地和水產(chǎn)養(yǎng)殖基地之一,同時(shí)也是長江流域重要的綠色生態(tài)屏障,對(duì)維護(hù)當(dāng)?shù)厣锒鄻有院蜕鷳B(tài)健康安全具有重要作用.然而,由于工業(yè)生產(chǎn)和農(nóng)業(yè)面源污染等原因?qū)е颅h(huán)洞庭湖流域周邊環(huán)境受到不同程度的污染.以往研究大多關(guān)注洞庭湖流域水體、沉積物和周邊土壤中重金屬、多環(huán)芳烴和農(nóng)藥等傳統(tǒng)污染物的賦存特征、來源和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)[1-2],忽略了抗生素抗性基因(ARGs)在環(huán)洞庭湖流域周邊環(huán)境的豐度分布和潛在風(fēng)險(xiǎn).ARGs 作為一種新污染物被廣泛的從生態(tài)系統(tǒng)中檢出,ARGs 能夠在不同細(xì)菌種群之間發(fā)生基因水平轉(zhuǎn)移并且存在自身擴(kuò)增的獨(dú)特行為從而引起生物體高耐藥性,對(duì)農(nóng)業(yè)生物安全、生態(tài)環(huán)境健康和全球公共衛(wèi)生安全造成潛在威脅[3].

土壤是環(huán)境中ARGs 重要的“匯”,也是ARGs向水體和大氣等環(huán)境介質(zhì)發(fā)生遷移轉(zhuǎn)化重要的“源”[4].污泥農(nóng)用和有機(jī)肥施用等活動(dòng)向土壤中引入病原菌和耐藥菌從而增加土壤ARGs 豐度和多樣性,并進(jìn)一步促進(jìn)可移動(dòng)基因元件(MGEs)在土壤-植物系統(tǒng)中的傳播,從而對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)造成危害[5].重要的是,土壤ARGs 能夠通過多種暴露途徑進(jìn)入人體微生物組和病原體中,將增加人體耐藥性從而使疾病治療難度增加,對(duì)人體健康造成嚴(yán)重影響[6-7].因此,亟需評(píng)估環(huán)洞庭湖流域周邊土壤中ARGs 的潛在健康風(fēng)險(xiǎn).

由于缺乏ARGs 的劑量-效應(yīng)模型,導(dǎo)致準(zhǔn)確評(píng)估ARGs 對(duì)人體造成的健康風(fēng)險(xiǎn)存在一定難度[8].已有學(xué)者嘗試采用定量微生物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、實(shí)驗(yàn)室篩選致病菌和流行病學(xué)調(diào)查等方式搭建ARGs 健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估框架,以評(píng)估人體對(duì)ARGs 的攝入量,從而篩選高風(fēng)險(xiǎn)ARGs[9-13].值得注意的是,現(xiàn)有的評(píng)價(jià)方法多依賴某些確定性參數(shù)(如土壤顆粒吸入速率、暴露時(shí)間和體重等),但由于環(huán)境中ARGs 豐度的不確定性和特定人群受體的變化,易引發(fā)對(duì)潛在暴露劑量和健康風(fēng)險(xiǎn)的高估或低估[14].Monte Carlo 模擬已被廣泛的應(yīng)用于污染物的概率健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中,該方法可以準(zhǔn)確評(píng)估健康風(fēng)險(xiǎn)超過閾值的概率并確定優(yōu)先控制因子[15].

因此,本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)對(duì)環(huán)洞庭湖流域表層土壤中不同類型的ARGs 豐度進(jìn)行系統(tǒng)分析,明確研究區(qū)域土壤中ARGs 分布特征,采用Monte Carlo 模擬評(píng)估土壤ARGs 多途徑暴露下的人體暴露劑量和潛在健康風(fēng)險(xiǎn),以期為環(huán)洞庭湖流域周邊表層土壤中ARGs 風(fēng)險(xiǎn)管控提供科學(xué)依據(jù),為農(nóng)業(yè)系統(tǒng)可持續(xù)發(fā)展和維持生態(tài)環(huán)境安全提供科學(xué)支撐.

1 材料與方法

1.1 點(diǎn)位布設(shè)和樣品采集

本研究在環(huán)洞庭湖流域共設(shè)置表層土壤采樣點(diǎn)位52 個(gè)(圖1),其中東洞庭湖流域采集19 個(gè)樣本,南洞庭湖流域采集18 個(gè)樣本,西洞庭湖流域采集15個(gè)樣本.采用五點(diǎn)取樣法采集表層土壤樣本.樣品放入含有冰袋的保溫箱中立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室置于-80℃保存.土壤樣本去除根莖、石塊等異物,經(jīng)過真空冷凍干燥后用滅菌的瑪瑙研缽研磨,然后過100 目篩放置在棕色無菌玻璃瓶中,儲(chǔ)存于-80℃?zhèn)溆?

