玉米花粉高溫脅迫相關(guān)miRNA 的篩選及其靶基因分析

李 川，張盼盼，張美微，牛 軍，穆蔚林，郭涵瀟，喬江方

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 糧食作物研究所，河南 鄭州 450002）

玉米是我國主要糧食作物，也是飼料和工業(yè)原料的重要來源。隨著全球氣候變暖，極端高溫天氣頻發(fā)[1]，嚴重影響了我國尤其是黃淮海夏玉米主產(chǎn)區(qū)玉米的生長發(fā)育、產(chǎn)量和品質(zhì)[2]。一年中的高溫時期（7 月下旬—8 月上旬）恰逢河南省夏玉米的散粉吐絲期，該時期玉米植株對溫度尤其敏感[3]?；ㄆ诟邷孛{迫不僅造成玉米花粉活力降低、雄穗分枝數(shù)減少、花藥瘦癟、小花退化，還影響雌穗的分化和受精作用，最終造成籽粒敗育，減少產(chǎn)量[4]。除此之外，高溫脅迫破壞玉米葉片中葉綠體結(jié)構(gòu)[5]，引起氣孔關(guān)閉[6]，降低光合作用相關(guān)蛋白酶的活性，最終降低光合作用[7]；高溫脅迫加速玉米植株生育過程中多種生理生化反應(yīng)[8]，縮短生育期。灌漿期高溫嚴重縮短玉米灌漿時間[9]，減少籽粒干物質(zhì)積累量，降低籽粒容重[10]，造成夏玉米產(chǎn)量和品質(zhì)下降。因此，深入研究玉米高溫脅迫的響應(yīng)機制意義重大，挖掘響應(yīng)高溫脅迫的重要基因及相關(guān)調(diào)控因子，然后富集分析其本體特征和代謝通路，從而為提高玉米耐高溫性奠定理論基礎(chǔ)。

MicroRNA（miRNA）是真核生物中一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼小RNA，長度在18～25 nt，在植物體內(nèi)參與多種調(diào)節(jié)途徑，包括信號傳導(dǎo)過程、生物和非生物脅迫響應(yīng)過程等[11]。miRNA 在不同植物中具有高度保守性。植物中成熟的miRNA是由長鏈的初級轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過一系列核酸酶的剪切加工而形成的[12-13]。首先，編碼miRNA 的基因在細胞核內(nèi)核苷酸聚合酶的作用下形成長度為幾百個核苷酸的miRNA 初始體（pri-miRNA）。然后，Dicer like 1 酶對pri-miRNA 進行切割形成長度為64～303 nt 的miRNA 前體（pre-miRNA）。pre-miRNA 在Dicer like 1酶的作用下形成雙鏈miRNA，即miRNA/miRNA*，然后再被切割成短的雙鏈miRNA/miRNA*。短的雙鏈miRNA/miRNA*在甲基化酶的作用下3'端的最后一個核苷酸發(fā)生甲基化修飾。之后甲基化的短雙鏈miRNA/miRNA*由細胞核進入細胞質(zhì)，完成miRNA 的生物合成過程，形成成熟的miRNA[14-15]。研究發(fā)現(xiàn)，植物miRNA 的主要作用原理是通過與AGO（Argonaute）蛋白結(jié)合形成RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC），指導(dǎo)其配對的下游靶基因mRNA 的切割[16]。植物miRNA 與靶基因mRNA 互補時可以進行特異性切割，miRNA 的剪切位點精確發(fā)生在miRNA 配對堿基的第10～11 個核苷酸。這是由于miRNA 的結(jié)合位點一般位于基因的開放閱讀框中，且大多數(shù)植物miRNA 與靶基因mRNA 序列是完全匹配的。當植物miRNA 與其靶基因不能足夠互補配對時，miRNA 則主要抑制mRNA 的翻譯作用[17-18]。

