鵝骨鮮味肽的發(fā)酵工藝優(yōu)化及多肽組學(xué)分析

馮芯蕊，王冉，章寶，張?jiān)苿P，2，蔡克周*

（1.合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，安徽 合肥 230031；2.安徽鵝門在鮮食品科技有限公司，安徽 合肥 231131）

中國是世界上較大的鵝養(yǎng)殖生產(chǎn)國之一，年產(chǎn)量達(dá)數(shù)百萬噸。同時(shí)，也會(huì)產(chǎn)生數(shù)量龐大的副產(chǎn)物如鵝骨、鵝血等。鵝骨，作為主要副產(chǎn)物含有肽、氨基酸和鈣、磷、鐵等豐富的礦物質(zhì)，以及具有特殊風(fēng)味的脂肪酸、人類所必需的維生素等其他營養(yǎng)物質(zhì)[1]。然而，中國對(duì)骨資源的綜合利用起步較晚，多數(shù)還停留在傳統(tǒng)加工方式上，比如將鮮骨粉碎成骨粉當(dāng)作飼料或肥料，甚至直接丟棄。這不僅造成了優(yōu)質(zhì)骨資源的浪費(fèi)，還會(huì)造成一定程度的環(huán)境污染。因此，提取這些營養(yǎng)物質(zhì)并充分利用是鵝骨高值化利用的重要途徑。

研究表明，鵝骨中富含多種可溶性蛋白質(zhì)，具有提取生物活性肽的潛力。例如，Zhang 等[2]利用牛骨制備出的膠原蛋白肽-鈣螯合物（collagen peptide-calcium chelate，CPs-Ca）具有良好的熱加工穩(wěn)定性，且在胃腸道中可以穩(wěn)定消化，該研究為制備新型鈣補(bǔ)充劑提供了科學(xué)依據(jù)，提高了牛骨的高值化利用率；Ding 等[3]從鰹魚（Katsuwonuspelamis）骨中獲得了抗氧化膠原蛋白肽，其可有效清除DPPH 自由基、超氧陰離子自由基和ABTS+自由基，能夠廣泛應(yīng)用于食品、化妝品和制藥等行業(yè)；Luo 等[4]從大西洋鮭魚骨中提取出了膠原蛋白肽（CPs），其具有抗炎作用，可以有效阻止骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)一步發(fā)展。然而，目前利用鵝骨加工鮮味肽的研究鮮見報(bào)道。

鮮味肽是近年來提出的一種新型鮮味物質(zhì)，不僅呈鮮味，而且可以與NaCl、味精（monosodium glutamate，MSG）協(xié)同增鮮[5-6]，還可以通過美拉德反應(yīng)增強(qiáng)食品原有風(fēng)味[7]。由于鮮味肽具有誘人的口感、良好的加工屬性和營養(yǎng)價(jià)值，人們從豆類、菇類、發(fā)酵產(chǎn)品等不同食物來源中發(fā)現(xiàn)了大量鮮味肽。例如，Zhao等[8]通過乙醇沉淀和大孔樹脂法，結(jié)合感官評(píng)價(jià)，首次從腌制蠶豆中發(fā)現(xiàn)了7 種新型鮮味肽，增強(qiáng)了鮮味和咸味；Kong 等[9]從香菇水解液中分離、鑒定出2 個(gè)三肽和3 個(gè)二肽，并通過感官評(píng)價(jià)結(jié)合電子舌分析確定了肽的鮮味強(qiáng)度；Wang 等[10]從干腌西班牙鯖魚中分離出4 條有增鮮作用的鮮味肽。此外，鑒于攝入過量味精在一定程度上會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生潛在的不利影響[11]，人們?cè)絹碓揭庾R(shí)到鮮味肽作為天然風(fēng)味來源的重要性。因此，從不同食物中獲取有價(jià)值的鮮味肽成為研究的重點(diǎn)。

