低溫放電等離子體處理對赭曲霉毒素A降解效果及對無核白葡萄干品質(zhì)的影響

張文樂，張紹君，王藝諾，周嘉佳，李圣杰，湯雅楠，丁夢楠，王英

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

中國是世界上葡萄干的主要出口國之一，尤其是新疆吐魯番、哈密等地生產(chǎn)的綠色葡萄干，一直是國內(nèi)外市場上的熱銷產(chǎn)品[1]。吐魯番葡萄干因其果肉柔軟、含糖量高的優(yōu)異品質(zhì)馳名中外，備受消費(fèi)者喜愛。葡萄干中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，是新疆主要的干果品種之一[2]。無核白葡萄干是易感染赭曲霉菌的農(nóng)產(chǎn)品之一，真菌毒素對葡萄干具有極高的親和性。在葡萄干的種植、加工和貯藏過程中，極易發(fā)生真菌毒素的侵染導(dǎo)致其次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，其中以赭曲霉毒素最為突出[3]。赭曲霉毒素是由曲霉屬和青霉屬的一些真菌產(chǎn)生的次級代謝毒素，已測得葡萄干中赭曲霉毒素包括A、B、C、D 等7 種結(jié)構(gòu)類似的化合物，其中赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）污染最為普遍、毒性最強(qiáng)，嚴(yán)重危害人體健康[4]。試驗(yàn)表明，OTA 具有嚴(yán)重的腎毒性、肝毒性、神經(jīng)毒性以及免疫毒性[5]。因此，找到一種成本低廉、操作方便、安全有效、環(huán)境友好且不會對無核白葡萄干品質(zhì)產(chǎn)生影響的赭曲霉毒素降解方法，確保葡萄干的食品安全，已成為我國葡萄干產(chǎn)業(yè)發(fā)展中亟待解決的關(guān)鍵問題。

目前工業(yè)上常用高溫短時殺菌、超高溫瞬時殺菌等熱處理來確保食品的安全性[6-7]。然而熱處理存在損害農(nóng)產(chǎn)品營養(yǎng)品質(zhì)、降解效率低、實(shí)踐應(yīng)用受到限制等問題[8-9]。低溫等離子體作為一種新興的非熱滅菌技術(shù)，具有對食品品質(zhì)影響小和無二次殘留的優(yōu)點(diǎn)[10-11]，是極具發(fā)展?jié)摿Φ男屡d技術(shù)，在食品行業(yè)顯示出了巨大的應(yīng)用潛力[12]。低溫離子體是一種具有多種離子、電子以及激發(fā)態(tài)的原子等活性物質(zhì)的電離氣體，特性是在常壓下即可產(chǎn)生且溫度較低，在食品加工方面受到較大關(guān)注[13-14]。等離子體中的活性物質(zhì)能使分子鍵斷裂，形成低毒或無毒的小分子物質(zhì)從而降解真菌毒素[15]。研究證明，低溫等離子體能滅活榛子[16]、花生[17]中的黃曲霉菌，并能夠降解脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、雪腐鐮刀菌烯醇、伏馬菌素B2和OTA[18]，因此，低溫等離子體在降解真菌毒素中的效果已得到確認(rèn)，但其在應(yīng)用中普遍存在處理量較小和降解機(jī)制不明確的問題。建立一種大容量、高效率、安全無殘留降解無核白葡萄干中赭曲霉毒素的方法，將有助于解決長期困擾我國葡萄干生產(chǎn)和出口中赭曲霉毒素污染問題，推動干果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

Li 等[19]和Wang 等[20]報(bào)道了一種放電穩(wěn)定均勻、具有較大等離子體產(chǎn)生區(qū)域的低溫氣相沿面放電設(shè)備，其一體式的特殊結(jié)構(gòu)能夠降低傳輸損耗，提高活性物質(zhì)產(chǎn)量，可有效降解水溶液中的染料。在此基礎(chǔ)上，本研究采用改進(jìn)的低溫氣相沿面放電等離子體設(shè)備，發(fā)現(xiàn)采用外敷鋁箔作為接地電極的情況下仍能觸發(fā)絲狀放電，產(chǎn)生大量活性物質(zhì)，能夠有效滅活赭曲霉毒素A。