miRNA 可以調(diào)控植物生長發(fā)育的多個過程，例如：器官的形態(tài)建成、細胞分化和分裂、新陳代謝過程、信號傳導(dǎo)、激素分泌等[19]。韋懿等[20]發(fā)現(xiàn)，水稻miRNA167 調(diào)控水稻植株的分蘗角度和分蘗數(shù)目。miRNA 可以通過調(diào)控植物激素載體蛋白和受體蛋白的表達來調(diào)節(jié)植物激素的合成及信號傳導(dǎo)途徑，最終影響植物的生長發(fā)育[21]。miRNA 通過調(diào)控相關(guān)靶基因的表達水平在植物逆境脅迫應(yīng)答過程中起到重要調(diào)控作用[22-23]，包括生物脅迫和非生物脅迫（干旱脅迫、營養(yǎng)脅迫、低溫脅迫、高溫脅迫、鹽脅迫等）。隨著多組學(xué)高通量測序技術(shù)的發(fā)展，miRNA 測序技術(shù)在植物研究中被廣泛應(yīng)用。對不同植物種類的營養(yǎng)生長器官進行測序發(fā)現(xiàn)，甘蔗中miRNA319 和miRNA396 響 應(yīng) 冷 脅 迫[24]；小 麥 中miRNA159、miRNA160、miRNA166、miRNA167 響應(yīng)高 溫 脅 迫[25]；miRNA159、miRNA398、miRNA408、miRNA528 在耐旱水稻品種中上調(diào)表達[26]；玉米中miRNA1661在汞脅迫條件下下調(diào)表達[27]。

目前，關(guān)于玉米miRNA 高通量測序研究主要集中于莖葉[28]、根系[29]和雌穗[30]上，主要是針對病原菌侵害[31]、營養(yǎng)脅迫[32]和鹽分脅迫[33]。對不同玉米品種高溫脅迫處理的花粉進行miRNA 高通量測序的研究還沒有報道。為此，以不同耐熱性玉米品種生殖器官花粉為試驗材料，通過對高溫脅迫條件下花粉miRNA 進行高通量測序，篩選高耐熱玉米品種鄭單958 及低耐熱玉米品種先玉335 在高溫脅迫處理后花粉中的差異表達miRNA，然后預(yù)測其靶基因，并對靶基因進行富集分析，為闡明玉米花粉響應(yīng)花期高溫的分子機制提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗地概況及試驗材料

試驗于2023 年在河南省周口市西華縣農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所試驗基地（33°45'44″N、114°26'49″E）進行，土壤類型為黃褐土，肥力均勻，排灌方便。前茬作物為小麥。0～30 cm 耕層土壤基礎(chǔ)養(yǎng)分：有機質(zhì)含量14.10 g/kg、全氮含量0.76 g/kg、堿解氮含量94.97 mg/kg、速效磷含量30.22 mg/kg、速效鉀含量169.53 mg/kg，pH值8.79。

供試材料為高耐熱玉米品種鄭單958（ZD958）、低耐熱玉米品種先玉335（XY335）。

1.2 試驗設(shè)計

ZD958 和XY335 均于2023 年6 月12 日播種，種植密度為67 500 株/hm2，小區(qū)30 行，行長5 m，行距0.6 m，重復(fù)2次，標準化大田管理。

高溫處理采用自建高溫棚模擬，用長20 m、寬6 m、高4 m 的高溫棚框架固定于田間，周圍用透光率為95%的樹脂薄膜覆蓋，高溫棚頂部密封85%，均勻留出15%的空隙便于氣體交換。高溫棚四周上部、中部懸掛溫、濕度計記錄高溫棚內(nèi)溫、濕度。生長箱框架下部周圍樹脂薄膜可以拆移，當溫度過高時移開薄膜降溫，控制高溫處理期間高溫棚內(nèi)氣溫平均高于外界田間3～4 ℃，濕度基本與外界一致。高溫處理從抽雄前（2023 年8 月3 日）開始，每天8：30—17：30通過覆蓋薄膜進行增溫處理。

高溫處理7 d后取花粉樣本，每個樣本由5株盛花期玉米花粉混合組成，生物學(xué)重復(fù)3次，分別命名為HT958-1、HT958-2、HT958-3、HT335-1、HT335-2、HT335-3。對照為正常生長條件下玉米植株的花粉，分 別 命 名 為CK958-1、CK958-2、CK958-3、CK335-1、CK335-2、CK335-3?；ǚ蹣颖玖⒓捶庞诟杀袝簳r保存，在實驗室中于-80 ℃超低溫冰箱中冷凍保存。取樣結(jié)束后拆除高溫棚使玉米植株恢復(fù)正常生長。

