溫度與負(fù)荷對(duì)Anammox 菌自富集啟動(dòng)的PDA 的影響

馬雨晴,王 博,李笑迪(北京工業(yè)大學(xué),城鎮(zhèn)污水深度處理與資源化利用技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室,北京市工程技術(shù)研究中心,北京 100124)

厭氧氨氧化工藝已經(jīng)被證明是可持續(xù)和節(jié)約能源的工藝,具有運(yùn)行能耗低,污泥產(chǎn)量少,溫室氣體排放少以及脫氮效率高等優(yōu)點(diǎn)[1-2].伴隨著厭氧氨氧化工藝在高氨氮廢水處理中成功應(yīng)用,研究者們開始致力于探索處理主流城市污水.由于厭氧氨氧化細(xì)菌生長緩慢,世代時(shí)間長,所以啟動(dòng)往往需要較長時(shí)間.厭氧氨氧化菌已被證明在不同類型的污泥中自富集,如普通活性污泥、短程硝化污泥、反硝化除磷污泥和厭氧消化污泥等,這就為厭氧氨氧化工藝的啟動(dòng)提供了新的策略.通過短程反硝化提供亞硝酸鹽實(shí)現(xiàn)厭氧氨氧化細(xì)菌自富集的方法已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模UASB 中得以證明[3].但是由于厭氧氨氧化細(xì)菌還存在對(duì)溫度、基質(zhì)濃度和有機(jī)物等環(huán)境敏感的特性[4],使得厭氧氨氧化工藝在污水處理廠中表現(xiàn)出來的脫氮性能和豐度并不理想[5-6].

厭氧氨氧化細(xì)菌最適宜的生存溫度為 30～40℃[7-9].當(dāng)溫度超過45℃的時(shí)候,厭氧氨氧化細(xì)菌的活性受到嚴(yán)重抑制[10].而當(dāng)溫度從33℃下降到15℃時(shí),氮去除速率明顯下降[11].側(cè)流污水處理過程通常具有較高的水溫(～30 ℃), 因此更有利于厭氧氨氧化活性的維持.相比而言,主流污水溫度隨季節(jié)變化較大(10～25 ℃), 這會(huì)對(duì)厭氧氨氧化細(xì)菌的活性產(chǎn)生較大的影響.溫度的降低對(duì)短程反硝化過程中亞硝酸鹽的積累影響不大[12-13].當(dāng)溫度在18.5～28.6℃變化時(shí),硝酸鹽到亞硝酸鹽的轉(zhuǎn)化率可以保持在90%,這就說明通過短程反硝化可以為厭氧氨氧化更好地提供亞硝酸鹽[14].基質(zhì)濃度也會(huì)影響厭氧氨氧化反應(yīng),亞硝酸鹽濃度過高會(huì)抑制厭氧氨氧化細(xì)菌的活性[15].因此在高氨氮廢水中,通常采用梯度提高進(jìn)水濃度的方式使厭氧氨氧化細(xì)菌適應(yīng)生活環(huán)境.厭氧氨氧化是無需有機(jī)碳源的工藝,而主流污水中含有的易降解有機(jī)物使得異養(yǎng)菌進(jìn)行生長代謝[9].相對(duì)于厭氧氨氧化相對(duì)緩慢的生長速率而言,異養(yǎng)細(xì)菌的生長速率較高,這可能使得厭氧氨氧化細(xì)菌處于劣勢地位,脫氮效果變差[16-17].因此自富集出的厭氧氨氧化細(xì)菌要想在城市污水處理廠中發(fā)揮作用,就要擁有相對(duì)穩(wěn)定性,能抵抗氮負(fù)荷、有機(jī)負(fù)荷變化以及溫度變化的沖擊.

本文通過運(yùn)行厭氧氨氧化細(xì)菌自富集啟動(dòng)的PDA 系統(tǒng),探究了溫度下降及負(fù)荷沖擊下長期脫氮性能的變化;然后通過16S rRNA 基因測序分析了微生物群落的變化;最后基于宏基因組測序分析研究了微生物種群中基因的表達(dá)情況.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)污泥與進(jìn)水

試驗(yàn)采用經(jīng)過兩月閑置的自富集的短程反硝化-厭氧氨氧化(PDA)污泥,為絮體-海綿填料污泥,其中海綿填料是是聚氨酯材質(zhì)的,邊長20mm,可以有效持留污泥.污泥接種后反應(yīng)器中的混合液懸浮固體濃度(MLSS)約為1500mg/L.