鑒于此，本研究采用以空氣為工作氣體的低溫放電等離子體降解OTA，研究等離子體在不同處理時間、不同電壓和不同初始濃度下對目標(biāo)毒素的降解效果，并評估低溫放電等離子體處理對無核白葡萄干的理化指標(biāo)及色差和香氣成分的影響，以期為低溫等離子體處理技術(shù)在無核白葡萄干赭曲霉毒素降解中的應(yīng)用提供理論支撐，為干果中真菌毒素的降解提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無核白葡萄干：北園春干果市場。無核白葡萄干大小均一，無機(jī)械損傷，無病害或腐爛。無核白葡萄干為當(dāng)年采摘，洗凈烘干備用。

赭曲霉毒素A（純度99.8%）：山西點(diǎn)燦貿(mào)易有限公司；乙腈（色譜純）、葡萄糖、淀粉、酚酞、鹽酸、硫酸銅、亞甲基藍(lán)、酒石酸鉀鈉、草酸（均為分析純）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；硫代硫酸鈉、碘化鉀、三氯甲烷、氫氧化鈉（均為分析純）：天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司；無水碳酸鈉（分析純）：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；異丙醇（分析純）：天津市永晟精細(xì)化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

低溫等離子體空氣常壓實(shí)驗(yàn)反應(yīng)器（DBD-50）：美國泰克公司；紫外可見分光光度計(jì)（CN61M-752）：北京海富達(dá)科技有限公司；超高效液相色譜儀（LC20A）、Inert Sustain C18 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7μm）：日本島津（中國）有限公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）（7890B-5977）：中國安捷倫科技有限公司；手持式色差儀（NR10QC）：深圳市三恩時科技有限公司；水分活度測定儀（AW-60）：靖江市中諾儀器儀表有限公司；快速水分測定儀（FK-16A）：廈門弗布斯檢測設(shè)備有限公司；電子分析天平（FA2004C）（精度0.000 01 g）：山東歐萊博儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 低溫放電等離子體處理

低溫放電等離子體反應(yīng)器系統(tǒng)示意圖如圖1所示。

圖1 低溫等離子體反應(yīng)器系統(tǒng)示意圖Fig.1 Schematic diagram of low temperature plasma reactor system

該系統(tǒng)由交流（10 kHz）電源、等離子體發(fā)生器和處理室組成，因處理物基質(zhì)與之前研究不同故將液態(tài)物質(zhì)處理裝置修改為固態(tài)物質(zhì)處理裝置[21]。將待處理物置于處理室曝氣器周圍（單層），螺旋電極（高壓電極）與接地電極之間產(chǎn)生絲狀放電，從而產(chǎn)生大量臭氧（O3）、過氧化氫（H2O2）、羥自由基（·OH）以及激發(fā)態(tài)粒子等活性物質(zhì)處理無核白葡萄干[22]，并采用郭東權(quán)等[23]的方法對乙腈中OTA 進(jìn)行處理，探究不同因素對OTA 降解效果影響。

1.3.2 不同因素對OTA 降解效果影響

1.3.2.1 不同處理時間對赭曲霉毒素A 降解效果的影響

取50μg/mL 的赭曲霉毒素A 溶液50μL 滴于蓋玻片上，待液體干燥后選取低溫放電等離子體處理時間為0、3、5、10 min，放電電壓為25 kV。將處理后載玻片使用2 mL 乙腈洗脫24 h 吸出用于超高效液相色譜（ultra-performance liquid chromatography，UPLC）測定赭曲霉毒素A 含量并計(jì)算降解率，研究不同處理時間對OTA 降解效果的影響。

1.3.2.2 不同赭曲霉毒素A 初始濃度對其降解效果的影響

取10、30、50 μg/mL 的赭曲霉毒素A 溶液50 μL滴于蓋玻片上，待液體干燥后于放電電壓為25 kV 的低溫放電等離子體下分別處理5 min。將處理后載玻片使用2 mL 乙腈洗脫24 h 吸出用于UPLC 測定赭曲霉毒素A 含量并計(jì)算降解率，研究不同赭曲霉毒素A初始濃度對OTA 降解效果的影響。

1.3.2.3 不同放電電壓對赭曲霉毒素A 降解效果的影響

取50μg/mL 的赭曲霉毒素A 溶液50μL 滴于蓋玻片上，待液體干燥后于放電電壓為25、50、75 kV 的低溫放電等離子體下分別處理5 min。將處理后載玻片使用2 mL 乙腈洗脫24 h 吸出用于UPLC 測定赭曲霉毒素A 含量并計(jì)算降解率，研究不同放電電壓對OTA 降解效果的影響。

