光合細(xì)菌對活性污泥微生物群落結(jié)構(gòu)及功能的影響

楊文煥,鄧子威,徐 巖,王志超,李衛(wèi)平*(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)能源與環(huán)境學(xué)院,內(nèi)蒙古 包頭 014010；2.黃河流域內(nèi)蒙古段生態(tài)保護(hù)與綜合利用自治區(qū)協(xié)同創(chuàng)新中心,內(nèi)蒙古 包頭 014010)

光合細(xì)菌因光合作用機(jī)制的特殊性和營養(yǎng)代謝模式的多樣性,在污水生物處理領(lǐng)域具有較大潛力[1-2].已有研究[3-4]將光合細(xì)菌應(yīng)用于生物處理工藝,發(fā)現(xiàn)能提高系統(tǒng)對目標(biāo)污染物的去除性能.目前有關(guān)光合細(xì)菌的研究主要聚焦于處理各種類型的有機(jī)廢水,現(xiàn)有研究闡述了光合細(xì)菌作用下活性污泥系統(tǒng)處理性能與微生物群落結(jié)構(gòu)的關(guān)系,但對微生物群落功能和代謝途徑的深入認(rèn)識較為有限.

廢水脫氮是全球性環(huán)境問題[5].氨氮、硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮之間的相互轉(zhuǎn)化是傳統(tǒng)生物脫氮機(jī)理的基礎(chǔ)[6],這一過程需要大量氧氣和碳源供應(yīng)[7].光合細(xì)菌的多種能量和物質(zhì)代謝途徑使其具有良好的脫氮性能,光合細(xì)菌污水處理技術(shù)在污染物去除方面前景廣闊[8].Yang 等[9]發(fā)現(xiàn)光合細(xì)菌可能具有新的氮轉(zhuǎn)化途徑,即在光合細(xì)菌氮代謝過程中NH4+-N 可直接氧化為N2/N2O,突破了現(xiàn)有技術(shù)的限制.這種對光合細(xì)菌中氮代謝的新認(rèn)識可能為進(jìn)一步了解自然界的氮循環(huán)提供幫助.從代謝通路和基因方向著手對系統(tǒng)中氮循環(huán)功能微生物進(jìn)行更加深入地研究,對水生態(tài)環(huán)境的治理與保護(hù)意義重大.

本文以光合細(xì)菌為生物強(qiáng)化菌種,構(gòu)建光序批式活性污泥反應(yīng)器,在反應(yīng)器穩(wěn)定運(yùn)行條件下,分析光合細(xì)菌投加量、pH 值、光照強(qiáng)度和溶解氧(DO)對污染物去除效能的影響.采用高通量測序技術(shù),探究活性污泥微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的變化特征,基于PICRUSt2 功能預(yù)測和KEGG 數(shù)據(jù)庫,探討微生物功能通路、氮代謝功能基因及酶的種類和豐度變化,從分子生物層面揭示光合細(xì)菌作用機(jī)制,以期為光合細(xì)菌污水處理實(shí)際應(yīng)用提供參考.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗用水及接種污泥

實(shí)驗進(jìn)水采用模擬生活污水,分別以葡萄糖(C6H12O6)為碳源,氯化銨(NH4Cl)為氮源,磷酸二氫鉀(KH2PO4)作為磷源.保持進(jìn)水的CODCr、NH4+-N和TP 分別為500,40 和6mg/L 左右.添加碳酸氫鈉(NaHCO3)提供堿度以保證反應(yīng)器內(nèi)pH值為7.0～7.5.并加入適量的微量元素營養(yǎng)液為微生物的生長提供必需的微量元素[10],微量元素營養(yǎng)液與進(jìn)水體積比為1mL/L.

本實(shí)驗所用活性污泥取自包頭市某污水處理廠曝氣池污泥,污泥沉淀性能較好,MLSS 約為6500mg/L.采用人工配置模擬生活污水對活性污泥進(jìn)行培養(yǎng),使污泥保持較好的理化性質(zhì),當(dāng)污泥對CODcr和NH4+-N 的去除率穩(wěn)定后,認(rèn)為馴化完成,即可用于接種.實(shí)驗接種的光合細(xì)菌菌液(純種菌液)采購于廣東省科學(xué)院微生物研究所,GDMCC 編號及菌種名稱:GDMCC1.167,沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris).經(jīng)實(shí)驗室培養(yǎng)至穩(wěn)定生長期時進(jìn)行接種,此時菌濃度(OD600)為1.881,滿足接種需求.