用投加氯化銨(NH4Cl),硝酸鈉(NaNO3)和乙酸鈉的人工配水作為進(jìn)水.進(jìn)水包含兩部分:含氨氮(NH4+-N)和有機(jī)物的原水以及硝酸鹽(NO3--N)廢水,每個(gè)階段的進(jìn)水濃度如表1 所示.進(jìn)水氮負(fù)荷由3.2gN/(m3·d)提高到 4.0gN/(m3·d),有機(jī)負(fù)荷由64gCOD/(m3·d)提高到80gCOD/(m3·d).礦物培養(yǎng)基的組成包含 KH2PO4(60mg/L) 、 MgSO4·7H2O(30mg/L)、CaCl2·2H2O(14mg/L)和KHCO3(150mg/L).微量元素溶液 A(g/L)含有 6.37EDTA·2Na 和9.15FeSO4·7H2O,而微量元素溶液 B(g/L)含有19.1EDTA·2Na,0.24CoCl2·6H2O, 0.25CuSO4·5H2O,0.22NaMoO4·2H2O,0.19NiCl2·7H2O,0.014H3BO4,0.4 3ZnSO4·7H2O , 0.99MnCl2·4H2O.

表1 系統(tǒng)的運(yùn)行模式和特點(diǎn)Table 1 Operational mode and characteristics

1.2 反應(yīng)器設(shè)置和運(yùn)行

采用上流式厭氧污泥床(UASB)反應(yīng)器,UASB的工作容積為2.5L,材質(zhì)為有機(jī)玻璃.反應(yīng)器配備蠕動(dòng)泵和pH/DO 在線監(jiān)測儀(德國 WTW340i).

UASB長期實(shí)驗(yàn)持續(xù)進(jìn)行了約115d,分為3個(gè)階段.第I 階段(1～20d)為短程反硝化-厭氧氨氧化污泥的恢復(fù)階段,第II 階段(20～40d)和第III 階段(40～115d)為提高進(jìn)水濃度階段,具體進(jìn)水濃度和水力停留時(shí)間(HRT)見表 1.除此之外,在第 III 階段中67～72d 中,為檢測厭氧氨氧化細(xì)菌活性,停止投加有機(jī)物,以NH4+-N 和亞硝酸鹽(NO2--N)為底物進(jìn)行了原位活性測試,同時(shí)通過饑餓的策略來提高厭氧氨氧化的貢獻(xiàn),降低其他異養(yǎng)細(xì)菌的競爭.整個(gè)實(shí)驗(yàn)不控制反應(yīng)器溫度,在自然降溫條件下進(jìn)行,反應(yīng)器的溫度由25℃逐漸下降到19 ℃.

圖1 試驗(yàn)裝置Fig.1 Schematic diagram of experimental device

1.3 分析方法

NH4+-N、NO2?-N 和NO3?-N,混合液懸浮固體濃度(MLSS)、混合液揮發(fā)性懸浮固體濃度(MLVSS)采用標(biāo)準(zhǔn)方法檢測,DO、pH 和溫度通過DO 和pH 探頭檢測.取反應(yīng)器的進(jìn)水以及出水水樣,所有水樣經(jīng)0.45μm 的中速濾紙過濾后進(jìn)測定.

在第34(第II 階段)、74(第III 階段)和114d(第III 階段)取出反應(yīng)器中的絮體污泥以及海綿填料樣品共6 個(gè),并將填料上的生物膜用沖洗的方式進(jìn)行剝離,進(jìn)行4000r/min 離心凍干處理.通過DNA 試劑盒(FastDNA Spin Kit for Soil)提取凍干污泥中的DNA,采用NanoDrop ND-1000 分光光度計(jì)對(duì)提取DNA 的純度和濃度進(jìn)行測定.通過16S rRNA 基因測序技術(shù)對(duì)反應(yīng)器內(nèi)不同階段的微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性進(jìn)行檢測.使用正向引物338F 和反向引物806R 用于擴(kuò)增細(xì)菌 16S rRNA 基因的V3-V4 區(qū).

