MXene納米材料在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中促成骨的機制研究

朱昕妍,靳牧涵,嚴菁菁,王美琪,張一玲,馬俊青,袁 俊

MXene是一種新興的二維納米材料,于2011年首次被報道,具有多個原子層,由過渡金屬碳化物、氮化物或碳氮化物組成[1]。其特點是以MAX相陶瓷從層狀結(jié)構(gòu)中提取A族元素獲得二維納米薄片,從其MAX相前驅(qū)體中合成了Ti2C、Ta4C3和其他MXenes,展示了三種可能的結(jié)構(gòu)(M2X、M3X2和M4X3)。一般化學(xué)式為Mn+1XnTx,“M”是過渡金屬原子,“A”代表元素周期表中的A族元素,而“X”是碳或氮[2]。它具有良好的電化學(xué)性能[3]、親水性、機械性能和一些生物學(xué)性能如生物相容性[4]、生物降解性[5]、光熱性能[6]、抗菌活性等[7],因此越來越多地被應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。近年來已有諸多研究將MXene應(yīng)用于骨組織工程,但對MXene促進成骨的機制研究較少且尚不明確。因此本文主要總結(jié)以往研究中MXene納米材料在骨缺損修復(fù)中的相關(guān)機制,就這一研究領(lǐng)域的最新進展進行綜述。

1 MXene的制備與生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用

1.1 MXene的制備

合成MXene材料的方法主要分為“自上而下”和“自下而上”兩種[8]。

“自上而下”法是目前常用的MXene制備方法,分為刻蝕和分層2個階段。①刻蝕:使用強腐蝕劑(通常是HF[9])來刻蝕3D MAX相以獲得多層堆疊的MXene,M—A鍵一般比M—X鍵弱,會選擇性地刻蝕M—A鍵[10]。然而使用HF制造MXene會對人體和環(huán)境造成損害,且會在材料表面引入大量F-基團,使其難以與生物分子偶聯(lián)[11]。因此無氟的制備方法更有利于制備表面端基可控的MXene材料[12]。2019年,Li等[13]使用熔融狀態(tài)下的ZnCl2刻蝕Ti3AlC2制備MXene,首次制備出表面為Cl終端基團的MXene材料。之后,該團隊進一步提出了一種Lewis酸熔鹽(如FeCl2、CuCl2、AgCl等)刻蝕MAX相(如Ti2AlC、Ti3AlC2、Nb2AlC等)合成MXene的通用策略[14]。②分層:刻蝕后形成的多層MXene,其層間為較弱的范德華力或者氫鍵,需要進一步利用有機溶劑(如二甲基亞砜[15]、四丁基氫氧化銨[16]等)插層或機械振蕩(如超聲波)[17],增加MXene薄膜之間的距離,從而獲得少層或單層MXene納米片[18]。

“自下而上”法是在原子水平上控制晶體生長,形成2D MXene材料,常采用化學(xué)氣相沉積法(chemical vapor deposition,CVD)[19],即以甲烷氣體(CH4)為碳源,以銅鉬箔為襯底,在1 085 ℃以上的溫度用化學(xué)氣相沉積法合成超薄碳化鉬(MoC2)。但是該方法制備的MXene材料尺寸太大,且缺乏表面官能團,不利于其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。

此外,研究者們還報道了模板法[20]和等離子體增強脈沖激光沉積法(plasma enhanced pulsed laser deposition,PEPLD)[21]來合成MXene。

1.2 MXene的性能

近年來,MXene材料的獨特生物醫(yī)學(xué)特性受到研究者們的重視:①MXene具有良好的抗菌性能,它可以通過氧化應(yīng)激反應(yīng)、吸附聚集細菌、銳邊損傷細胞膜、內(nèi)吞或滲漏進入微生物、化學(xué)破壞細胞結(jié)構(gòu)等方式實現(xiàn)抗菌效應(yīng)[7];②部分MXene在適合波長的光照射下,可以產(chǎn)生氧自由基(reactive oxygen species,ROS),有利于其在光動力治療中的應(yīng)用[22];③在近紅外光(near infrared ray,NIR)的第一和第二生物窗口具有高的光吸收和光熱轉(zhuǎn)換能力[5],可用于深層組織的光熱治療(photothermal therapy,PTT)和光聲(photoacoustic,PA)成像[23-24];④MXene量子點(MXene quantum dots,MQDs)利用材料表面缺陷誘導(dǎo)發(fā)光或尺寸效應(yīng)誘導(dǎo)量子限制實現(xiàn)發(fā)光特性[25],可作為潛在的放射標記點;⑤MXene具有良好的生物相容性,相對較低的細胞毒性和體內(nèi)毒性[26];⑥MXene的尺寸大小范圍在納米級到微米級[2],超薄2D平面結(jié)構(gòu)和高表面積體積比使其成為良好的藥物載體[27-28];⑦部分MXene材料具有良好的生物可降解性[5,29];⑧部分MXene(如Ta4C3等)具有良好的CT成像效果[30-31]。因此,MXene在生物傳感、生物成像、腫瘤治療、組織再生、抗菌等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已有較為深入的研究成果。