1.3.3 OTA 降解效果的測定

1.3.3.1 超高效液相色譜儀測試條件

將處理后樣品以島津液相系統(tǒng)測定赭曲霉毒素A含量。色譜柱C18 柱（150 mm×4.6 mm，5μm），或等效柱；柱溫30 ℃；流動相A：冰乙酸+水（2+100），流動相B：乙腈；等度洗脫條件：A-B（50+50）；流速1 mL/min；進(jìn)樣量10μL；激發(fā)波長333 nm；發(fā)射波長460 nm。

1.3.3.2 赭曲霉毒素A 降解率計(jì)算方法

按以下公式計(jì)算赭曲霉毒素A 降解率。

式中：a為赭曲霉毒素A 的降解率，%；c為樣品處理后赭曲霉毒素A 的濃度，μg/mL；c0為樣品中赭曲霉毒素A 的初始濃度，μg/mL。

1.3.4 理化指標(biāo)的測定

還原糖、總糖含量的測定采用斐林試劑滴定法[24]；可滴定酸含量的測定參照張輝等[25]方法；單寧含量的測定采用高錳酸鉀滴定法[25]；L-抗壞血酸（vitamin C，VC）含量的測定采用2，6-二氯酚靛酚法[24]；水分活度采用水分活度儀測定[26]；褐變度采用紫外分光光度計(jì)法測定[26]；水分含量采用水分測定儀測定[27]；香氣成分的測定采用高效氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法[27]。

1.3.5 色差的測定及計(jì)算方法

色差值測定采用色差儀，每個樣品測定重復(fù)10 次，取平均值。其中色差值用ΔE*ab表示，使用白色校準(zhǔn)板進(jìn)行校準(zhǔn)。在白色背景下測量L*（亮度）、a*（綠色/紅色）和b*（藍(lán)色/黃色），讀數(shù)一式3 份。根據(jù)下列公式計(jì)算確定色度（C*）、色相角（H*）和總色差（△E*ab）。

1.3.6 芳香物質(zhì)的測定

1.3.6.1 揮發(fā)性化合物的富集

采用頂空固相微萃?。╤ead space solid phase micro extraction，HS-SPME）的方式富集揮發(fā)性化合物。揮發(fā)性物質(zhì)的定性及定量通過參考質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫NIST14 和NIST14s，采用匹配度和保留時間對揮發(fā)物進(jìn)行定性。

?。?5±1）g 無核白葡萄干用25 mL 水浸泡過夜后勻漿，稱取樣品10 g，取2 g 氯化鈉放入20 mL 頂空瓶內(nèi)，平衡30 min 后，40 ℃萃取40 min。

1.3.6.2 GC-MS 條件

電子電離源的電子能量為70 eV，進(jìn)樣口溫度260 ℃，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃。輔助加熱溫度250 ℃，掃描范圍35～550 a.m.u。不分流進(jìn)樣，載氣為氦氣，流量1 mL/min，升溫程序：40 ℃保持5 min，3 ℃/min 升至120 ℃保持5 min，10 ℃/min 升至250 ℃，保持10 min。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)進(jìn)行3 次。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，采用SPSS 19.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用顯著性分析（Tukey's honestly significant difference，Tukey HSD）檢驗(yàn)對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。處理結(jié)果的差異在P＜0.05 被認(rèn)為顯著，采用Origin 2018 軟件分析顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因素對赭曲霉毒素A 降解效果的影響

2.1.1 OTA 標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過UPLC 法測定得出峰面積，并且進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制如圖2 所示。

圖2 OTA 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 OTA standard curve

由圖2 可知，標(biāo)準(zhǔn)品OTA 濃度與峰面積呈線性相關(guān)（R2=0.999 9），且線性關(guān)系良好，線性回歸方程y=772.519x-248.959（式中：x為標(biāo)準(zhǔn)品OTA 濃度；y為峰面積）。

2.1.2 不同處理時間對赭曲霉毒素A 降解效果的影響

不同處理時間對赭曲霉毒素A 降解效果的影響如圖3 所示。

圖3 不同處理時間對赭曲霉毒素A 降解效果的影響Fig.3 Effect of different treatment times on the degradation of OTA