1.3 測定方法

1.3.1 玉米花粉miRNA 高通量測序 將高溫處理及正常生長條件下的玉米花粉樣本送至杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司進行miRNA 的文庫構(gòu)建和高通量測序。利用TruSeq Small RNA Sample Prep Kit（Illumina，San Diego，USA）試劑盒構(gòu)建sRNA 文庫。之后用Illumina Hiseq 2500進行高通量測序。

1.3.2 玉米花粉miRNA 測序原始數(shù)據(jù)分析 測序獲得的原始序列通過去除3'接頭序列和垃圾序列獲得干凈序列。篩選保留長度在18～25 nt 的序列。將篩選到的序列與mRNA、RFam（非編碼RNA 家族數(shù)據(jù)庫）、Repbase（真核生物DNA 中重復(fù)序列數(shù)據(jù)庫）數(shù)據(jù)庫進行比對，過濾掉非相關(guān)序列和重復(fù)序列，從而獲得有效序列。對有效序列的長度分布情況進行統(tǒng)計分析。

1.3.3 高溫脅迫相關(guān)差異表達miRNA 篩選 基于miRBase 數(shù)據(jù)庫和公布的玉米自交系B73 基因組序列 數(shù) 據(jù) 庫（https://www.maizegdb.org/）利 用ACGT101-miR（v4.2）軟件進行miRNA 鑒定，并計算每個高溫處理和對照樣本中miRNA 的表達水平。之后依據(jù)不同玉米品種、不同處理中鑒定的miRNA表達水平，篩選差異表達miRNA。差異表達miRNA的篩選標準為|log2FC|＞1 且P＜0.05，其中FC 為差異倍數(shù)。

1.3.4 高溫脅迫相關(guān)差異表達miRNA 的靶基因預(yù)測及富集分析 利用GATAr（v1.0）軟件對差異表達的miRNA 進行靶基因預(yù)測，篩選閾值：不完全匹配位點的最小自由能/完全匹配位點的最小自由能＞0.65，且miRNA 與靶基因匹配位點的罰分值＜4。然后根據(jù)GO（Gene ontology）數(shù)據(jù)庫，將差異表達miRNA 候選靶基因按照參與的生物學(xué)過程、細胞組分、分子功能進行富集分析。根據(jù)KEGG（ Kyoto encyclopedia of genes and genomes）數(shù)據(jù)庫富集分析差異表達miRNA候選靶基因所參與的代謝通路。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2020 和SPSS 25 軟件進行試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，用LSD法和Duncan’s 新復(fù)極差法進行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米花粉中miRNA測序質(zhì)量分析

對12 個玉米花粉樣本miRNA 高通量測序后獲得的原始數(shù)據(jù)去除接頭序列及垃圾序列，獲得干凈序列，篩選長度在18～25 nt的序列，然后通過數(shù)據(jù)庫比對過濾掉無關(guān)和重復(fù)序列后獲得可信序列。由表1 可見，12 個樣本的可信序列Q20 值均在97%之上，可信序列Q30 值均在95%之上，說明測序的堿基錯誤率很低；GC 含量比率均衡，24 nt序列比值在13.59%～33.93%，可見miRNA 高通量測序結(jié)果質(zhì)量可靠。

表1 12個不同樣本中miRNA 測序數(shù)據(jù)分析Tab.1 Statistical analysis of miRNA sequencing data in the 12 different samples