1.3 MXene的應(yīng)用

1.3.1 MXene在皮膚組織工程中的應(yīng)用 Liu等[32]的實驗證實,MXene能夠增強分子間氫鍵,并通過近紅外效應(yīng)提供抗菌能力,促進傷口愈合。此外,MXene所具備的光電和光熱效應(yīng)亦有利于其在皮膚組織工程中應(yīng)用[1]。

1.3.2 MXene在神經(jīng)組織工程和神經(jīng)組織再生中的應(yīng)用 Guo等[33]制備了Ti3C2TxMXene納米材料,在離體實驗中證實其對初級小鼠神經(jīng)干細胞有促黏附、促增值、促分化作用,表明其在神經(jīng)再生與組織工程中具備應(yīng)用價值。

1.3.3 MXene在心肌組織工程中的應(yīng)用 電生理是心肌組織工程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。2023年,Lee等[34]設(shè)計制作了Ti3C2TxMXene黏性水凝膠,并證實其具有高導(dǎo)電性、彈性、高組織黏附性等理化特性,并可誘導(dǎo)體外心肌細胞成熟,在心肌組織工程中具備可靠前景。

1.3.4 MXene在骨組織工程和骨再生中的應(yīng)用 MXene具備優(yōu)良的理化生物學(xué)性質(zhì),可以通過支架、膜、涂層等多種方式介導(dǎo)體內(nèi)外骨生成[1]。

1.3.5 其他 MXene在血管生成等領(lǐng)域的應(yīng)用亦有報道[35]。

2 MXene納米材料促進骨生成的研究及機制

MXene已被用于多種組織缺損的研究,如心血管、皮膚、神經(jīng)組織等[36]。近年來已有研究聚焦于MXene骨組織工程應(yīng)用。MXene納米材料可以通過增強基底材料的理化性質(zhì)促進細胞增殖改建、在基因以及分子水平提高成骨相關(guān)細胞的活力,并且有利于血管組織再生,加速成骨進程[1]。

2.1 MXene納米材料對成骨相關(guān)細胞的影響

2.1.1 促進細胞增殖和黏附 骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)能夠在特定環(huán)境中分化為成骨細胞,促進BMSCs的增殖與黏附,進而促進骨缺損的修復(fù)。Jang等[37]將2D片層狀Ti3C2MXene納米微粒應(yīng)用于離體的人類間充質(zhì)干細胞(human mesenchymal stem cells,hMSC),顯示短時低劑量的Ti3C2MXene(<20 μg/mL)可以促進體外干細胞的增殖。此外Huang等在激光共聚焦顯微鏡下觀察hMSC在有MXene存在的情況下,細胞伸出偽足增加,向周圍擴展趨勢提高,從而對材料擁有更大的黏附性,細胞密度提升,增殖更加活躍[37]。

血管在骨骼塑造和穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用[38]。血管內(nèi)皮細胞還具有信號傳導(dǎo)能力,調(diào)節(jié)骨再生[39]。Yin等[26]在人類臍內(nèi)皮靜脈細胞(human umbilical endothelial vein cells,HUVECs)離體實驗中報道,Nb2C MXene功能化支架能夠加速HUEVC的遷移能力,促進血管內(nèi)皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)-B和堿性成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor 2,FGF2)的表達,誘導(dǎo)具有血管生成潛力的管狀結(jié)構(gòu)生成。在體實驗也證實了其優(yōu)異的促血管生成能力。除此之外,MXene還能通過傳遞生理神經(jīng)電信號增加血管生成[40]。Wang等[41]將VEGF納入MXene進行可控輸送,證實MXene可以促進血管生成效應(yīng)。

2.1.2 促進細胞分化 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的活性用于代表早期成骨細胞的分化能力,即活性越高,分化能力越強[42]。Jang等通過檢測ALP,觀察到與在蓋玻片上生長的細胞相比,低濃度Ti3C2MXene納米玻璃材料顯著提高了hMSC的ALP活性,證明了MXene存在會使hMSC的分化活性增加。隨著時間的推移,第7天時生長培養(yǎng)基中的MXene薄膜上生長的細胞ALP 活性與在蓋玻片上培養(yǎng)的細胞的ALP活性趨向一致[37]。同樣,Zhang等[43]通過檢測小鼠前成骨細胞系MC3T3E1 ALP含量,也觀察到在第4天以及第7天,使用碳化鈦MXene納米材料組明顯具有較高的分化活性。