由圖3 可知，在試驗(yàn)設(shè)定范圍內(nèi)，隨著低溫等離子體放電時間的延長，OTA 降解率呈明顯上升趨勢。處理3 min 時OTA 降解率僅（81.52±0.38）%，在5 min 時OTA 在相同條件下的降解率達(dá)到（90.79±0.43）%，在處理10 min 時OTA 的降解率為（99.12±0.01）%?？梢姡?dāng)放電電壓與OTA 初始濃度一定時，在0～10 min 的處理時間內(nèi)，處理時間越長OTA 的降解效果越好，且處理時間從3 min 增長至5 min 時，處理效果相較于5 min 增長至10 min 時降解速率明顯提高。

2.1.3 不同赭曲霉毒素A 初始濃度對其降解效果的影響

不同赭曲霉毒素A 初始濃度對其降解效果的影響如圖4 所示。

圖4 不同赭曲霉毒素A 初始濃度對其降解率的影響Fig.4 Effect of different OTA initial concentrations on its degradation rate

由圖4 可知，在試驗(yàn)設(shè)定范圍內(nèi)，隨著OTA 初始濃度的增大，OTA 降解率呈先上升后下降趨勢。初始濃度為10、30 μg/mL 的OTA 降解率高達(dá)（96.26±0.45）%、（96.52±0.13）%，初始濃度為50μg/mL 的OTA在相同條件下的降解率僅為（90.79±0.43）%?？梢?，當(dāng)放電電壓與處理時間一定時，OTA 溶液在10～50μg/mL范圍內(nèi)時，OTA 的濃度越低降解效果越好。這與張巖等[28]對乙腈中黃曲霉毒素B1降解的研究相似。

2.1.4 不同放電電壓對赭曲霉毒素A 降解效果的影響

不同放電電壓對赭曲霉毒素A 降解效果的影響如圖5 所示。

圖5 不同放電電壓對OTA 降解率的影響Fig.5 Effect of different discharge voltages on the degradation rate of OTA

由圖5 可知，在試驗(yàn)設(shè)定范圍內(nèi)，隨著低溫等離子體放電電壓的增大，OTA 降解率呈明顯上升趨勢。放電電壓為25 kV 時OTA 降解率為（90.79±0.43）%，放電電壓為50、75 kV 時OTA 在相同條件下的降解率達(dá)到（97.89±0.11）%、（99.21±0.01）%?？梢?，當(dāng)處理時間與OTA 初始濃度一定時，在25～75 kV 的放電電壓范圍內(nèi)，放電電壓越大OTA 的降解效果越好。

2.2 不同時間低溫放電等離子體處理對無核白葡萄干理化指標(biāo)的影響

為研究短時間OTA 快速降解對無核白葡萄干品質(zhì)的影響，采用低溫放電等離子體對無核白葡萄干處理0、3、5 min。經(jīng)過0、3、5 min 低溫放電等離子體處理后的無核白葡萄干品質(zhì)對比見表1。

表1 不同時間處理后無核白葡萄干品質(zhì)的對比Table 1 Comparison of the quality of seedless white raisins after different time treatments

由表1 可知，無核白葡萄干經(jīng)過低溫放電等離子體處理3、5 min 后，無核白葡萄干的各項(xiàng)品質(zhì)沒有發(fā)生改變且均沒有顯著性差異（P＞0.05），這些結(jié)果與用低溫等離子體處理黃瓜表面的結(jié)果相似[29]，說明低溫放電等離子體處理不會使食品理化指標(biāo)發(fā)生改變。

2.3 不同時間低溫放電等離子體處理對無核白葡萄干色澤的影響

經(jīng)過低溫放電等離子體以25 kV 的放電電壓處理0、3、5 min 后的無核白葡萄干的顏色變化如表2 所示。對照樣品是未經(jīng)低溫放電等離子體處理的無核白葡萄干。

表2 不同時間低溫放電等離子體處理后無核白葡萄干色澤的對比Table 2 Color comparison of seedless white raisins after different times of low temperature discharge plasma treatment

由表2 可知，色度C*從21.444 升至21.875，意味著無核白葡萄干的顏色變得飽和。色相角H*從79.546 增加到79.833，表明無核白葡萄干經(jīng)過低溫等離子體處理后色相角更加趨近于黃色。總色差ΔE*ab從48.290 上升至49.697，這意味著無核白葡萄干的總色差有略微的提升。低溫放電等離子體處理無核白葡萄干后色澤指標(biāo)均有略微的提升，但并未出現(xiàn)顯著性差異（P＞0.05），說明無核白葡萄干經(jīng)過低溫放電等離子體處理后仍保持較為良好的色澤，不會隨著處理時間的延長而發(fā)生改變。