1.2 實(shí)驗裝置及運(yùn)行條件

實(shí)驗一共設(shè)置一組序批式反應(yīng)器(SBR)和4 組光序批式反應(yīng)器(PSBR)(圖1),編號分別為R1～R5.R1 反應(yīng)器(對照組)無需進(jìn)行光照,R2～R5 反應(yīng)器為了保持同樣的光照強(qiáng)度,需要在反應(yīng)器外圍纏上相同數(shù)量的LED 光帶(光照強(qiáng)度為4000lux[11]).反應(yīng)器高30cm、內(nèi)徑10cm,有效容積2L,主要構(gòu)件為:反應(yīng)池、微孔曝氣盤、曝氣泵、攪拌器、轉(zhuǎn)子流量計和LED 燈條.所有反應(yīng)器周圍環(huán)境條件保持相同.反應(yīng)器側(cè)壁設(shè)有取樣口,DO 濃度由轉(zhuǎn)子流量計進(jìn)行調(diào)整,反應(yīng)器最底端取樣口為排泥口.

圖1 實(shí)驗裝置示意Fig.1 Experimental setup diagram

5 組反應(yīng)器以12h 為一個反應(yīng)周期:進(jìn)水0.2h,曝氣7h,沉淀4h,排水0.2h,靜置0.6h.沉淀時光照,黑暗時曝氣攪拌(光暗比為4:7).待反應(yīng)器中混合液完全沉降后,手動排水,每次排水的體積為混合液的50%,當(dāng)液位下降到1000mL 處時,停止排水,每天手動排泥100mL.各組反應(yīng)器的pH 保持在7.0～7.5,DO濃度維持在2.5～3.5mg/L. R1～R5 反應(yīng)器中光合細(xì)菌投加量分別為0%、1%、5%、10%和15%(菌液體積與反應(yīng)器有效容積比),其中R1 反應(yīng)器為空白對照組不加菌.

1.3 單因素實(shí)驗設(shè)計

在光照強(qiáng)度為4000lux,DO 為3mg/L 時,設(shè)pH值為5,6,7,8 和9.在pH 7 和DO 為3mg/L 時,設(shè)光照強(qiáng)度為2000,3000,4000,5000,6000lux.在pH 7和光照強(qiáng)度4000lux 時,設(shè)DO 為1,2,3,4,5mg/L.DO 和pH值變化時,光照強(qiáng)度為固定值(強(qiáng)度大小通過纏繞反應(yīng)器LED 燈帶數(shù)量調(diào)整);光照強(qiáng)度變化時,DO 由轉(zhuǎn)子流量計進(jìn)行調(diào)整穩(wěn)定,通過添加NaHCO3提供堿度以保證反應(yīng)器內(nèi)pH 值穩(wěn)定.光合細(xì)菌投加量為10%,其他實(shí)驗條件與運(yùn)行參數(shù)同1.2,單因素試驗運(yùn)行天數(shù)為16d.

1.4 分析項目及檢測方法

1.4.1 常規(guī)理化指標(biāo)測定 采集水樣經(jīng)過0.45μm水相濾膜過濾后用于理化指標(biāo)測定.理化指標(biāo)測定方法參照《水和廢水監(jiān)測分析方法(第四版)》[12],對CODCr、NH4+-N、NO2--N、NO3--N、TP、TN 進(jìn)行檢測.采用便攜式水質(zhì)分析儀(WTW-Multi3420)對DO 進(jìn)行測定,采用pH 計(PHS-25)對pH 值監(jiān)測.

1.4.2 DNA 提取、PCR 擴(kuò)增和高通量測序 將樣品加干冰運(yùn)輸至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成DNA 提取、PCR 擴(kuò)增和16S rRNA 基因測序.細(xì)菌DNA的提取利用E.Z.N.A.? soil試劑盒完成[13];利用 338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和806R(5'GGAC-TACHVGGGTWTCTAAT -3')引物以V3～V4 可變區(qū)為對象,在此基礎(chǔ)之上展開相應(yīng)的PCR 擴(kuò)增[14],程序如下:95°C 的溫度條件下預(yù)變性,此環(huán)節(jié)所對應(yīng)的時間為3min,循環(huán)的次數(shù)則設(shè)定為27 個,72°C 的溫度條件下延伸,此環(huán)節(jié)所對應(yīng)的時間為10min.擴(kuò)增體系20μL,4μL 5×FastPfu(5 倍濃度)緩沖液,2μL 2.5mmol/L dNTPs,引物(5μmol/L)在該體系中所需添加量具體為0.8μL,FastPfu 聚合酶在該體系中所需添加量具體為0.4μL;DNA 模板在該體系中所需添加量具體為10ng.利用2%瓊脂糖凝膠電泳,檢測PCR 產(chǎn)物,3μL 上樣檢測電泳圖.通過Miseq PE300 進(jìn)行測序,基于Trimmomatic 來操控原始序列數(shù)據(jù),后續(xù)拼接在此次實(shí)驗中采用的軟件為FLASH[15].利用PICRUSt2 預(yù)測微生物群落功能能力,并利用KEGG 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋,對微生物群落和氮代謝功能進(jìn)行預(yù)測.