1.2 土壤DNA 提取與qPCR

準(zhǔn)確稱取0.2g 土壤樣本,根據(jù)Ezup 柱式土壤DNA 抽提試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司,中國)中的操作步驟提取土壤樣本中微生物總DNA,然后采用1%瓊脂糖凝膠電泳(Thermo Fisher Scientific,美國)和ND5000 超微量紫外分光光度計(jì)(北京百泰克生物技術(shù)有限公司,中國)檢驗(yàn)DNA 濃度和質(zhì)量.

本研究選取土壤環(huán)境中廣泛檢出的 8 種ARGs 類型和16 種ARGs 亞型作為目標(biāo)ARGs,選擇I 型整合子(intl1)作為MGEs 代表(表1),采用qPCR(LightCycler 96, Hoffmann-La Roche,瑞士)定量分析ARGs 和intl1 在研究區(qū)域表層土壤樣本中的豐度,每組測(cè)試設(shè)有3 個(gè)平行.qPCR 反應(yīng)體系為20μL,包括正、反引物各0.5μL(生工生物工程(上海)股份有限公司,中國),SYBR Green Master Mix 10μL(翌圣生物科技(上海)股份有限公司,中國),ddH2O 8.0μL(生工生物工程(上海)股份有限公司,中國),模板DNA 1.0μL.qPCR 反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性5min,1 個(gè)循環(huán),95℃變性10s、退火溫度下退火20s、72℃延伸20s,40 個(gè)循環(huán)[16].引物信息和退火溫度見表1.

表1 qPCR 反應(yīng)中定量ARGs 和intl1 豐度的引物序列Table 1 Primer pairs for the quantification of ARGs and intl1by qPCR

1.3 土壤ARGs 日均暴露劑量評(píng)估

根據(jù)《環(huán)境污染物人群暴露評(píng)估技術(shù)指南》(HJ 875-2017),分別評(píng)估了兒童和成人經(jīng)不同途徑攝取土壤中ARGs 的日均暴露劑量,即經(jīng)皮膚接觸土壤ARGs、經(jīng)呼吸道吸入攜帶ARGs 的土壤顆粒和無意中經(jīng)口攝入攜帶ARGs 的土壤顆粒,計(jì)算公式見公式(1)～(3).為了減小模型中參數(shù)的不確定性導(dǎo)致評(píng)估結(jié)果偏大或偏小的問題,利用Oracle Crystal Ball v11.1.2.4 軟件(Oracle,美國)進(jìn)行了Monte Carlo模擬,設(shè)定在95%置信水平上隨機(jī)模擬迭代次數(shù)為10000 次.

式中:ADD 為ARGs 的日均暴露劑量copies/(g·d);C 為ARGs 在土壤中的豐度,copies/g.公式中的其他參數(shù)含義及其在Monte Carlo 模型中的輸入值見表2.

表2 Monte Carlo 評(píng)估土壤ARGs 日均暴露劑量的參數(shù)Table 2 Parameter values of the model for daily exposure dose of ARGs in soil with the Monte Carlo simulator

偏遠(yuǎn)地區(qū)具有人口稀少、工業(yè)活動(dòng)極少、環(huán)境溫度低的特點(diǎn)(如永久凍土、極地和高海拔區(qū)域等),這些地區(qū)土壤中 ARGs 被認(rèn)為是原始存在的,ARGs 豐度受到人為因素影響較小[17-18].因此,本研究將青藏高原地區(qū)土壤中ARGs 絕對(duì)豐度作為土壤中ARGs 豐度背景值(豐度范圍是1.80×105～1.35×107copies/g,平均值為 3.03×106copies/g)[19],利用公式(1)～(3)計(jì)算的日均暴露劑量作為土壤ARGs 暴露劑量風(fēng)險(xiǎn)背景值,從而判斷研究區(qū)域土壤中ARGs 的潛在健康風(fēng)險(xiǎn).土壤ARGs 暴露劑量風(fēng)險(xiǎn)背景值為:成人 12.56copies/(g·d),兒童38.11copies/(g·d).

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

利用ArcGIS 10.5 繪制土壤采樣點(diǎn)位分布圖.利用SPSS Statistics 26.0 進(jìn)行單因素方差分析(Duncan檢驗(yàn))比較不同類型ARGs 的豐度差異,并分析不同地區(qū)表層土壤中intl1 的豐度差異(P<0.05).利用SPSS Statistics 26.0 進(jìn)行Spearman 相關(guān)性分析.利用Origin 2017 進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化.