2.2 不同玉米花粉對比組中差異表達miRNA的篩選

基于miRBase 數(shù)據(jù)庫和玉米自交系B73 基因組序列，在所有樣本中共篩選到818 個miRNA 序列。其中，144 個屬于玉米中已知miRNA 序列，268 個屬于近源物種中已知miRNA 序列，406 個屬于全新預(yù)測miRNA 序列。在鄭單958 高溫脅迫花粉與對照花粉對比組（HT958 vs CK958）中，共篩選到19 個差異表達miRNA 序列，其中，15 個miRNA 序列為上調(diào)表達，4 個為下調(diào)表達。其中，3 個miRNA 序列達到了極顯著水平（P＜0.01），分別是（毛果楊）ptcmiR6478_R+2_2ss10GA21GA、（ 葡 萄 ） vvi-MIR3630-p5_2ss19AT20CT、（葡 萄）vvi-MIR3630-p3_2ss19AT20CT；16 個達到顯著水平（P＜0.05），分別是（玉米）zma-miR1661-3p_L+2R-2、（玉米）zmamiR159f-5p、（玉米）zma-miR164f-5p、（預(yù)測全新）PC-3p-106565_83、（玉米）zma-MIR444a-p5_2、（玉米）zma-MIR444a-p5_1、（玉米）zma-MIR11970-p5_2ss14CT17TC、（水稻）osa-miR162a_R+1、（桃）ppemiR1511-3p_L+1R-4、（亞麻薺）cas-miR5139_L-1、（藥 葵）aof-miR5139b_L-3、（水 稻）osa-MIR444ep3、（水 稻）osa-MIR444e-p5、（預(yù) 測 全 新）PC-3p-171082_43、（預(yù)測全新）PC-5p-221631_29、（高粱）sbi-miR5381_L+1R+1_1ss7CT。

在先玉335 高溫脅迫花粉與對照花粉對比組（HT335 vs CK335）中，共篩選到15 個差異表達miRNA 序列，其中，7 個miRNA 序列為上調(diào)表達，8個為下調(diào)表達。其中，1 個miRNA 序列達到了極顯著水平（P＜0.01），為（玉米）zma-miR166j-3p；14個達到顯著水平（P＜0.05），分別是（預(yù)測全新）PC-3p-30995_367、（ 茶 ） tae-MIR9774-p3_2ss5AG22GT、（玉米）zma-miR166a-3p、（預(yù)測全新）PC-3p-54389_191、（ 大 豆）gma-MIR1525-p3_2ss3TA19TG、（水稻）osa-miR535-5p、（二穗短柄草）bdi-MIR444d-p5、（玉米）zma-MIR319a-p5、（玉米）zma-MIR319c-p5、（擬南芥）ath-miR8175_L-2、（預(yù)測全新）PC-3p-208306_32、（預(yù)測全新）PC-3p-142717_56、（預(yù)測全新）PC-5p-17626_673、（預(yù)測全新）PC-3p-100896_89。

在鄭單958 高溫脅迫花粉與先玉335 高溫脅迫花粉對比組（HT958 vs HT335）中，共篩選到85 個差異表達miRNA 序列，其中，35 個miRNA 序列為上調(diào)表達，50 個為下調(diào)表達。其中，24 個miRNA 序列達到了極顯著水平（P＜0.01），分別是（預(yù)測全新）PC-3p-156933_49、（玉 米）zma-miR166l-3p_L+2R-2、（預(yù)測全新）PC-5p-50849_206、（預(yù)測全新）PC-3p-134750_61、（玉 米）zma-miR167e-5p、（葡 萄）vvimiR482_1ss5TC、（預(yù) 測 全 新）PC-3p-138818_59、（ 預(yù) 測 全 新）PC-5p-69263_143、（ 玉 米）zmamiR166j-3p、（預(yù)測全新）PC-3p-40151_272、（預(yù)測全 新）PC-5p-95787_95、（ 預(yù) 測 全 新）PC-5p-106572_83、（玉米）zma-miR167j-3p_L+1、（毛果楊）ptc-miR6478_R+2_1ss21GA、（預(yù) 測 全 新）PC-3p-166198_45、（預(yù)測全新）PC-5p-118017_73、（預(yù)測全新）PC-3p-17225_687、（預(yù)測全新）PC-3p-108744_81、（二 穗 短 柄 草）bdi-miR160f_L+2R-1、（預(yù) 測 全新）PC-3p-10069_1143、（預(yù)測全新）PC-3p-99896_90、（葡萄）vvi-MIR3630-p5_2ss19AT20CT、（葡萄）vvi-MIR3630-p3_2ss19AT20CT、（預(yù) 測 全 新）PC-5p-125138_67；4 個miRNA 序列達到極其顯著水平（P＜0.001），分別是（預(yù)測全新）PC-3p-30995_367、（ 預(yù) 測 全 新）PC-5p-17626_673、（ 玉 米）zmamiR166l-3p、（預(yù)測全新）PC-5p-16098_734。