鮮味肽的常見制備方法有酶解法、化學(xué)合成法、基因工程法、微生物發(fā)酵法等。例如，Shen 等[12]利用風(fēng)味蛋白酶和木瓜蛋白酶從豬骨中分離并鑒定出了5 種鮮味肽。酶解法在工業(yè)上應(yīng)用廣泛，但產(chǎn)品會(huì)存在不良風(fēng)味[13]；化學(xué)合成法不易控制，產(chǎn)品得率低，實(shí)際生產(chǎn)受限；基因工程法表達(dá)目標(biāo)肽的技術(shù)尚未成熟，有待進(jìn)一步研究。利用微生物發(fā)酵可以提供多種多樣的蛋白酶，而不僅僅是某個(gè)單一的酶發(fā)揮作用，且蛋白酶活性高，從而可以使前體蛋白分解成不同序列和大小的肽[14]，生產(chǎn)成本低、產(chǎn)量高、便于工業(yè)化生產(chǎn)和大規(guī)模推廣[15]，是制備鮮味物質(zhì)的一種經(jīng)濟(jì)有效且安全的方法[16]。乳酸菌屬和葡萄球菌屬都是蛋白酶分泌能力較強(qiáng)的菌種[17-18]，理論上會(huì)有較高的多肽得率，是理想的發(fā)酵菌種。發(fā)酵過程中還存在很多其他因素的影響，要得到更多鮮味肽就必須控制發(fā)酵條件。

基于質(zhì)譜的代謝組學(xué)、蛋白組學(xué)、多肽組學(xué)等分析研究在食品、生物、醫(yī)藥等各個(gè)領(lǐng)域發(fā)揮重要作用?；诙嚯慕M學(xué)制備食源性鮮味肽成為食品科學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)研究內(nèi)容[19]。本研究以鵝骨為原料，利用乳酸菌屬和葡萄球菌屬進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵以制備鮮味肽，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析，探究底物添加量、菌株接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間對(duì)可溶性肽含量和鮮味強(qiáng)度的影響，優(yōu)化其發(fā)酵條件，并在最優(yōu)工藝條件下對(duì)多肽進(jìn)行鑒定及多肽組學(xué)分析，以期為鵝骨的精深加工與高值化應(yīng)用、研發(fā)新型食品鮮味添加劑、畜禽副產(chǎn)物的綜合利用提供新思路，為多肽組學(xué)在食品研究中的應(yīng)用提供方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌[（Lactobacillusplantarum，LP）LP-7、LP-9、LP-12]、木糖葡萄球菌（Staphylococcusxylosus，SX）SX-14、戊糖片球菌（Pediococcuspentosaceus，PP）：合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院肉品加工與健康創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)微生物實(shí)驗(yàn)室保藏；白鵝：安徽鵝門在鮮食品科技有限公司。

MRS 培養(yǎng)基、MRS 肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂（nutrient agar，NA）培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯（nutrient broth，NB）培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）、甲醇、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、四硼酸鈉、β-巰基乙醇（均為分析純）、乙腈（acetonitrile，ACN）、甲酸（formic acid，F(xiàn)A）（均為色譜級(jí)）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；絲氨酸（分析純）：北京索萊寶試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平（AL204 型）、精確天平（GB/T 23111）：梅特勒托利多科技有限公司；華布斯藥材粉碎機(jī)（800C型）：東莞市華太電器有限公司；疊加式振蕩培養(yǎng)箱（單層Esci-2010 型）：安徽尚科質(zhì)儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī)（Sigma3-30N 型）：德國Christ 公司；酶標(biāo)儀（H1型）：美國佛蒙特州維諾斯基博騰儀器公司；味覺傳感系統(tǒng)電子舌（SA402B 型）：日本智能傳感器技術(shù)有限公司；高效液相色譜儀（EASYnLC1200 型）、質(zhì)譜儀（QExactive HFX）：美國Thermo 科技公司；超凈工作臺(tái)（KLCZ-880A 型）：北京亞泰科隆儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鵝骨預(yù)處理