2 結(jié)果與討論

2.1 環(huán)洞庭湖流域周邊表層土壤ARGs 分布特征

采用 qPCR 對(duì)洞庭湖流域周邊表層土壤中ARGs的豐度進(jìn)行定量.如圖2所示,環(huán)洞庭湖流域周邊表層土壤中ARGs 總豐度范圍為3.29×107～3.73×109copies/g.東洞庭湖流域表層土壤采樣點(diǎn)中ARGs的總豐度范圍為5.36×107～1.97×108copies/g,西洞庭湖流域表層土壤中ARGs 的總豐度范圍為5.75×107～7.34×108copies/g,南洞庭湖流域表層土壤中ARGs 的總豐度范圍為3.29×107～3.73×109copies/g.研究區(qū)域表層土壤中ARGs 豐度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于人跡罕至的青藏高原地區(qū)土壤中ARGs 豐度(1.80×105～1.35×107copies/g)[19],表明環(huán)洞庭湖流域表層土壤受到了人類活動(dòng)的影響造成高豐度ARGs 的積累.三個(gè)區(qū)域土壤中ARGs 的平均豐度排序?yàn)?南洞庭湖流域>西洞庭湖流域>東洞庭湖流域.已有研究表明洞庭湖流域中部地區(qū)的化肥使用量及面源污染的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)高于東部和西部地區(qū)[22].南洞庭湖流域處于研究區(qū)域中下游地區(qū),大面積的水流運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致攜帶ARGs 的微生物或者病原菌進(jìn)入下游水體和表層土壤中,從而使該地區(qū)土壤中ARGs 豐度較高.此外,本研究中南洞庭湖流域的采樣點(diǎn)位靠近工業(yè)區(qū),工業(yè)廢棄物和工業(yè)廢水中含有的大量的抗生素進(jìn)入土壤中也會(huì)促進(jìn)更多耐藥微生物的產(chǎn)生,并且工業(yè)污染排放的污染物在土壤中積累也會(huì)影響ARGs 的傳播與富集[23].

圖2 研究區(qū)域表層土壤中ARGs 和intl1 的豐度Fig.2 The abundance of ARGs and intl1in surface soil of the study area

所有采樣點(diǎn)表層土壤中均檢測(cè)到較高豐度的磺胺類抗性基因sul1 和dfrA14、氨基糖苷類抗性基因kan 和喹諾酮類抗性基因qnrB(圖2(a)).與其他類型的ARGs 相比,洞庭湖流域周邊表層土壤中磺胺類ARGs 豐度最高(P<0.05),其次是氨基糖苷類和四環(huán)素類ARGs,表明這3 類ARGs 存在較高的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)和潛在的人群暴露風(fēng)險(xiǎn)(圖2(b)-(d)).已有研究表明磺胺類和四環(huán)素類抗生素在養(yǎng)殖業(yè)中廣泛使用且在禽畜體內(nèi)不能被完全降解,從而造成洞庭湖水體以及沉積物中檢測(cè)到高豐度的磺胺類和四環(huán)素類抗生素[24-25].這些抗生素伴隨著灌溉水或者施肥進(jìn)入周邊土壤中,加之地表徑流和土-水交換等過程,誘導(dǎo)土壤微生物產(chǎn)生高豐度的磺胺類和四環(huán)素類ARGs,進(jìn)一步引起ARGs 在蔬菜、稻米和土壤等介質(zhì)中的積累[26].sul1 和drfA14 基因是磺胺類ARGs豐度的主要貢獻(xiàn)因子(圖2(a)),其中sul1 基因在農(nóng)田土壤[27]、麥田土壤[28]和堆肥土壤[29]中被檢到且屬于高豐度ARGs 基因.sul1 基因常位于可傳播型多抗性的大型質(zhì)粒或小型非結(jié)合質(zhì)粒上,可通過結(jié)合、轉(zhuǎn)導(dǎo)等方式在不同細(xì)菌間轉(zhuǎn)移和傳播從而導(dǎo)致磺胺類ARGs 在環(huán)境中廣泛存在[30].然而,一些低豐度的磺胺類ARGs(如drfA10 基因)也被檢出,說明ARGs 的豐度不僅受到環(huán)境中殘留抗生素的影響,還與該基因在環(huán)境介質(zhì)中的穩(wěn)定性有關(guān)[31].值得注意的是,本研究中檢測(cè)的氨基糖苷類ARGs 類型僅一種(kan 基因),但其豐度較高,這表明kan 基因廣泛的存在于研究區(qū)域土壤環(huán)境中并存在潛在風(fēng)險(xiǎn).