2.1.3 促進細胞橢球體形成 近年來有研究發(fā)現(xiàn),細胞在特定的情況下可以呈現(xiàn)類似液滴形的球狀體或橢球狀體,可以增加細胞存活和活性[44]。Jang等發(fā)現(xiàn)MXene顆粒可以作為粘合劑附著在細胞質(zhì)上,并在細胞遷移過程中隨細胞移動,從而促進hMSC形成細胞橢球體。這種現(xiàn)象可能是由于MXene顆粒的親水性和生物相容性使細胞黏附相關(guān)蛋白具有良好的相容性[45]。

2.1.4 促進細胞礦物質(zhì)沉積 羥基磷灰石在間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell,MSC)的增殖和成骨分化中起重要作用。研究表明,MXene也可以促進細胞外礦物質(zhì)如羥基磷灰石沉積,從而提高成骨速度。Awasthi等采用體外生物礦化實驗檢測PCL-MXene復(fù)合纖維的羥基磷灰石成核性能,發(fā)現(xiàn)PCL-MXene上面羥基磷灰石的沉積顯著多于單純的PCL。在羥基磷灰石晶體中,鈣、磷沉積與PCL-MXene電紡絲纖維表面的適當(dāng)物質(zhì)的量的比(≈1.6)與羥基磷灰石晶體的標準值基本一致,證明了PCL-MXene復(fù)合纖維的羥基磷灰石成核性能[46]。

2.2 MXene納米材料促成骨的材料學(xué)機制研究

2.2.1 親水性 材料表面的親水性可以大幅度提高細胞生物學(xué)功能,如細胞黏附性及增殖活性。Awasthi等通過測量水接觸角,發(fā)現(xiàn)MXene的含量越高,水接觸角越小,材料的潤濕性越大。增加潤濕性可以增加PCL-MXene復(fù)合電紡纖維中的細胞黏附和增殖[46]。隨著MXene重量百分比的增加,復(fù)合物的潤濕性增強,這可能與MXene末端羥基或含氧基團的親水性有關(guān)。MXene修飾的材料表面存在極佳的親水性以及粗糙度,能夠大幅度提高細胞黏附,吸引間充質(zhì)干細胞定植[47]。

2.2.2 吸附蛋白質(zhì) 在對MXene結(jié)構(gòu)相似的石墨烯進行分子化學(xué)研究時,Kumar團隊[48]發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)中的RGD序列被空位缺陷的石墨烯表面所吸引,其中單空位對酯基有吸引力,從而促進蛋白質(zhì)的吸附,增加材料表面的親水性,而蛋白質(zhì)的RGD序列可以和整合素結(jié)合。與石墨烯相似,MXene材料也含有帶負電的含氧官能團[49]。也就是說,這種性質(zhì)使其一方面可以增加材料表面的親水性,另一方面,蛋白質(zhì)的RGD序列可以作為配體和細胞絲狀偽足上的整合素結(jié)合,促進細胞與材料表面的黏附[48]。

2.2.3 電生理作用 天然骨的生物電已被報道為調(diào)節(jié)代謝活動的關(guān)鍵因素之一[50],可以通過壓電、熱電和鐵電等電效應(yīng)[51-52]影響成骨細胞、骨細胞和破骨細胞[53],進而影響骨愈合、骨生長和骨重塑等生理過程[54-56]。Hu等[57]制備了MXene/絲蛋白(silk fibroin,RSF)水凝膠,證實其可通過Ca2+/CALM信號傳導(dǎo)通路促進間充質(zhì)干細胞離體增殖、遷移及成骨分化及血管新生,并在小鼠離體模型中觀測到MXene/RSF促進小鼠顱骨模型骨缺損修復(fù),表明電生理亦可能是MXene促進骨組織再生的重要途徑。