將鵝骨洗凈后剁成小塊，去除肌肉、筋腱和軟骨等非骨成分。通過反復(fù)蒸煮去除上層油脂，然后在80 ℃條件下烘干至完全干燥。最后，使用高速粉碎機(jī)將骨頭粉碎，得到骨粉（發(fā)酵底物），并儲(chǔ)存在4 ℃冰箱中待用。

1.3.2 發(fā)酵菌株種子液的制備

在無菌超凈臺(tái)中將保存于甘油保藏管中的LP-7、LP-9、LP-12、SX-14 和PP 用無菌接種環(huán)取出，分別接種于對(duì)應(yīng)的肉湯培養(yǎng)基（LP-MRS、SX-NB、PP-MRS）中，在35 ℃、130 r/min 條件下活化24 h，然后分別取出于相同條件下二次活化12 h，使培養(yǎng)基中的菌體濃度都達(dá)到109CFU/mL，得到各菌株的種子液。

1.3.3 鵝骨發(fā)酵液和粗肽的制備以及發(fā)酵菌株的選擇

將活化后的種子液在8 500 r/min，4 ℃條件下離心15 min，收集沉淀并用無菌生理鹽水洗滌2 次，然后將各菌株洗滌后的菌液依次接入發(fā)酵培養(yǎng)基，在35 ℃、150 r/min 條件下發(fā)酵24 h。發(fā)酵培養(yǎng)基配方：以100 mL 發(fā)酵液為基準(zhǔn)，骨粉4%（4 g），蔗糖2%（2 g），種子液3%（3 mL）。發(fā)酵24 h 后取出發(fā)酵液，在85 ℃條件下水浴加熱15 min 以滅酶，然后在12 000×g、4 ℃條件下離心10 min，取上清液于-20 ℃條件下保存待用。

將各菌株的發(fā)酵液按上述方法處理后，分別測定其發(fā)酵液中的多肽濃度，選擇多肽濃度最高的菌株確定為發(fā)酵菌株。采用發(fā)酵菌株在上述條件下對(duì)鵝骨進(jìn)行發(fā)酵并對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行滅酶、離心10 min（12 000×g，4 ℃）處理，取出上清液用0.45μm 微孔濾膜過濾，得到濾液即為鵝骨鮮味肽粗肽溶液，凍干后于-80 ℃儲(chǔ)存。

1.3.4 指標(biāo)測定

1.3.4.1 多肽濃度

參考魯偉等[20]和Yu 等[21]的方法并略作修改，采用OPA 法測定多肽濃度。

溶液的配制：0.6 mol/L TCA 溶液：準(zhǔn)確稱取9.8 g TCA 固體溶于100 mL 蒸餾水；OPA 試劑：A 液（40 mg OPA 溶于1 mL 甲醇）與B 液（100μL β-巰基乙醇、0.5 g SDS、0.95 g 四硼酸鈉溶于50 mL 蒸餾水）混合。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：依次配制濃度為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL 的絲氨酸（Ser）標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別按Ser∶OPA 為1∶20（體積比）混合，避光反應(yīng)2 min 后于340 nm 下測定OD 值，以第一組（0 mg/mL Ser）為空白對(duì)照，Ser 濃度為橫坐標(biāo)x（mg/mL），OD 值為縱坐標(biāo)y，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

多肽濃度的測定：取處理后的發(fā)酵上清液1 mL，加入2.2 mL 0.6 mol/L TCA 溶液，靜置10 min 后于16 200×g、4 ℃條件下離心10 min，取上清液與OPA 試劑按1∶20（體積比）（上清液∶OPA，1∶20）分別取出10μL、200μL 混合，并避光反應(yīng)2 min，隨后于340 nm條件下測定OD 值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線即可求得樣品溶液中的多肽濃度。