2.2 intl1 促進(jìn)環(huán)洞庭湖周邊表層土壤中ARGs 的傳播

由于土壤中intl1 豐度與ARGs 豐度和重金屬等抗性基因豐度相關(guān)且常存在于致病菌中,所以intl1 被認(rèn)為是人為污染的環(huán)境指示因子且促進(jìn)ARGs 的傳播[32].洞庭湖周邊表層土壤中 intl1 的平均豐度為6.94×108copies/g,高于ARGs 平均豐度(圖2(e)).洞庭湖流域?qū)儆趤啛釒駶櫄夂?適宜的溫度和濕度促進(jìn)了土壤環(huán)境中細(xì)菌的繁殖,而在高濃度的抗生素誘導(dǎo)下導(dǎo)致部分細(xì)菌產(chǎn)生intl1[33].此外,高豐度的intl1 可以通過遺傳和復(fù)制等方式進(jìn)入后代細(xì)菌基因組,利用編碼酶來剪切自身與宿主細(xì)菌的DNA連接,隨即intl1進(jìn)入細(xì)菌的轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)將復(fù)制的基因序列插入到細(xì)菌的染色體中,從而加速intl1 在不同細(xì)菌種群中的傳播[34].同時(shí),intl1 與同一基因位點(diǎn)上多個(gè)ARGs 的整合密切相關(guān),能夠促進(jìn)ARGs 的水平基因轉(zhuǎn)移過程[35].

通過對(duì)各個(gè)研究區(qū)域采樣點(diǎn)intl1與ARGs相對(duì)豐度進(jìn)行相關(guān)性分析,探究intl1 對(duì)ARGs 擴(kuò)散傳播的影響(圖3).結(jié)果表明,intl1 與研究區(qū)域土壤中高豐度ARGs 基因(如dfrA14、tetR 和kan)的相對(duì)豐度均呈顯著正相關(guān)(P<0.05),表明intl1可以通過水平基因轉(zhuǎn)移的方式介導(dǎo)洞庭湖流域表層土壤中磺胺類(dfrA14)、四環(huán)素類(tetR)和氨基糖苷類(kan)ARGs的擴(kuò)散傳播,這也是研究區(qū)域這3 類ARGs 豐度較高的原因之一.此外,在南洞庭湖流域和西洞庭湖流域,intl1 的豐度與萬古霉素類(vanG)和喹諾酮類(qnrB)ARGs 豐度顯著正相關(guān)(P<0.05),表明intl1 同步介導(dǎo)了vanG 和 qnrB 的基因水平轉(zhuǎn)移,從而導(dǎo)致這兩個(gè)區(qū)域具有較高的ARGs 豐度.同時(shí),研究區(qū)域表層土壤中豐度最高的磺胺類ARGs(sul1)豐度與大環(huán)內(nèi)酯類(ermB)和喹諾酮類(qnrB 和oqxA)ARGs豐度呈顯著正相關(guān)(P<0.05),表明大環(huán)內(nèi)酯類和喹諾酮類ARGs 與sul1 在南洞庭湖流域和西洞庭湖流域中可能具有相同的來源.

圖3 不同類型ARGs 和intl1 豐度的相關(guān)性分析Fig.3 Correlation analysis of abundance of different types of ARGs and intl1

2.3 環(huán)洞庭湖周邊表層土壤中ARGs 的潛在健康風(fēng)險(xiǎn)

利用Monte Carlo 模型計(jì)算了研究區(qū)成人和兒童經(jīng)過消化道暴露、呼吸道暴露和皮膚接觸3種途徑攝入土壤中ARGs 的日均暴露劑量.由圖4可知,人群在環(huán)洞庭湖流域不同區(qū)域土壤攝入的ARGs 平均劑量排序?yàn)?南洞庭湖流域>西洞庭湖流域>東洞庭湖流域,這與ARGs 豐度的區(qū)域分布相一致.兒童攝入土壤ARGs 的暴露劑量大于成人,這是由于ARGs 日均暴露劑量與受試人群的體重和暴露時(shí)間成反比,而兒童的體重和平均年齡均小于成人.