1.5 數(shù)據(jù)分析與處理

高通量測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析利用Majorbio 公司的i-sanger 平臺進(jìn)行.測序得到的PE reads 首先根據(jù)overlap 關(guān)系進(jìn)行拼接,同時使用fastp(https://github.com/OpenGene/fastp,version 0.20.0)對序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過濾,使用 Mothur(versionv.1.30.1)軟件按97%的相似性將有效序列進(jìn)行 OTU 聚類,得到OTU(Operational Taxonomic Units)代表序列.采用RDP classifier 貝葉斯算法對OTU 代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析,并分別在各個分類水平統(tǒng)計樣本的群落物種組成,比對數(shù)據(jù)庫為Silva 數(shù)據(jù)庫.基于OTU 信息,使用Mothur v1.30.1 計算Shao 豐富度和Simpson指數(shù)[16].對OTU 豐度表進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,去除16S marker gene 在物種基因組中的copy 數(shù)目的影響;每個OTU對應(yīng)greengene id,獲得OTU 對應(yīng)的COG 家族信息和KEGG Ortholog(KO)信息;計算各COG 的豐度和KO 豐度.根據(jù)KEGG 數(shù)據(jù)庫的信息,獲得KO、Pathway、EC 信息,并根據(jù)OTU 豐度計算各功能類別的豐度.針對Pathway,運(yùn)用PICRUSt 可獲得代謝通路的3 個水平信息,分別得到各個水平的豐度表.將樣品序列抽平后使用q2-diversity 計算α 多樣性指數(shù).為獲得 OTUs 對應(yīng)的物種分類信息,基于QIIME 平臺和Silva 數(shù)據(jù)庫,采用RDP classifier 對OTUs 代表序列進(jìn)行物種分類注釋,并分別在各個分類水平統(tǒng)計樣本的群落組成.運(yùn)用 Origin8.5 和TBtools 進(jìn)行分析和制圖.水質(zhì)數(shù)據(jù)單因素方差分析和多重的比較采用SPSS22.0 進(jìn)行,利用Excel2016和Origin8.5 進(jìn)行分析和制圖.

2 結(jié)果與討論

2.1 PSBR 污染物去除效果及影響因素分析

2.1.1 PSBR 污染物去除性能變化 如圖2 所示,R3 和R4 反應(yīng)器穩(wěn)定運(yùn)行期間,平均出水CODCr濃度分別為49.35,36.63mg/L,F 檢驗法(方差分析)結(jié)果顯示,R1、R3 和R4 出水CODCr存在極顯著性差異(P<0.01),5%和10%光合細(xì)菌的投加強(qiáng)化了活性污泥對CODCr的去除.運(yùn)行穩(wěn)定時,R1～R5 反應(yīng)器平均出水 NH4+-N 濃度分別為 5.88,5.01,3.29,2.88,9.58mg/L.光合細(xì)菌通過光合作用和呼吸作用兩種代謝途徑吸收污水中的NH4+-N,為自身生長代謝提供能量[17],同時活性污泥的生長也需要吸收NH4+-N.反應(yīng)器運(yùn)行后期對TN 的去除效果均強(qiáng)于初期,推測光合細(xì)菌投加可能有助于細(xì)菌的反硝化作用,進(jìn)水中足夠的CODCr也有利于脫氮效率的穩(wěn)定[18],促進(jìn)了反應(yīng)器對TN 的去除效果.五組反應(yīng)器的除磷效果在培養(yǎng)的前16d 基本保持不變,可能是聚磷菌(PAOs)正處于適應(yīng)階段.運(yùn)行中期(19～46d),五組反應(yīng)器對TP 的去除均有不同程度的提高,其中R4 反應(yīng)器出水TP 由22d 的2.19mg/L 減少至46d 的0.74mg/L.