1.3.4.2 鮮味強(qiáng)度

采用電子舌進(jìn)行檢測分析，參考Zhang 等[22]的方法并稍作調(diào)整，測試前將鮮味（AAE）、澀味（AE1）、苦味（C00）、酸味（CA0）、咸味（CT0）和甜味（GL1）傳感器在參比溶液（含0.3 mmol/L 酒石酸的30 mmol/L KCl 溶液）中活化24 h。通過監(jiān)測參比電極的相移來檢測味覺傳感器薄膜的電位，模擬電子傳感器信號(hào)被轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。每個(gè)樣品在25 ℃條件下分析5 次，記錄每種味道最后3 個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)的平均值作為最終響應(yīng)值。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

1.3.5.1 菌株接種量的選擇

固定2% 蔗糖，4% 底物添加量，設(shè)置接種量分別為1%、3%、5%、7%、9%，在35 ℃發(fā)酵24 h，測定各組的可溶性肽含量及其鮮味強(qiáng)度。

1.3.5.2 底物添加量的選擇

固定2% 蔗糖，3% 接種量，設(shè)置底物添加量分別為2%、4%、6%、8%、10%，在35 ℃發(fā)酵24 h，測定各組的可溶性肽含量及其鮮味強(qiáng)度。

1.3.5.3 發(fā)酵時(shí)間的選擇

固定2% 蔗糖，3% 接種量，4% 底物添加量，在35 ℃分別發(fā)酵12、24、36、48、60 h，測定各組的可溶性肽含量及其鮮味強(qiáng)度。

1.3.5.4 發(fā)酵溫度的選擇

固定2% 蔗糖，3% 接種量，4% 底物添加量，分別在20、25、30、35、40 ℃發(fā)酵24 h，測定各組的可溶性肽含量及其鮮味強(qiáng)度。

1.3.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

分析單因素試驗(yàn)結(jié)果，在此基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)的Box-Behnken 設(shè)計(jì)方法，運(yùn)用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。選擇對(duì)多肽濃度和鮮味強(qiáng)度影響顯著的3 個(gè)影響因子（接種量、底物添加量、發(fā)酵溫度），以的可溶性肽含量和鮮味強(qiáng)度為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平的Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)，對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，各因素及水平見表1。

1.3.7 可溶性肽含量計(jì)算

可溶性肽含量按下列公式計(jì)算。

式中：M為可溶性肽含量，mg/g；c為依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的多肽濃度，mg/mL；v為發(fā)酵液體積，mL；m為發(fā)酵液中底物的質(zhì)量，g。

1.3.8 納米液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析法（nano-liquid chromatography-mass spectrometry，nanoLC-MS/MS）鑒定發(fā)酵液中的多肽

在最優(yōu)工藝條件下對(duì)鵝骨進(jìn)行發(fā)酵，并將發(fā)酵液通過高效液相色譜儀進(jìn)行鑒定和多肽組學(xué)分析。取4μL 樣品經(jīng)高效液相系統(tǒng)進(jìn)行分離后聯(lián)用配備納升離子源的質(zhì)譜儀進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。流動(dòng)相采用乙腈-水-甲酸體系，以0.1%甲酸-98%水溶液（乙腈為2%）為流動(dòng)相A，以0.1% 甲酸-80% 乙腈溶液（水為20%）為流動(dòng)相B。色譜柱以100% 的A 相平衡后，樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器直接上樣到色譜柱，再經(jīng)色譜柱梯度分離，流速300 nL/min，梯度時(shí)長60 min。洗脫程序見表2。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行處理和單因素方差分析，P＜0.05 為差異顯著。響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析使用Design-Expert8.0.6。采用GraphPad Prism 8 和Origin 2018 軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 多肽濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線

以Ser 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，OD340值為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1 所示，其回歸方程為y=1.043 9x+0.104，R2=0.994 7。

圖1 絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of serine

2.2 發(fā)酵菌株的確定

各菌株發(fā)酵液的可溶性肽含量如圖2 所示。

圖2 接種菌株對(duì)發(fā)酵液可溶性肽含量的影響Fig.2 Effect of inoculated strains on the soluble peptide content of fermentation broths

由圖2 可知，用LP-12 發(fā)酵鵝骨所得可溶性肽含量最高，達(dá)到41.75 mg/g（P＜0.05）。

2.3 鵝骨發(fā)酵條件的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 接種量對(duì)發(fā)酵液中可溶性肽含量及鮮味強(qiáng)度的影響