在HT958 vs CK958 與HT335 vs CK335 對比組（HT958 vs CK958 VS HT335 vs CK335）中，共篩選到94 個差異表達miRNA 序列，其中，28 個miRNA序列達到了極顯著水平（P＜0.01），分別為（預(yù)測全新）PC-3p-10069_1143、（預(yù)測全新）PC-3p-18335_646、（玉 米）zma-miR164f-5p、PC-3p-16028_737、（玉米）zma-miR159f-5p、（玉米）zma-MIR11970-p3_1ss8AG、ptc-miR6478_R+2_2ss10GA21GA、（高 粱）sbi-miR171a、（玉米）zma-miR171d-3p、（玉米）zma-MIR171b-p3、（玉米）zma-MIR171i-p3、（玉米）zma-MIR171f-p3、（玉米）zma-miR396a-3p、（大豆）gma-MIR1525-p3_2ss3TA19TG、（預(yù) 測 全 新）PC-3p-47902_221、（預(yù)測全新）PC-3p-96750_94、（二穗短柄草）bdi-miR160f_L+2R-1、（蘆筍）aof-miR166b_L-2_1ss20CT、（預(yù)測全新）PC-5p-86714_108、（玉米）zma-miR393b-3p_L-1、（毛果楊）ptc-miR6478_R-1_1ss4AG、（ 毛 果 楊 ）ptc-miR6478_R-1_1ss20TA、（玉米）zma-miR171h-3p_L-1R+1、（高粱）sbi-miR5381_L+1R+1_1ss7CT、（ 甜 根 草）ssp-MIR444b-p3、（預(yù)測全新）PC-3p-78777_122、（預(yù)測全新）PC-3p-30810_369、（玉米）zma-miR169p-5p；17 個miRNA 序列達到極其顯著水平（P＜0.001），分別是（預(yù)測全新）PC-30995_367、（預(yù)測全新）PC-3p-17225_687、（預(yù)測全新）PC-3p-7703_1444、（預(yù)測全新）PC-5p-16098_734、（預(yù)測全新）PC-5p-50849_206、（葡萄）vvi-MIR3630-p5_2ss19AT20CT、（葡萄）vvi-MIR3630-p3_2ss19AT20CT、（二穗短柄草）bdi-MIR444d-p5、（預(yù)測全新）PC-5p-90626_102、（預(yù) 測 全 新）PC-3p-40151_272、（玉 米）zma-MIR11970-p5_2ss14CT17TC、（預(yù) 測 全 新）PC-5p-118815_72、（ 二 穗 短 柄 草）bdi-MIR444d-p5_1ss2GA、（預(yù) 測 全 新）PC-3p-100896_89、（預(yù) 測 全新）PC-5p-114734_76、（預(yù)測全新）PC-3p-53028_196、（水稻）osa-miR444a-3p.2。