進(jìn)行宏基因組學(xué)測序,將提取的6 個(gè)DNA 樣品被超聲處理成400bp 的片段,通過接頭連接,用于Illumina 測序和進(jìn)一步的PCR 擴(kuò)增.構(gòu)建文庫后,檢測文庫的插入尺寸,并使用Illumina 平臺(tái)進(jìn)行測序.對(duì)得到的原始序列進(jìn)行優(yōu)化處理,進(jìn)行物種和功能上的注釋以及分類.16S rRNA 基因測序和宏基因組學(xué)數(shù)據(jù)在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司在線平臺(tái)進(jìn)行處理分析(Shanghai Majorbio Bio-pharm Technology Co.,Ltd).

2 結(jié)果與討論

2.1 提高負(fù)荷對(duì)PDA 系統(tǒng)脫氮性能的影響

在第I 階段,為恢復(fù)其短程反硝化以及厭氧氨氧化性能,采用較低的進(jìn)水濃度,進(jìn)水 NH4+-N 和NO3?-N 分別為(10.1±0.5)mg/L 和(10.2±0.1)mg/L(圖2).運(yùn)行前2d,NH4+-N 濃度基本沒有下降,NO3?-N 下降7.0mg/L 左右,出水中并沒有NO2?- N 積累.這就說明在閑置過程中,短程反硝化和厭氧氨氧化細(xì)菌活性都被破壞.但是隨著反應(yīng)器的運(yùn)行,在第8～20d,出水中NH4+-N 從8.0mg/L 逐漸下降到2.6mg/L,NO3?-N濃度也逐漸下降到0.6mg/L.第I階段的氮去除效率從44.3%恢復(fù)到81%,出水總氮低于5.0mg/L.這就說明短程反硝化-厭氧氨氧化污泥活性恢復(fù),并在20d 時(shí)間恢復(fù)到閑置前水平.

圖2 UASB 中的NH4+-N、NO2?-N、NO3?-N、TN 和NRE 的變化Fig.2 Variations of NH4+-N、NO2?-N、NO3?-N、TN and NRE in UASB

在第II 階段,提高進(jìn)水總氮和有機(jī)物的濃度.進(jìn)水NH4+-N 和NO3?-N 分別提高到(24.9±0.5) mg/L和(25.7±0.4) mg/L,同時(shí)HRT 提高到12h.提高后可以看到在進(jìn)水總氮濃度提高的沖擊之下,出水中NH4+-N 和NO2?-N 的濃度都上升到8.0～9.0mg/L,短程反硝化-厭氧氨氧化反應(yīng)的NRE 又從81%下降到50%.但是隨著運(yùn)行在HRT 延長條件下,反應(yīng)器內(nèi)短程反硝化和厭氧氨氧化細(xì)菌逐漸適應(yīng)濃度升高的水質(zhì),脫氮效果有所上升.但是脫氮過程消耗的NO3?-N/NH4+-N 的比率異常低,出水NH4+-N 下降到0.5mg/L 時(shí)NO3?-N 還剩余10.0mg/L 左右,這可能是由于空氣滲入導(dǎo)致硝化作用發(fā)生.

在第III 階段,再次提高進(jìn)水氨氮,硝態(tài)氮和有機(jī)物的濃度,進(jìn)水總氮為100.0mg/L 左右,同時(shí)為了保證溫度降低情況下的脫氮效果延長了HRT.此時(shí)PDA 系統(tǒng)性能并沒有因?yàn)樨?fù)荷提高的沖擊而破壞,NRE 保持在相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài), 這可能也得益于水力停留時(shí)間延長對(duì)厭氧氨氧化細(xì)菌的持留.而且隨著HRT 的延長,也使得有機(jī)物對(duì)反應(yīng)器中的厭氧氨氧化細(xì)菌的負(fù)面影響降低.在綜合作用下,短程反硝化和厭氧氨氧化過程抗沖擊能力有所提升.