圖2 光合細(xì)菌投加量對(a)CODCr、(b)NH4+-N、(c)TN、(d)TP 去除效果Fig.2 Effect of photosynthetic bacteria dosing on(a) CODCr,(b) NH4+-N,(c) TN and(d) TP removal

圖3 pH 值、光強(qiáng)和DO 對NH4+-N、NO2--N、NO3--N 和TN 去除效果影響Fig.3 Effect of pH, light intensity and DO on NH4+-N,NO2--N, NO3--N and TN removal effects

2.1.2 PSBR 脫氮性能影響因素 實(shí)驗選用NH4Cl為唯一氮源,PSBR 系統(tǒng)進(jìn)水NH4+-N 濃度約為40mg/L.pH 值對PSBR 系統(tǒng)脫氮性能影響較為明顯,pH為5,6時,PSBR系統(tǒng)NH4+-N去除率僅為31.3%,48.2%,出水 TN濃度為 34.4,29.7mg/L,并有少量NO3--N 積累,系統(tǒng)硝化反應(yīng)受到抑制;pH 7,8 時,系統(tǒng)脫氮效果較好,出水TN 濃度為19.6,21.3mg/L;當(dāng)初始pH 值增加至9 時,NH4+-N 去除率為88.7%,出水NO3--N和TN濃度為21.82, 26.80mg/L,說明系統(tǒng)硝化性能最好,但反硝化進(jìn)程受到阻礙,出水TN 濃度并沒有降低.綜上,隨著pH提高,PSBR 系統(tǒng)出水TN濃度呈先降低后升高趨勢,從趨勢可以看出pH 值與出水NH4+-N濃度呈負(fù)相關(guān),與出水NO3--N濃度呈正相關(guān).光照強(qiáng)度為2000～5000lux,出水NH4+- N、NO3--N 和TN 濃度與光照強(qiáng)度呈正相關(guān),當(dāng)光照強(qiáng)度為5000lux時,NH4+-N 和TN 去除率最高,分別為84.86%和57.99%,NO3--N 積累量較低為8.94mg/ L.光照強(qiáng)度提高至6000lux 時,污染物出去率并無顯著提高,出水NH4+-N、NO3--N 和TN 濃度與光照強(qiáng)度為4000lux時無顯著差異(P>0.05).DO 濃度對PSBR 系統(tǒng)脫氮性能影響與pH 值趨勢相似,當(dāng)DO 為3mg/L 時,PSBR系統(tǒng)NH4+-N 和TN 去除率分別為78.74%,59.41%,TN出水濃度較低.DO濃度與出水NH4+-N濃度呈負(fù)相關(guān),與出水NO3--N 濃度呈正相 關(guān).

2.2 微生物群落多樣性與組成分析

2.2.1 微生物Alpha 多樣性 5 組樣品共獲得優(yōu)化序列469807 個,平均序列長度416bp,用于物種分類的OTUs 單元總計1411 個,分屬34 門、89 綱、211目、325 科、539 屬、871 種.Coverage 指數(shù)(樣品基因文庫覆蓋率)可以反映測序結(jié)果中微生物樣本庫的覆蓋范圍,本次測序Coverage 指數(shù)均大于99%,能準(zhǔn)確地反映出污泥樣品中微生物群落的真實(shí)生物特征.通過單樣本的Alpha 多樣性指數(shù)對R1～R5 樣品中活性污泥微生物群落多樣性和豐富度進(jìn)行分析(表1),常用四種指數(shù)分別為Chao1、Ace、Simpson和Shannon.Chao1 和Ace 指數(shù)反映了樣品中微生物菌群豐富度,Ace 指數(shù)可以估計群落中含有OTUs 數(shù)目[19],Simpson 和Shannon 指數(shù)反映了樣品中微生物菌群多樣性[20].R1～R5 樣本的Chao1 指數(shù)、Ace 指數(shù)和Shannon指數(shù)呈R5>R4>R3>R2>R1,且Simpson指數(shù)呈R1>R2>R3>R4>R5,說明投加光合細(xì)菌的活性污泥微生物豐富度和多樣性均高于活性污泥反應(yīng)器.