2.3 玉米花粉中高溫脅迫相關(guān)差異表達miRNA靶基因的富集分析

2.3.1 HT958 vs CK958 對比組 利用GSTAr（v1.0）軟件對HT958 vs CK958 對比組中檢測到的19 個差異表達miRNA 的靶基因進行預(yù)測，共獲得了503 個基因轉(zhuǎn)錄本。將靶基因向GO 數(shù)據(jù)庫中參與的生物學(xué)過程、細胞組分、分子功能中不同條目（Term）映射，計算富集P值獲得顯著富集的GO 條目。由圖1可以看出，HT958 vs CK958 對比組中差異表達miRNA 的靶基因富集較多的25 個生物學(xué)過程條目分別為轉(zhuǎn)錄調(diào)控DNA- 模板（Regulation of transcription，DNA-templated）、微 管 生 物 過 程（Microtubule-based process）、磷 酸 化 作 用（Phosphorylation）、RNA 聚合酶Ⅱ正向調(diào)控轉(zhuǎn)錄過程（Positive regulation of transcription by RNA polymerase Ⅱ）、甲基化作用（Methylation）、RNA 聚合酶Ⅱ調(diào)控轉(zhuǎn)錄過程（Regulation of transcription by RNA polymerase Ⅱ）、蛋 白 質(zhì) 轉(zhuǎn) 運（Protein transport）、蛋白質(zhì)磷酸化（Protein phosphorylation）、有絲分裂DNA 復(fù)制紡錘體檢查點信號（Mitotic DNA replication checkpoint signaling）、細胞骨架組構(gòu)（Cytoskeleton organization）、有絲分裂細胞周期（Mitotic cell cycle）、微管細胞骨架組織（Microtubule cytoskeleton organization） 、DNA 復(fù) 制（DNA replication）、細胞分裂（Cell division）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（Signal transduction）、跨 膜 運 輸（Transmembrane transport）、分生組織起始（Meristem initiation）、COPⅡ-包膜囊泡出芽（COPⅡ-coated vesicle budding）、韌皮部木質(zhì)部組織分化（Phloem or xylem histogenesis）、COPⅡ-包膜囊泡貨物裝載過程（COPⅡ-coated vesicle cargo loading）、DNA 復(fù) 制 起 始（DNA replication initiation）、花 發(fā) 育（Flower development）、有絲分裂細胞周期相變（Mitotic cell cycle phase transition）、調(diào)控細胞周期蛋白依賴絲氨酸/蘇氨酸激酶活性（Regulation of cyclin-dependent protein serine/threonine kinase activity）、含核堿基化合物代謝過程（Nucleobase-containing compound metabolic process）。HT958 vs CK958 對比組中差異表達miRNA 的靶基因富集較多的15 個細胞組分條目分別是細胞核（Nucleus）、細胞膜（Membrane）、細胞質(zhì)（Cytoplasm）、細胞膜的必需組成成分（Integral component of membrane）、原 生 質(zhì) 膜（Plasma membrane）、微管（Microtubule）、溶質(zhì)（Cytosol）、細胞骨 架（Cytoskeleton）、內(nèi) 質(zhì) 網(wǎng)（Endoplasmic reticulum）、線粒體（Mitochondrion）、高爾基體（Golgi apparatus）、復(fù)制識別復(fù)合體的核起源（Nuclear origin of replication recognition complex）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出口部位（Endoplasmic reticulum exit site）、COPⅡ囊泡（COPⅡvesicle coat）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體轉(zhuǎn)運囊泡膜（ER to Golgi transport vesicle membrane）。HT958 vs CK958 對比組中差異表達miRNA 的靶基因富集較多的10 個分子功能條目分別為蛋白質(zhì)結(jié)合（Protein binding）、DNA 結(jié)合（DNA binding）、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性（DNA-binding transcription factor activity）、核苷酸結(jié)合位點（Nucleotide binding）、轉(zhuǎn)移 酶 活 性（Transferase activity）、ATP 結(jié) 合（ATP binding）、金屬離子結(jié)合（Metal ion binding）、RNA 結(jié)合（RNA binding）、水解酶活性（Hydrolase activity）、脂質(zhì)結(jié)合（Lipid binding）。

圖1 HT958 vs CK958對比組中差異表達miRNA靶基因的GO富集分析Fig.1 GO enrichment analysis of target genes of differentially expressed miRNA in HT958 vs CK958 group

依據(jù)KEGG 數(shù)據(jù)庫對HT958 vs CK958 對比組中差異表達miRNA 的靶基因進行代謝通路富集分析（圖2）。HT958 vs CK958 對比組中差異表達miRNA 的靶基因KEGG 富集較顯著的20 個代謝通路分別是谷胱甘肽代謝（Glutathione metabolism）、碳代謝（Carbon metabolism）、花生四烯酸代謝（Arachidonic acid metabolism）、糖 酵 解/糖 異 生（Glycolysis/gluconeogenesis）、葉酸生物合成（Folate biosynthesis）、丙酸鹽代謝（Propanoate metabolism）、賴氨酸降解（Lysine degradation）、β-丙氨酸代謝（Beta-alanine metabolism）、泛酸鹽輔酶A 生物合成（Pantothenate and CoA biosynthesis）、色氨酸代謝（Tryptophan metabolism）、纈氨酸亮氨酸及異亮氨酸降解（Valine，leucine and isoleucine degradation）、植物晝夜節(jié)奏（Circadian rhythm-plant）、苯丙氨酸酪氨酸及色 氨 酸 生 物 合 成（Phenylalanine，tyrosine and tryptophan biosynthesis）、甘氨酸絲氨酸及蘇氨酸代謝（Glycine，serine and threonine metabolism）、戊糖磷酸化通路（Pentose phosphate pathway）、輔酶因子生物合成（Biosynthesis of cofactors）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白質(zhì)加工過程（Protein processing in endoplasmic reticulum）、嘧啶代謝（Pyrimidine metabolism）、代謝通路（Metabolic pathways）、乙醛酸及二羧酸代謝（Glyoxylate and dicarboxylate metabolism）。