2.2 自然降溫對(duì)系統(tǒng)脫氮性能的影響

在第I 階段溫度變化幅度較小,在(25±1)℃范圍內(nèi)波動(dòng),因此短程硝化-厭氧氨氧化性能在較短時(shí)間內(nèi)得到恢復(fù),出水總氮濃度最低為3.7mg/L(圖2).在第II 階段溫度繼續(xù)下降由24.7℃到24℃,此時(shí)出水濃度波動(dòng)主要是由于負(fù)荷的沖擊,溫度逐漸下降過程中脫氮效果較穩(wěn)定,出水NRE 在逐漸穩(wěn)定在77%左右.

第III 階段溫度下降比較明顯,運(yùn)行10d 內(nèi)溫度從24℃下降到22.2℃,可能是由于溫度下降的沖擊,在第56～66d 出現(xiàn)了出水硝態(tài)氮升高的情況.這可能是由于厭氧氨氧化細(xì)菌活性受到溫度影響而下降,與此同時(shí)異養(yǎng)細(xì)菌占據(jù)主導(dǎo)地位.為了加強(qiáng)厭氧氨氧化細(xì)菌的效果,對(duì)反應(yīng)器中進(jìn)行饑餓處理.在第66d 停止投加有機(jī)物,進(jìn)水調(diào)整為 NH4+-N 和NO2?-N,濃度分別為(50.0±1.6) mg/L 和(50.5±2.4)mg/L.在溫度逐漸由23.6℃下降到19.4℃的過程中,出水中NH4+-N、NO2?-N 和NO3?-N 分別為(8.7±1.1),(9.3±0.9)和(10.8±0.8) mg/L.其中 NH4+-N 和NO2?-N 分別下降 42.3mg/L 和 41.2mg/L,消耗NO2?-N/NH4+-N 為 0.97,低于理論值.而生成的NO3?-N/NH4+-N 的比例為0.25 則比較接近理論值.根據(jù)計(jì)算可以得第 III 階段厭氧氨氧化的活性67.1mgN/(gVSS·d).饑餓處理完畢后,恢復(fù)進(jìn)水,出水NH4+-N 和NO3?-N 相比之前有所下降.這可能是由于系統(tǒng)已經(jīng)適應(yīng)環(huán)境溫度,異養(yǎng)細(xì)菌活性也在饑餓條件下得到抑制,進(jìn)而使得厭氧氨氧化脫氮能力增加,出水的NRE 最高達(dá)到89.9%.在77～100d,溫度繼續(xù)下降到18.7℃,反應(yīng)器的出水總氮濃度略有增加,NRE 下降到80%左右.在100d 之后NH4+-N 濃度下降到1.0mg/L以下,NO3?-N濃度在15.0mg/L左右,這有可能是厭氧氨氧化性能提高產(chǎn)生了更多的硝態(tài)氮.但是總體上,反應(yīng)器的脫氮性能較好,出水總氮在14.1mg/L 左右,NRE 恢復(fù)到85.9%左右.這就說明了通過自富集啟動(dòng)的厭氧氨氧化工藝在提高進(jìn)水負(fù)荷和溫度變化方面有一定的抵抗能力.

2.3 微生物群落變化分析

2.3.1 污泥樣品形態(tài) 本文是絮體和生物填料混合體系.通過粒度儀測得絮體污泥的平均粒徑為374μm,已經(jīng)形成較大的顆粒.在顯微鏡下對(duì)污泥進(jìn)行觀察,可以看到視野內(nèi)分布有較大的顆粒,在污泥顆粒內(nèi)部夾雜著淺紅色(圖3).對(duì)海綿中心部位切片后觀察,可以看到一些淺紅色的污泥分布在海綿的骨架上.由于厭氧氨氧化菌代謝過程中依賴于亞鐵血紅素c,則一般呈現(xiàn)為暗紅色[18],這可能是厭氧氨氧化在填料內(nèi)部中富集的證據(jù).