接種量對(duì)發(fā)酵液中可溶性肽含量及鮮味強(qiáng)度的影響如圖3 所示。

圖3 接種量對(duì)發(fā)酵液中可溶性肽含量及鮮味強(qiáng)度的影響Fig.3 Effects of the inoculation amount on the soluble peptide content and the umami intensity in fermentation broths

由圖3 可知，接種量的增加導(dǎo)致發(fā)酵液的鮮味強(qiáng)度顯著降低（P＜0.05），這是由于植物乳桿菌在發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)酸，酸味積累會(huì)直接影響鮮味強(qiáng)度，接種過多則使鮮味強(qiáng)度降低?？扇苄噪暮侩S著接種量的增加先上升后下降，這是因?yàn)樵诘孜餄舛纫欢〞r(shí)，接種量較低使微生物分泌的蛋白酶較少，導(dǎo)致蛋白分解速率慢，從而使得可溶性肽含量較低[23]；而隨著接種量的繼續(xù)增加，底物不足以提供微生物生長的營養(yǎng)條件，同時(shí)，之前生成的多肽被繼續(xù)水解成氨基酸，都會(huì)導(dǎo)致可溶性肽含量的降低。當(dāng)接種量大于7% 時(shí)，可溶性肽含量沒有顯著變化（P＞0.05），這一趨勢(shì)與蓋夢(mèng)[24]的研究結(jié)果一致。在接種量為5% 時(shí)，可溶性肽含量達(dá)到了最大值39.84 mg/g，但此時(shí)的鮮味強(qiáng)度值較低。綜合考慮，選擇接種量3%為最佳水平。

2.3.2 底物添加量對(duì)發(fā)酵液中可溶性肽含量及鮮味強(qiáng)度的影響

底物添加量對(duì)發(fā)酵液中可溶性肽含量及鮮味強(qiáng)度的影響如圖4 所示。

圖4 底物添加量對(duì)發(fā)酵液中可溶性肽含量及鮮味強(qiáng)度的影響Fig.4 Effects of the substrate addition amount on the soluble peptide content and the umami intensity in fermentation broths

由圖4 可知，當(dāng)?shù)孜锾砑恿繛?%時(shí)，可溶性肽含量達(dá)到了最大值43.19 mg/g，但此時(shí)的鮮味強(qiáng)度較低。隨著底物添加量的增加，發(fā)酵液的鮮味強(qiáng)度顯著增大（P＜0.05），當(dāng)?shù)孜锾砑恿扛哂?%時(shí)，鮮味強(qiáng)度無顯著變化（P＞0.05），而此時(shí)的可溶性肽含量迅速下降且降低幅度大，這是由于接種量一定時(shí)，在適宜底物濃度范圍內(nèi)，微生物生長條件適宜，可以產(chǎn)生較多的肽，而在高底物濃度下，酶已經(jīng)達(dá)到飽和，菌體代謝速率降低，且前期生成的多肽水解為氨基酸，從而導(dǎo)致可溶性肽含量下降。綜合考慮，選擇底物添加量8%為最佳水平。

2.3.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵液中多肽濃度及鮮味強(qiáng)度的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵液中可溶性肽含量及鮮味強(qiáng)度的影響如圖5 所示。

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵液中可溶性肽含量及鮮味強(qiáng)度的影響Fig.5 Effects of the fermentation time on the soluble peptide content and the umami intensity in fermentation broths

由圖5 可知，發(fā)酵12 h 時(shí)鮮味強(qiáng)度最高（P＜0.05），在24～60 h 時(shí)，發(fā)酵液的鮮味強(qiáng)度均低于12 h且無顯著差異（P＞0.05），這是由于隨著發(fā)酵時(shí)間延長，乳酸積累導(dǎo)致鮮味強(qiáng)度降低。而多肽濃度隨發(fā)酵時(shí)間的延長先上升后下降，這是由于在發(fā)酵初期，發(fā)酵產(chǎn)物少，蛋白分解慢，可溶性肽含量低[25]，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，微生物大量增殖，產(chǎn)生了更多的可溶性肽。在發(fā)酵36 h 達(dá)到最大值42.43 mg/g。綜合以上分析并考慮時(shí)間成本，將發(fā)酵時(shí)間定為24 h，不列入響應(yīng)面試驗(yàn)中的因素。