由于現(xiàn)有研究缺少ARGs 對(duì)人體的潛在致癌風(fēng)險(xiǎn)和非致癌風(fēng)險(xiǎn)相應(yīng)的斜率因子及參考劑量系數(shù),所以本研究將青藏高原土壤(高海拔、溫度低且受到人類活動(dòng)影響小)中ARGs 豐度作為土壤背景值,并由此計(jì)算的人體ARGs 日均暴露劑量作為風(fēng)險(xiǎn)背景值(成人為 12.56copies/(g·d),兒童為 38.11copies/(g·d)).如圖4 所示,研究區(qū)域存在64.92%～98.68%概率的ARGs 潛在健康風(fēng)險(xiǎn),兒童與成人受到ARGs 潛在健康風(fēng)險(xiǎn)概率相差不大,表明研究區(qū)域土壤ARGs造成的潛在健康風(fēng)險(xiǎn)不可忽視.

2.4 不同暴露途徑和不同類型ARGs 對(duì)人體暴露劑量的貢獻(xiàn)

研究區(qū)土壤中ARGs 經(jīng)過3 種暴露途徑和8 種不同類型ARGs 對(duì)總暴露劑量的貢獻(xiàn)比如表3 所示.皮膚接觸途徑是ARGs 暴露劑量的主要來源,其對(duì)成人和兒童暴露劑量的貢獻(xiàn)分別達(dá)到89%以上和58%以上.成人接觸土壤時(shí)具有較大的皮膚接觸面積,也就導(dǎo)致了較高的皮膚接觸的ARGs 暴露劑量.然而,兒童經(jīng)過消化道途徑攝入ARGs 的暴露劑量占比在41%以上,這可能是由于兒童在戶外活動(dòng)時(shí)存在頻繁接觸土壤并吮吸手指的行為[36],從而導(dǎo)致其可能通過消化道途徑較高攝入ARGs.因此,需要格外注意兒童在戶外活動(dòng)的衛(wèi)生防護(hù).

表3 不同暴露途徑和不同ARGs 類型對(duì)ARGs 日均暴露劑量的貢獻(xiàn)比(%)Table 3 Contribution of different exposure pathways and different ARGs types to the daily exposure dose of ARGs(%)

磺胺類ARGs 是總暴露劑量的主要來源,貢獻(xiàn)比為47.83%～78.68%,磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶和萬古霉素類ARGs 的暴露劑量較低,貢獻(xiàn)比在1%以下.不同的是,在東洞庭湖流域和南洞庭湖流域中氨基糖苷類和四環(huán)素類ARGs 對(duì)人群暴露劑量的貢獻(xiàn)僅次于磺胺類ARGs,然而在西洞庭湖流域樣本中是大環(huán)內(nèi)酯類和喹諾酮類ARGs 的貢獻(xiàn)次于磺胺類ARGs.這與不同類型的ARGs 在環(huán)洞庭湖流域不同區(qū)域土壤中的分布和豐度相關(guān).此外,本研究中磺胺類ARGs亞型(sul1, dfrA14 和dfrA10)的檢測(cè)數(shù)量低于四環(huán)素類ARGs 亞型(tetA, tetM, tetX, tetQ 和tetR),但磺胺類ARGs 的豐度及人群暴露劑量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于四環(huán)素類ARGs,可能是由于人為活動(dòng)和基因水平轉(zhuǎn)移導(dǎo)致了土壤中磺胺類ARGs 的豐度增加,從而造成較高的潛在健康風(fēng)險(xiǎn).

3 結(jié)論

3.1 環(huán)洞庭湖流域周邊表層土壤受到人類活動(dòng)影響導(dǎo)致存在較高豐度的ARGs 和I 型整合子基因(intl1),主要ARGs 類型是磺胺類、四環(huán)素類和氨基糖苷類ARGs,平均豐度分別為1.51×108、1.50×107和2.64×107copies/g,主要ARGs亞型是sul1和dfrA14基因.南洞庭湖流域土壤中ARGs 豐度分別是東、西洞庭湖流域土壤中ARGs豐度的3.6倍和2.0倍.intl1基因豐度與不同類型的ARGs 豐度呈正相關(guān),提示intl1 通過水平基因轉(zhuǎn)移促進(jìn)了研究區(qū)域表層土壤中ARGs 的擴(kuò)散傳播.

3.2 環(huán)洞庭湖流域周邊表層土壤 ARGs 存在64.92%～98.68%概率的ARGs 人體暴露劑量高于風(fēng)險(xiǎn)背景值,表明ARGs 導(dǎo)致的潛在人體健康風(fēng)險(xiǎn)不可忽視,其中皮膚接觸途徑是土壤ARGs 主要暴露途徑,占比為58.42%～90.23%,土壤中磺胺類ARGs是導(dǎo)致潛在健康風(fēng)險(xiǎn)的主要來源,占比為47.83%～78.68%.