圖2 HT958 vs CK958對比組中差異表達miRNA靶基因的KEGG富集分析Fig.2 KEGG enrichment analysis of target genes of differentially expressed miRNA in HT958 vs CK958 group

2.3.2 HT335 vs CK335 對比組 對HT335 vs CK335 對比組中檢測到的15 個差異表達miRNA 的靶基因進行預(yù)測，共獲得了454 個基因轉(zhuǎn)錄本。由圖3 可以看出，HT335 vs CK335 對比組中差異表達miRNA 的靶基因富集較多的25 個生物學(xué)過程條目分別為轉(zhuǎn)錄調(diào)控DNA 模板（Regulation of transcription，DNA-templated）、磷 酸 化 作 用（Phosphorylation）、蛋白質(zhì)磷酸化作用（Protein phosphorylation）、蛋白質(zhì)水解（Proteolysis）、DNA 修復(fù)（DNA repair）、細胞對DNA 損傷刺激的響應(yīng)（Cellular response to DNA damage stimulus）、端粒維持（Telomere maintenance）、DNA 雙鏈解螺旋（DNA duplex unwinding）、DNA 重組（DNA recombination）、跨 膜 轉(zhuǎn) 運（Transmembrane transport）、防 御 反 應(yīng)（Defense response）、RNA 聚合酶ⅡC 末端結(jié)構(gòu)域的磷酸化作用（Phosphorylation of RNA polymerase ⅡC-terminal domain）、RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄延長的正向調(diào)控（Positive regulation of transcription elongation from RNA polymerase Ⅱpromoter）、調(diào)控細胞周期（Regulation of cell cycle）、碳水化合物代謝過程（Carbohydrate metabolic process）、植物器官發(fā)育（Plant organ development）、代謝過程（Metabolic process）、蛋白質(zhì)泛素化（Protein ubiquitination）、茉莉酸介導(dǎo)的系統(tǒng)抗性信號通路（Induced systemic resistance， jasmonic acid mediated signaling pathway）、基 于 微 管 的 運 動（Microtubule-based movement）、植物激素響應(yīng)（Response to auxin）、蛋白質(zhì) 折 疊（Protein folding）、蛋 白 質(zhì) 運 輸（Protein transport）、蛋白質(zhì)脫氨（Protein desumoylation）、參與細胞蛋白質(zhì)分解代謝過程的蛋白質(zhì)水解（Proteolysis involved in cellular protein catabolic process）。HT335 vs CK335 對比組中差異表達miRNA 靶基因富集較多的15 個細胞組分條目分別是細胞膜（Membrane）、細胞核（Nucleus）、細胞膜必需組成成分（Integral component of membrane）、細胞質(zhì)（Cytoplasm）、原生質(zhì)膜（Plasma membrane）、細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復(fù)合物（Cyclindependent protein kinase holoenzyme complex）、細胞內(nèi)膜結(jié)合細胞器（Intracellular membrane-bounded organelle）、微管（Microtubule）、胞外區(qū)（Extracellular region）、細 胞 質(zhì) 基 質(zhì)（Cytosol）、線 粒 體（Mitochondrion）、核糖體（Ribosome）、高爾基體（Golgi apparatus）、溶酶體（Lysosome）、細胞外空間（Extracellular space）。HT335 vs CK335 對比組中差異表達miRNA 靶基因富集較多的10 個分子功能條目分別為ATP 結(jié)合（ATP binding）、核苷酸結(jié)合（Nucleotide binding）、水 解 酶 活 性（Hydrolase activity）、蛋白質(zhì)結(jié)合（Protein binding）、轉(zhuǎn)移酶活性（Transferase activity）、DNA 結(jié) 合 轉(zhuǎn) 錄 因 子 活 性（DNA-binding transcription factor activity）、DNA 結(jié)合（DNA binding）、激酶活性（Kinase activity）、金屬離子結(jié)合（Metal ion binding）、蛋白激酶活性（Protein kinase activity）。