2.4 不同時間低溫放電等離子體處理對葡萄干揮發(fā)性化合物的影響

揮發(fā)性物質(zhì)的定性及定量通過參考質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，并通過保留時間對揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行定性[30]，無核白葡萄干共檢測出31 種揮發(fā)性物質(zhì)，結(jié)果如表3 所示。

表3 低溫放電等離子體處理對無核白葡萄干揮發(fā)性化合物的效果Table 3 Volatile compounds of seedless white raisins treated by low temperature discharge plasma

由表3 可知，無核白葡萄干中揮發(fā)性成分較為豐富，主要由醛類、酮類、酯類、醇類、酸類、烷烴類以及雜環(huán)化合物等組成。不同時間低溫放電等離子體處理后無核白葡萄干中香氣成分主要為酸類物質(zhì)、醛類物質(zhì)、醇類物質(zhì)、酮類物質(zhì)組成。其中甲酸、3-甲基丁酸、乙酸、3-甲基丁醛、己醛、（Z）-2-庚醛、3-甲基-2-丁醇、1-己醇、1-辛烯-3-醇9 種物質(zhì)為無核白葡萄干的主要風(fēng)味物質(zhì)[27]。

由表3 可知，與0 min 處理的樣品相比，3、5 min處理后無核白葡萄干中的大部分酸、醛、醇和酮類物質(zhì)的相對含量未出現(xiàn)明顯變化。無核白葡萄干經(jīng)過低溫放電等離子體處理后，酸類物質(zhì)中3-甲基丁酸、己酸、辛酸出現(xiàn)明顯的下降，而甲酸、戊酸、2-乙基己酸出現(xiàn)明顯上升。其他物質(zhì)中己醛、（Z）-2-庚醛、1-己醇、1-辛烯-3-醇、（E）-2-辛烯-1-醇、2，6-二叔丁基-4-羥基-4-甲基環(huán)己-2，5-二烯-1-酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、3，4-二甲基-2，5-呋喃二酮發(fā)生變化，可能是因?yàn)闊o核白葡萄干經(jīng)過不同時間低溫放電等離子體處理其中各類物質(zhì)發(fā)生相互轉(zhuǎn)換。其他的揮發(fā)性化合物均得到了較好地保持，未出現(xiàn)明顯變化。

3 討論與結(jié)論

本研究采用低溫放電等離子體對OTA 進(jìn)行降解，并研究其對無核白葡萄干品質(zhì)的影響。結(jié)果表明，低溫放電等離子體不同處理?xiàng)l件對OTA 的降解效果顯著。隨著低溫等離子體放電時間的增長OTA 降解率增高，OTA 經(jīng)25 kV 等離子體處理10 min，50 μg/mL的OTA 降解率可達(dá)99.12%；OTA 溶液在10～50μg/mL范圍內(nèi)時，初始濃度越低OTA 降解率越高，OTA 經(jīng)25 kV 等離子體處理5 min，10 μg/mL 的OTA 降解率可達(dá)96.26%；放電電壓對OTA 降解率影響最為明顯，隨著低溫等離子體放電電壓的增大，OTA 降解率不斷增大，OTA 經(jīng)75 kV 等離子體處理5 min，50μg/mL 的OTA 降解率可達(dá)99.21%。低溫放電等離子體處理對無核白葡萄干的理化性質(zhì)、蛋白濃度、色差均未產(chǎn)生顯著影響（P＞0.05）；與0 min 處理的樣品相比，3、5 min處理后無核白葡萄干中的大部分酸、醛、醇和酮類物質(zhì)的相對含量未出現(xiàn)明顯變化，其中個別酸類物質(zhì)含量出現(xiàn)明顯下降或上升，一些物質(zhì)有略微的變化，其余揮發(fā)性化合物均得到了較好地保持。這些結(jié)果表明低溫放電等離子體可以有效地降解OTA，并能保持無核白葡萄干的理化性質(zhì)及色澤和香氣。本研究對低溫放電等離子體滅活OTA 進(jìn)行探究，后續(xù)還需要進(jìn)一步優(yōu)化試驗(yàn)過程，并對降解產(chǎn)物進(jìn)行分析，為低溫放電等離子體在食品殺菌中應(yīng)用及安全性評價提供重要依據(jù)。