表1 微生物Alpha 多樣性指數(shù)Table 1 Table of microbial Alpha diversity indices

2.2.2 門水平微生物群落組成 如圖4 所示,5 組樣品中變形菌門Proteobacteria 為最優(yōu)勢菌門,其相對豐度占比分別為35.62%、34.70%、38.71%、45.92%和49.44%.Proteobacteria 是污水處理廠活性污泥中常見的優(yōu)勢菌群,較多數(shù)反硝化細(xì)菌和脫氮微生物屬于 Proteobacteria[21].R1～R5 五組樣品中Proteobacteria 相對豐度依次增加,是由于投加的光合細(xì)菌屬于變形菌門中 α 綱(紅螺菌目),Proteobacteria 的大量存在是保證反應(yīng)器能夠正常運(yùn)行的基礎(chǔ).擬桿菌門Bacteroidota 是一類化能有機(jī)營養(yǎng)菌,也是污水生物處理工藝中較常見的優(yōu)勢菌門,能參與有機(jī)物降解、反硝化、固氮等過程,其相對豐度占比分別為20.76%、15.59%、21.14%、19.34%和15.73%.Bacteroidota 具有較強(qiáng)的碳水化合物代謝能力,是降解CODCr的主要菌群.R3 和R4 樣品中較高的相對豐度占比為反應(yīng)器高效降解污染物提供良好的基礎(chǔ).

圖4 門水平微生物群落組成Fig.4 Microbial community composition at the phylum level

2.2.3 屬水平微生物群落組成 在屬水平上5 組樣品共鑒定出539 個菌屬.5 組樣品共有菌屬為373個,5 組樣品有23 個菌屬至少在1 組樣本中相對豐度大于1%,為樣品中的優(yōu)勢菌屬.投加光合細(xì)菌后,其對微生物的群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響(圖5).腐螺旋菌科Saprospiraceae 為最優(yōu)勢菌屬,其在五組樣品中的相對豐度占比分別為10.92%、7.37%、17.74%、12.4%和16.6%,其次為鳥氨酸球菌屬Ornithinibacter 和OLB12.紅假單胞菌屬Rhodopseudomonas 相對豐度占比分別為 1.99%、5.32%、7.18%、8.28%和2.23%.norank_f__Saprospiraceae 屬于嚴(yán)格好氧型細(xì)菌,兼具反硝化與除磷功能,能夠?qū)?fù)雜有機(jī)物降解為小分子碳源[22-24].Ornithinibacter 菌屬在污水處理維持微生物群落結(jié)構(gòu),保證了系統(tǒng)的穩(wěn)定運(yùn)行.OLB12 菌屬一般在污水處理系統(tǒng)中好氧池豐度較高,是一類好氧硝化優(yōu)勢菌屬,在缺氧條件下則無法發(fā)揮作用[25].硝化菌多為自養(yǎng)型微生物,可能受實(shí)驗環(huán)境影響,5 組樣本中AOB 種類較少,且各菌屬相對豐度較低.屬于亞硝化單胞菌科(Nitrosomonadaceae)的硝化單胞菌屬Nitrosomonas,是污水處理工藝中常見的AOB 菌屬.R1 中Nitrosomonas 的相對豐度為 0.18%,而在 R4 中相對豐度增加至 0.54%.Rhodopseudomonas 菌屬為本實(shí)驗所投加的光合細(xì)菌,成為微生物群落主要優(yōu)勢菌屬之一.R2～R4 樣品中Rhodopseudomonas 菌屬的相對豐度占比隨光合細(xì)菌投加量的增大而提高,較高的豐度占比對反應(yīng)器出水穩(wěn)定有良好的促進(jìn)作用.R5 樣品中Rhodopseudomonas 菌屬相對豐度占比較R4 樣品反而下降了6.05%,這可能是因為較大的光合細(xì)菌投加量對原有活性污泥微生物群落有較大的沖擊,破壞了其穩(wěn)定結(jié)構(gòu),最后導(dǎo)致Rhodopseudomonas菌屬相對豐度大幅下降.黃亮等[26]從石油煉化污水中篩選到1 株有機(jī)物高效降解菌B2,以其為特定微生物接種于活性污泥系統(tǒng)中,生物強(qiáng)化活性污泥系統(tǒng)對復(fù)配水污染物的去除,當(dāng)菌株投加量超過3%時,污水CODCr去除性能和可生化性下降,可能是污水中碳源不足,使活性污泥與B2 菌之間產(chǎn)生競爭關(guān)系.