圖3 絮體污泥和生物填料的形態(tài)結(jié)構(gòu)(第110d)Fig.3 Morphological structure of floc sludge and bio-carriers(the 110th day)

2.3.2 多樣性和豐富度的分析 由表2 可知,根據(jù)足夠高的覆蓋率(>0.99),采樣深度足夠且真實(shí).Chao1 和ACE 的結(jié)果表明,相比于生物填料,絮體污泥中擁有更高的豐富度.此外,從Shannon、Simpson指數(shù)可以看出,隨著反應(yīng)器的運(yùn)行,填料中生物群落的多樣性增加,而絮體污泥中的多樣性減少.

表2 Shannon, Simpson, Ace 和Chao1 指數(shù)Table 2 Shannon, Simpson, Ace, and Chao1 indices

2.3.3 微生物群落分析 通過16S rRNA 分析了微生物群落的結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài).主要的門為Proteobacteria,Bacteroidetes, Chloroflexi, Planctomycetota(圖4).Proteobacteria 與短程反硝化有關(guān),在絮體污泥中的占比逐漸由34.3%提高到58.7%,在PDA系統(tǒng)中占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢[19].其中Thauera 菌屬是將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽的主力[20-21],在絮體污泥中的豐度最高可達(dá)15.7%,但在生物膜中的豐度僅為0.03%,這是由于相比于生物膜,Thauera 菌更傾向于生長在絮體污泥中,這與其他試驗(yàn)結(jié)果相同[21-22].Chloroflexi 和Bacteroidota 在形成聚集體和生物膜方面發(fā)揮了重要作用,在絮體和顆粒污泥中都占一定比例.厭氧氨氧化菌所在的Planctomycetes[23-24],相對(duì)豐度從第I階段的7.5%和4.7%下降到第III 階段的3.1%和3.8%,這可能是由于進(jìn)水濃度或者溫度下降提高對(duì)其產(chǎn)生了沖擊. Candidatus Brocadia 作為唯一檢測到的厭氧氨氧化細(xì)菌,其在第II 階段生物膜中的相對(duì)豐度達(dá)到3.7%,這個(gè)豐度甚至超過某些接種厭氧氨氧化細(xì)菌啟動(dòng)的反應(yīng)器中的豐度[25],并且在自富集厭氧氨氧化細(xì)菌的反應(yīng)器中也處于較高水平[26-27].在III 階段可能受到溫度和有機(jī)物的影響,豐度有所下降但是其脫氮效果并沒有惡化.重要硝化細(xì)菌Nitrosomonas 和Nitrospira 在UASB 中的豐度都低于1%.

圖4 門和屬水平上的微生物群落分布Fig.4 Microbial community distribution at the phylum and genus levels

2.4 關(guān)鍵功能基因分析

圖5 中,與新陳代謝相關(guān)的功能基因占比最高,達(dá)到了50.0%左右,與氮循環(huán)相關(guān)的能量代謝功能就被包含在其中.

圖5 系統(tǒng)功能占比以及與氮循環(huán)相關(guān)基因的表達(dá)Fig.5 Proportion of system functions and expression of genes related to nitrogen cycle

在UASB中的生物膜和絮體中都觀察到硝酸鹽轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽的關(guān)鍵基因細(xì)胞質(zhì)硝酸還原酶(Nar)、周質(zhì)硝酸還原酶(Nap),顯示了硝酸鹽轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為厭氧氨氧化富集的潛在途徑. Nar基因根據(jù)Reads Number 計(jì)算的豐度值之和為83945,說明短程反硝化有關(guān)基因表達(dá)程度較高.亞硝酸銅還原酶(NirK)和細(xì)胞色素cd1 亞硝酸還原酶(NirS)可以將亞硝酸鹽還原為一氧化氮,是發(fā)生厭氧氨氧化反應(yīng)的其中一個(gè)重要過程[28].肼脫氫酶(Hdh),肼合酶(Hzs)作為厭氧氨氧化過程中的最重要的兩種酶都可以被檢測到,豐度分別為1118 和12050,這就說明厭氧氨氧化在其中發(fā)揮重要作用.NirS 的豐度值為32190,這表明在亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為一氧化氮的表達(dá)程度較高.與反硝化相關(guān)的一氧化氮還原酶(NorBC),一氧化二氮還原酶(NosZ)也都可以檢測到,說明反硝化過程在UASB的脫氮過程中也做出了貢獻(xiàn).與硝化相關(guān)的基因AmoABC 都處在非常低的水平,這與微生物群落檢測結(jié)果相同,這說明了氨氮主要是通過厭氧氨氧化反應(yīng)去除的.