2.3 MXene納米材料促成骨的分子學(xué)機制研究

2.3.1 調(diào)控成骨細胞基因表達 前期許多MXene研究關(guān)注到了MXene對細胞基因表達的影響。Runx2 與成骨細胞中ALP、骨鈣素(osteocalcin,OCN)、Ⅰ型膠原蛋白(collagen Ⅰ,COL-Ⅰ)、骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein,BSP)及骨橋蛋白(osteopontin,OPN)等主要成骨分化相關(guān)基因的表達密切相關(guān),這是因為以上基因的啟動子序列中都存在成骨特異性順式元件(osteogenic specific cis element,OSE),Runx2能與之結(jié)合,從而激活這些相關(guān)基因的表達[58]。Jang等使用MXene微粒體外處理間充質(zhì)干細胞后,各成骨相關(guān)基因表達均有所上升。這不僅包括Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2,早期成骨相關(guān)基因OPN基因、中期成骨相關(guān)基因OCN基因,還有晚期成骨相關(guān)基因BSP基因[37]。MXene快速誘導(dǎo)早期標志物的表達在超過1周時下降;中晚期成骨標志物的表達在2周內(nèi)更加活躍。

2.3.2 調(diào)控成骨信號通路 骨骼生成受多種合成代謝信號通路的調(diào)節(jié),包括Wnt/β-catenin、BMP/Smad信號通路、Hedgehog、FAK、ERK、PI3K/AKT等相關(guān)信號通路。這些信號通路通過調(diào)控 Runx2 的表達影響骨形成。Runx2及Osterix被認為是調(diào)控成骨分化的重要節(jié)點,參與組成該成骨分化網(wǎng)絡(luò)的信號通路都直接或間接作用于該節(jié)點并最終調(diào)控其下游靶基因的表達,從而調(diào)節(jié)成骨細胞分化及骨形成[59]。

Wnt/β-catenin信號通路:Wnt/β-catenin信號通路是調(diào)控BMSCs分化為成骨細胞較為重要的一條信號通路。Cui等[60]研究發(fā)現(xiàn),Ti3C2TxMXene納米薄片通過調(diào)控HIF-1α/Wnt信號通路促進人牙周膜細胞(human periodontal ligament cells,hPDLC)成骨分化,加速牙周組織的再生。研究顯示,在Ti3C2Tx(60 mg/L)存在下,β-catenin顯著上調(diào)。此外,Axin2(一種Wnt信號負調(diào)節(jié)因子)的表達增強。

BMP/Smads信號通路:BMP/Smads 信號通路是激活成骨細胞分化及骨形成十分重要的一條通路。研究表明,BMPs通過結(jié)合細胞膜外特異性受體進而激活BMP/Smads信號通路,使下游的Smads蛋白(如Smad1、5)發(fā)生磷酸化,可將TGF-β信號由細胞膜傳至胞核,然后進一步啟動成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子基因(如Runx2、Osterix等)轉(zhuǎn)錄,Runx2、Osterix繼續(xù)促進成骨分化相關(guān)基因ALP、OCN、COL-Ⅰ、BSP及OPN等的表達[61]。Du使用三維打印的MXene復(fù)合支架刺激體外BMSCs的成骨分化,檢測rBMSCs中成骨分化相關(guān)基因ALP、COL-Ⅰ、BMP-2和Runx2的mRNA水平,發(fā)現(xiàn)納米片修飾材料上成骨分化相關(guān)基因的表達量高于未修飾組[62]。這些發(fā)現(xiàn)證明了MXene3D復(fù)合支架可通過BMP/Smads信號通路進行骨誘導(dǎo)。

3 結(jié) 語

本文聚焦于新興二維納米材料MXene在骨組織再生中促成骨的作用機制,介紹了MXene的基本信息和制備方法,分析其理化生物學(xué)性質(zhì),展示其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用情況及應(yīng)用前景,并從細胞學(xué)、材料學(xué)、分子學(xué)匯總報道了MXene成骨相關(guān)機制。

MXene材料本身具備獨特的理化生物學(xué)性質(zhì),能夠通過多種機制調(diào)控骨組織再生重建,在骨組織再生中具備良好應(yīng)用前景。對促骨組織修復(fù)再生具有良好臨床應(yīng)用前景。但是MXene材料在臨床應(yīng)用中仍存在很大的挑戰(zhàn):①應(yīng)明確復(fù)合材料支架在體內(nèi)的生物降解途徑及其潛在的長期毒性,尤其是其生物分布和代謝途徑仍需進行進一步的研究。②應(yīng)進一步明確復(fù)合支架材料表面與組織作用情況,研究高效的表面改性方法和環(huán)境友好的材料制備手段,提高臨床應(yīng)用效率。③進一步明確不同尺寸、成分、形態(tài)的復(fù)合支架材料在體內(nèi)環(huán)境下的性能變化,尤其是生理環(huán)境下的穩(wěn)定性、氧化性等。目前,用于組織再生的MXene納米材料還處于臨床前階段,仍有待于進一步的研究來推廣其臨床應(yīng)用。