圖5 屬水平微生物群落組成Fig.5 Composition of genus level microbial community

2.3 微生物群落功能變化分析

2.3.1 KEGG 功能代謝通路 與代謝相關(guān)的功能通路相對豐度均在77.9%以上,代謝功能較高占比反映了微生物新陳代謝是各類菌屬與環(huán)境之間主導(dǎo)的物質(zhì)和能量交換主要過程.不同光合細(xì)菌投加量下微生物群落代謝功能具有差異性(圖6).5 組樣本均得到45 條KEGG 第二等級代謝通路,但R2～R5中各代謝通路的豐度相應(yīng)地均高于R1.說明光合細(xì)菌增強(qiáng)了微生物群落代謝功能.樣本中碳水化合物代謝(Carbohydrate metabolism)豐度占總功能的7%～9%,碳水化合物代謝是細(xì)胞生長和繁殖所需的能量和碳元素來源[27],菌體內(nèi)的氨基酸代謝可以為氨基酸、核酸和維生素的生物合成提供前體細(xì)胞,而且還可以產(chǎn)生大量重要的芳香族化合物[28].這些代謝功能較高豐度是細(xì)胞賴以生長和繁殖的基礎(chǔ).能量代謝(Energy metabolism)、輔助因子和維生素代謝(Metabolism of cofactors and vitamins)和翻譯(Translation)等同樣是活性污泥微生物的重要代謝途徑,其豐度分別在4.7%、4.4%和3.1%左右,幾乎處在一個相同的水平僅次于碳水化合物和氨基酸代謝,能量代謝是生命活動最基本的特征,是維持一切生命活動的必要條件[29].

圖6 KEGG 第二等級代謝通路注釋Fig.6 KEGG second-order metabolic pathway annotation

2.3.2 氮代謝性能變化 脫氮是活性污泥的重要功能之一,參與氮代謝的功能基因在廢水處理中起著至關(guān)重要的作用[30].本文利用PICRUSt2 對氮代謝通路及其相關(guān)功能基因進(jìn)行了預(yù)測分析,通過與KEGG 庫中65 個直系同源基因(KEGG Orthology)對比,5 組樣本均獲得48 個氮代謝功能基因.由于本實(shí)驗選用氯化銨為唯一氮源,活性污泥中存在著4種氮代謝途徑:硝化作用、反硝化作用、同化硝酸鹽還原、異化硝酸鹽還原.圖7 為主要氮代謝通路、功能基因及其豐度.探究光合細(xì)菌對活性污泥氮代謝作用的影響,發(fā)現(xiàn)硝化過程中涉及的相關(guān)功能基因有amo(amoA/B/C)、hao 和nxr(nxrA/B). amo 基因編碼的氨單加氧酶(AMO)能將NH4+-N 氧化為NH2OH,同時NH2OH 在hao 基因編碼的羥胺氧化還原酶(HAO)催化下迅速氧化為NO2--N,nxr 基因編碼的亞硝酸鹽氧化還原酶(NXR)能最終將NO2--N氧化為NO3--N.在硝化過程中,NXR功能基因nxr 保持很高的豐度.NXR 是一個具有多重功能的酶,既可以催化亞硝酸鹽的氧化,還可以催化硝酸鹽的還原.amo 基因豐度與氨氧化速率呈正相關(guān)[31],AMO 和HAO 催化發(fā)生的氨氧化是硝化過程的限速步驟[32].光合細(xì)菌的投加使參與硝化過程的基因豐度明顯提高,加快氨氧化速率,推動硝化過程的進(jìn)行.與反硝化過程有關(guān)的基因包括nar(narG/H/I)、nap(napA/B/C) 、 nxr(nxrA/B) 、 nor(norB/C) 與nosZ.nar 和nap 基因是參與反硝化過程第一步反應(yīng)的兩種關(guān)鍵基因,能分別編碼不同類型異化硝酸鹽還原酶,將NO3--N 還原為NO2--N.nir 基因編碼的亞硝酸鹽還原酶(NIR)可進(jìn)一步將NO2--N 還原為NO,nor 和nosZ 基因分別編碼一氧化氮還原酶(NOR)和一氧化二氮還原酶(NOS),對應(yīng)的參與NO還原和N2O 還原過程,使得反硝化的最終完成.同時,活性污泥中還存在大量有關(guān)異化硝酸鹽還原過程的基因(nirB/D、nrfA/H)與同化硝酸鹽還原過程的基因(narB、NR、nasA/B、nirA).異化硝酸鹽還原可作為微生物的呼吸作用,同化硝酸鹽還原可將氮素轉(zhuǎn)化為生物質(zhì)[33],這兩個過程最終都將NO2--N還原為NH4+-N.