2.3.4 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵液中可溶性肽含量及鮮味強(qiáng)度的影響

發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵液中可溶性肽含量及鮮味強(qiáng)度的影響如圖6 所示。

圖6 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵液中可溶性肽含量及鮮味強(qiáng)度的影響Fig.6 Effects of the fermentation temperature on the soluble peptide content and the umami intensity in fermentation broths

由圖6 可知，在20 ℃下發(fā)酵，鮮味強(qiáng)度達(dá)到最高值11.48，而此時(shí)可溶性肽含量也較少；其次是35 ℃，鮮味強(qiáng)度為10.72，此時(shí)可溶性肽含量最多，達(dá)到50.05 mg/g。由于發(fā)酵溫度過低會(huì)導(dǎo)致微生物生長緩慢，而溫度過高會(huì)使菌體死亡[26]，均不利于微生物的生長[27]，所以綜合考慮，選擇發(fā)酵溫度35 ℃為最佳水平。

2.4 響應(yīng)面Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化

2.4.1 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果和方差分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，三因素三水平Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)的設(shè)計(jì)方案及結(jié)果如表3 所示。

表3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 3 Design scheme and the results of Box-Behnken response surface experimental

利用Design-Expert 8.0.6 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到發(fā)酵液的可溶性肽含量（Y1）與鮮味強(qiáng)度（Y2）對(duì)編碼自變量A（接種量）、B（底物添加量）、C（發(fā)酵溫度）的回歸方程為Y1=47.08+0.61A+3.23B+0.068C+0.28AB-0.37AC-0.48BC-5.13A2-6.11B2-2.42C2；Y2=13.66+0.44A-0.25B+1.07C-0.5AB-0.81AC+0.17BC-1.38A2-0.36B2-2.82C2。對(duì)上述回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4 和表5。

表4 可溶性肽含量方差分析Table 4 Analysis of variance（ANOVA）for the soluble peptide content

表5 鮮味強(qiáng)度方差分析Table 5 Analysis of variance（ANOVA）for the umami intensity

由表4 可知，可溶性肽含量的回歸模型達(dá)到極顯著水平（P＜0.000 1），方程的失擬項(xiàng)不顯著（P=0.159 4＞0.05），說明該模型擬合度良好，回歸方程的可信度高，適用于發(fā)酵工藝的優(yōu)化。信噪比為19.357（＞4），R2=0.983 3，說明多肽濃度的預(yù)測值與實(shí)際值直接有很好的擬合度；由表5 可知，鮮味強(qiáng)度的回歸模型達(dá)到極顯著水平（P＜0.000 1），方程的失擬項(xiàng)不顯著（P=0.107 3＞0.05），信噪比為20.932（＞4），R2=0.981 0，說明鮮味強(qiáng)度的預(yù)測值與實(shí)際值直接有很好的擬合度。綜上，可以用此模型預(yù)測和分析微生物發(fā)酵鵝骨制備鮮味肽的發(fā)酵工藝。各因素交互作用對(duì)可溶性肽含量及鮮味強(qiáng)度的影響見圖7。

圖7 各因素交互作用對(duì)可溶性肽含量和鮮味強(qiáng)度影響的等高線圖和響應(yīng)曲面圖Fig.7 Contour maps and response surface plots of the effects of factor interactions on the soluble peptide content and the umami intensity