2.5 關(guān)于自富集PDA 系統(tǒng)穩(wěn)定性的討論

厭氧氨氧化種泥通常作為接種污泥的一部分,以加速自養(yǎng)脫氮系統(tǒng)的啟動(dòng).但它會(huì)在一定程度上增加實(shí)際應(yīng)用中的投資和操作的復(fù)雜性,而且大量的厭氧氨氧化種泥獲取困難.相比之下,厭氧氨氧化細(xì)菌的自富集將是一種更實(shí)用、更有效的操作策略.然而,將厭氧氨氧化直接應(yīng)用于主流工藝通常受到低溫、低氨濃度和高有機(jī)物濃度的阻礙.因此自富集的厭氧氨氧化細(xì)菌對(duì)環(huán)境變化的抵抗能力決定了其能否在實(shí)際工程中順利應(yīng)用.

本文中采用厭氧氨氧化菌自富集啟動(dòng)的PDA系統(tǒng)在主流污水中實(shí)現(xiàn)了深度脫氮,總氮去除率達(dá)到89.9%,并且發(fā)現(xiàn)在溫度以及負(fù)荷的變化時(shí)自富集啟動(dòng)的氨氧氨氧化工藝仍然具有較好的穩(wěn)定性.這可能是因?yàn)橄啾扔诮臃N處理高氨氮廢水富集的厭氧氨氧化細(xì)菌而言,自富集的厭氧氨氧化污泥更加適應(yīng)主流污水環(huán)境.而且生物填料和絮體相結(jié)合的形式有更好的魯棒性,可以更好的抵抗沖擊和低溫的影響.在整個(gè)運(yùn)行過程中亞硝酸鹽的產(chǎn)生充足的同時(shí)消耗有機(jī)物,消除有機(jī)物對(duì)厭氧氨氧化的不利影響.此外,整個(gè)操作過程中的較長污泥停留時(shí)間有效保留了厭氧氨氧化細(xì)菌,使得功能微生物Candidatus Brocadia 細(xì)菌得到富集.

Wang 等[29]通過16S rRNA 測序發(fā)現(xiàn)在水廠的各個(gè)單元均有厭氧氨氧化菌的存在,且能夠發(fā)揮脫氮作用.Lou 等[30]也發(fā)現(xiàn)厭氧氨氧化菌在大規(guī)模AAO 氧化溝過程中的富集.因此全規(guī)模污水處理廠中檢測到的厭氧氨氧化細(xì)菌豐度為將厭氧氨氧化直接整合到主流處理中并實(shí)現(xiàn)深度脫氮提供了一定可行性.但是由于厭氧氨氧化細(xì)菌自身特性,其在污水處理廠中發(fā)揮出的脫氮能力并不能確定.本研究在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的反應(yīng)器中對(duì)自富集厭氧氨氧化系統(tǒng)的性能進(jìn)行的探究取得了較理想的結(jié)果.但是對(duì)于自富集厭氧氨氧化細(xì)菌在污水處理廠中如何發(fā)揮深度脫氮的作用仍然需要繼續(xù)探究.

3 結(jié)論

3.1 在溫度由25℃下降到19℃的條件下,UASB 進(jìn)水總氮濃度由20mg/L 提高到100mg/L,總氮去除率最高可達(dá)到89.9%以上,說明短程反硝化-厭氧氨氧化反應(yīng)能夠保持一定的穩(wěn)定性.

3.2 Candidatus Brocadia 和Thaurea 分別為主要的厭氧氨氧化菌和短程反硝化菌.生物填料中厭氧氨氧化細(xì)菌相對(duì)豐度達(dá)到3.7%,絮體污泥中Thaurea相對(duì)豐度最高達(dá)15.7%.

3.3 與短程反硝化相關(guān)的基因Nar,Nap 和與厭氧氨氧化相關(guān)的Nir,Hzs 和Hdh 基因表達(dá)程度較高.