2.4 討論

2.4.1 投加量及環(huán)境因子對PSBR性能影響 光合細(xì)菌投加量是影響PSBR 污染物去除的關(guān)鍵因素,生物處理系統(tǒng)內(nèi)含有較為龐大微生物群體,在它們的協(xié)同作用下可使微生物群落功能基因和通路豐度增加.Yao 等[34]提出菌株投加量是生物處理技術(shù)成功的有效策略.投加量過少,光合細(xì)菌較難適應(yīng)外界環(huán)境變化,或者在和活性污泥土著微生物競爭營養(yǎng)物質(zhì)時衰亡,導(dǎo)致投加菌株接種率降低使污染物去除效果不明顯[35],在本研究R2 反應(yīng)器中紅假單胞菌屬Rhodopseudomonas(本實(shí)驗投加的光合細(xì)菌)相對豐度占比較低,未形成最優(yōu)勢菌屬;過量光合細(xì)菌會超額吸收污水中的碳源,抑制活性污泥正常生長代謝功能,影響PSBR 硝化反硝化性能,對活性污泥微生物群落結(jié)構(gòu)和功能造成嚴(yán)重破壞[36].在本實(shí)驗中15%投加量的R5 中微生物群落功能基因豐度和微生物多樣性降低很好地驗證了這一結(jié)論;綜上所述,適當(dāng)?shù)墓夂霞?xì)菌投加量會在一定程度上提高微生物對有機(jī)物污染物降解效果.

pH 值、光照和DO 是PSBR 脫氮性能的重要影響因子.利用活性污泥法處理污水時,pH 值的變化對微生物的生命活動有很大的影響,本研究中,pH 值與NH4+-N 去除率呈顯著正相關(guān)(P<0.05),與NO3--N 去除率呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05).在好氧硝化過程中,酸性條件下過量的H+會抑制硝化細(xì)菌的活性,從而減慢氨氧化和硝化速率,且硝化階段會消耗一定的堿度,過低的pH 無法保證充足的堿度,導(dǎo)致NH4+-N 去除率偏低[37].衛(wèi)燕紅等[38]研究顯示光合細(xì)菌生長受pH 值影響顯著,初始pH5 和9 時,光合細(xì)菌菌生長緩慢,當(dāng)pH7～8 時,生長速度最快,活菌數(shù)最高,光合細(xì)菌適合在中性或弱堿環(huán)境中生存.綜上,pH 值可直接影響活性污泥微生物硝化和反硝化進(jìn)程,改變PSBR系統(tǒng)脫氮性能.

光合細(xì)菌是一種光合革蘭氏陰性原核生物,通過胞內(nèi)葉綠素和類胡蘿卜素等各種光合色素進(jìn)行無氧光合作用,將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能,用于其重要的細(xì)胞代謝活動[39].在適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi),隨著光強(qiáng)的增加,光合細(xì)菌可快速生長,當(dāng)光強(qiáng)超過一定限度時,能量供應(yīng)超過了細(xì)胞內(nèi)酶的能力,導(dǎo)致光轉(zhuǎn)換效率隨光強(qiáng)的增加而降低[40].本研究中PSBR 系統(tǒng)污染物去除率與光照強(qiáng)度呈正相關(guān),但光照強(qiáng)度存在閾值,當(dāng)光照強(qiáng)度為6000lux 時,PSBR 系統(tǒng)污染物去除率并無明顯提高.光照強(qiáng)度對PSBR 運(yùn)行的影響基本與前人研究結(jié)論相吻合.在污水生物處理過程中,DO 水平高低密切影響硝化和反硝化進(jìn)程,DO濃度較高,污泥活性高且微生物代謝旺盛,有機(jī)物去除速率較快.當(dāng)同時考慮硝化反硝化反應(yīng)及有機(jī)物去除時,硝化細(xì)菌比增長速率受DO 濃度影響不可忽視,研究顯示活性污泥中硝化細(xì)菌約占5%左右,大部分硝化細(xì)菌處在生物絮凝體內(nèi)部.增加DO 濃度,生物絮凝體穿透能力也將增加,硝化反應(yīng)速率會被提高,生物反硝化過程必須保證嚴(yán)格缺氧環(huán)境,氧和硝酸鹽會同時競爭電子供體,硝酸鹽還原酶的合成及其活性也同時受到分子態(tài)氧的抑制影響[41].