2.4.2 模型驗(yàn)證

利用Design-Expert 8.0.6 軟件預(yù)測出鵝骨鮮味肽的最佳發(fā)酵工藝條件為菌株接種量3.14%、底物添加量8.38%、發(fā)酵溫度35.67 ℃，預(yù)測可溶性肽含量為47.444 1 mg/g，鮮味強(qiáng)度為13.712 5。根據(jù)試驗(yàn)的實(shí)際操作條件，對(duì)發(fā)酵的工藝參數(shù)調(diào)整為接種量3%、底物添加量8.5%、發(fā)酵溫度36 ℃，在此條件下對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證，得到實(shí)際的可溶性肽含量為45.86 mg/g（誤差3.34%）；鮮味強(qiáng)度為14.03（誤差2.32%）。因此，基于響應(yīng)面法得到的優(yōu)化工藝參數(shù)準(zhǔn)確、可靠，可用于實(shí)際運(yùn)用。

2.5 多肽鑒定及組學(xué)分析

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，大多數(shù)鮮味肽所含的氨基酸數(shù)量通常在10 個(gè)以內(nèi)，如Gao 等[28]從蛋黃中分離出的六肽APYSGY、七肽AGFMPLP 和十肽VAMNPVDHPH；Li等[29]從蛤蜊水提物中分離出的八肽RPNPFENR；Xie等[30]從火腿中分離出的九肽GPAGPAGPR 等。利用這一特點(diǎn)，對(duì)質(zhì)譜鑒定出的肽進(jìn)行了初步簡單的篩選，共篩選出147 條氨基酸數(shù)量在10 個(gè)及10 個(gè)以下的肽，如圖8 所示。

圖8 初篩后所得潛在鮮味肽的長度分布Fig.8 The kength distribution of potential umami peptides obtained after primary screening

由圖8 可知，本研究得到的發(fā)酵液中潛在的鮮味肽集中在六到十肽，其中六肽最多，達(dá)到67 條，占比45.58%，其次是七肽（34 條，占比23.13%），這可能是由于分子量較小的肽具有更強(qiáng)的鮮味強(qiáng)度[31]。

對(duì)初篩得到的肽的來源蛋白進(jìn)行分析，結(jié)果如圖9 所示。

圖9 初篩后所得潛在鮮味肽的來源蛋白統(tǒng)計(jì)Fig.9 Source protein statistics of potential umami peptides obtained after primary screening

由圖9 可知，鵝骨發(fā)酵所得的潛在鮮味肽來自膠原蛋白（31.97%）、鋅指蛋白（3.4%）及其他雜蛋白，其中主要來源是膠原蛋白。

3 結(jié)論

本研究以可溶性肽含量為指標(biāo)，篩選出植物乳桿菌LP-12 用來發(fā)酵鵝骨，制備了鮮味肽粗提物。對(duì)影響發(fā)酵的接種量、底物添加量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度進(jìn)行了單因素試驗(yàn)，并在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了Box-Behnken試驗(yàn)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，以可溶性肽含量和鮮味強(qiáng)度為響應(yīng)值，優(yōu)化出最佳發(fā)酵工藝條件：LP-12 接種量3%、底物添加量8.5%、發(fā)酵溫度36 ℃、發(fā)酵時(shí)間24 h，此時(shí)，可溶性肽含量為45.86 mg/g，鮮味強(qiáng)度為14.03。對(duì)鮮味粗肽鑒定及篩選后得到147 條氨基酸數(shù)量在10 以下的潛在鮮味肽，通過多肽組學(xué)分析得知，其中大多數(shù)肽來源于膠原蛋白。本研究為鵝骨的高值化應(yīng)用及鮮味肽的開發(fā)利用提供了理論支撐與試驗(yàn)依據(jù)，并為膠原蛋白的應(yīng)用開辟了新的研究方向。

綜上所述，通過微生物發(fā)酵鵝骨可以有效獲得潛在的鮮味肽，但是成分依然繁雜不純，且鮮味特征和呈鮮機(jī)制并不明晰。后續(xù)的研究應(yīng)致力于建立一條快速的鮮味肽純化及篩選路線，盡可能得到較純的鮮味肽，并探明其具體的味覺特征，闡明其鮮味作用機(jī)制。