2.4.2 PSBR 微生物群落組成與功能解析 門水平上變形菌門、擬桿菌門、放線菌門、綠彎菌門和厚壁菌門為優(yōu)勢菌群(圖4),這與已有研究的結(jié)果較吻合[42].有研究認(rèn)為變形菌門能調(diào)節(jié)微生物群落結(jié)構(gòu),其在有機(jī)物和氨氮去除中發(fā)揮著重要作用[43].本研究中變形菌門在 SBR 和 PSBR 中占比都較高(34.70%～49.44%),且豐度無顯著變化(P>0.05),說明光合細(xì)菌投加不會改變微生物群落最優(yōu)勢菌門種類,變形菌門中具備氮素轉(zhuǎn)化功能的氨氧化細(xì)菌、亞硝酸鹽氧化菌和反硝化菌等,在PSBR 系統(tǒng)脫氮上發(fā)揮重要作用.SBR 和PSBR 中前四優(yōu)勢菌門相對豐度呈現(xiàn)顯著差異(P<0.05).有研究表明,擬桿菌門也參與降解有機(jī)物、反硝化和固氮等過程,并在促進(jìn)污泥成熟穩(wěn)定方面發(fā)揮作用[44].光合細(xì)菌投加使放線菌門和綠彎菌門相對豐度顯著升高(P<0.05),使R3 和R4 反應(yīng)器取得較好的脫氮效果.

光合細(xì)菌投加提高了活性污泥微生物群落多樣性和豐富度,這與已有的研究結(jié)果一致.有研究顯示污水處理系統(tǒng)中存在能夠分泌信號分子的菌體,菌間具有群體感應(yīng)現(xiàn)象,當(dāng)引入外源工程菌株進(jìn)行生物強(qiáng)化使種群密度達(dá)到感應(yīng)閾值,從而激活相關(guān)基因的表達(dá),調(diào)控菌群生態(tài)關(guān)系.光合細(xì)菌投加可能使PSBR 系統(tǒng)內(nèi)微生物群體感應(yīng)信號增強(qiáng),促進(jìn)了細(xì)胞間信息傳遞與交流,提高微生物生長代謝活性,使微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化.

利用PICRUSt2 對系統(tǒng)運(yùn)行穩(wěn)定時細(xì)菌群落功能進(jìn)行預(yù)測(圖6).SBR 和PSBR 一級功能層基因豐度無顯著差異(P>0.05),主要功能基因均為有機(jī)系統(tǒng)及代謝相關(guān)功能,說明有機(jī)系統(tǒng)和代謝在反應(yīng)器穩(wěn)定運(yùn)行過程中起著極其重要的作用.SBR 和PSBR二級功能層的功能基因豐度存在差異,氨基酸代謝和硝化系統(tǒng)等功能基因豐度較高.本研究中進(jìn)水為人工配水,提供無機(jī)氮源和碳源,整個過程主要是硝化菌和反硝化菌及其相關(guān)功能菌的富集過程,其它菌群被淘汰或者活性處于較低水平,這可能是功能基因豐度變化的原因之一.SBR 和PSBR 中微生物細(xì)菌參與氮素代謝的相關(guān)功能基因,共48 個KO 注釋為氮代謝.由于本實(shí)驗選用氯化銨為唯一氮源,活性污泥中存在著4 種氮代謝途徑:硝化作用、反硝化作用、同化硝酸鹽還原、異化硝酸鹽還原.光合細(xì)菌刺激下使絕大部分氮代謝功能基因豐度增加,表明生物強(qiáng)化提升了活性污泥的整體氮代謝潛力.

3 結(jié)論

3.1 10%光合細(xì)菌投加下反應(yīng)器對 CODCr、NH4+-N 和TN 去除率優(yōu)于對照組,光合細(xì)菌與活性污泥微生物提高了PSBR 系統(tǒng)染物去除性能.

3.2 光合細(xì)菌投加使活性污泥系統(tǒng)微生物群落結(jié)構(gòu)和特定微生物豐度產(chǎn)生差異,微生物群落豐富度和多樣性得到提升.光合細(xì)菌有利于norank_f__Saprospiraceae、Ornithinibacter 和OLB12 等功能菌屬的生長富集,為系統(tǒng)高效脫氮提供了良好菌群基 礎(chǔ).

3.3 光合細(xì)菌能促進(jìn)活性污泥微生物功能基因表達(dá)的上調(diào),特別是新陳代謝和群體感應(yīng)等方面,通過調(diào)節(jié)信號傳導(dǎo)機(jī)制改善菌群互作關(guān)系和部分功能代謝通路.光合細(xì)菌還能夠提升關(guān)鍵氮代謝基因(amo、hao 和nap 等)和酶(AMO、HAO 和NAP)的豐度,使得活性污泥微生物在環(huán)境中硝化/反硝化潛在能力增強(qiáng).