圖3 HT335 vs CK335對比組中差異表達miRNA靶基因的GO富集分析Fig.3 GO enrichment analysis of target genes of differentially expressed miRNA in HT335 vs CK335 group

由圖4 可以看出，HT335 vs CK335 對比組中差異表達miRNA 的靶基因富集較顯著的20 個代謝通路分別是其他多糖降解（Other glycan degradation）、亞油酸代謝（Linoleic acid metabolism）、代謝通路（Metabolic pathways）、硫 胺 素 代 謝（Thiamine metabolism）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白質(zhì)加工過程（Protein processing in endoplasmic reticulum）、脂肪酸延長（Fatty acid elongation）、植物激素信號傳導(dǎo)（Plant hormone signal transduction）、類固醇生物合成（Steroid biosynthesis）、精氨酸生物合成（Arginine biosynthesis）、不同類型的N- 聚糖生物合成（Various types of N-glycan biosynthesis）、酪氨酸代謝（Tyrosine metabolism）、鞘脂類代謝（Sphingolipid metabolism）、脂肪酸降解（Fatty acid degradation）、N-聚糖生物合成（N-glycan biosynthesis）、α-亞麻酸代謝（Alpha-linolenic acid metabolism）、纈氨酸亮氨酸及異亮氨酸降解（Valine，leucine and isoleucine degradation） 、類 苯 基 丙 烷 生 物 合 成（Phenylpropanoid biosynthesis） 、核 質(zhì) 轉(zhuǎn) 運（Nucleocytoplasmic transport） 、 內(nèi) 吞 作 用（Endocytosis）、丙氨酸天冬氨酸及谷氨酸代謝（Alanine，aspartate and glutamate metabolism）。

圖4 HT335 vs CK335對比組中差異表達miRNA靶基因的KEGG富集分析Fig.4 KEGG enrichment analysis of target genes of differentially expressed miRNA in HT335 vs CK335 group

2.3.3 HT958 vs HT335 對比組 對HT958 vs HT335 對比組中檢測到的85 個差異表達miRNA 的靶基因進行預(yù)測，共獲得了2 286 個基因轉(zhuǎn)錄本。由圖5 可以看出，HT958 vs HT335 對比組中差異表達miRNA 的靶基因富集較多的25 個生物學(xué)過程條目分別為轉(zhuǎn)錄調(diào)控DNA- 模板（Regulation of transcription，DNA-templated）、磷 酸 化 作 用（Phosphorylation）、蛋 白 質(zhì) 磷 酸 化（Protein phosphorylation）、蛋白質(zhì)水解（Proteolysis）、跨膜轉(zhuǎn)運（Transmembrane transport）、碳水化合物代謝過程（Carbohydrate metabolic process）、代 謝 過 程（Metabolic process）、蛋 白 質(zhì) 泛 素 化（Protein ubiquitination）、防御反應(yīng)（Defense response）、RNA聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄調(diào)控（Regulation of transcription by RNA polymerase Ⅱ）、DNA 修復(fù)（DNA repair）、甲基化作用（Methylation）、細胞對DNA 損傷刺激的響應(yīng)（Cellular response to DNA damage stimulus）、初級代謝過程（Primary metabolic process）、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運（Protein transport）、多聚糖分解代謝過程（Polysaccharide catabolic process）、DNA 重組（DNA recombination）、細胞大分子代謝過程（Cellular macromolecule metabolic process）、植物激素激活的信號通路（Auxin-activated signaling pathway）、DNA雙鏈解螺旋（DNA duplex unwinding）、信號傳導(dǎo)（Signal transduction）、脂 質(zhì) 代 謝 過 程（Lipid metabolic process）、泛素依賴性蛋白質(zhì)分解代謝過程（Ubiquitin-dependent protein catabolic process）、端粒維持（Telomere maintenance）、mRNA 加工（mRNA processing）。HT958 vs HT335 對比組中差異表達miRNA 的靶基因富集較多的15 個細胞組分條目分別是細胞膜（Membrane）、細胞膜必需組成成分（Integral component of membrane）、細 胞 核（Nucleus）、細胞質(zhì)（Cytoplasm）、原生質(zhì)膜（Plasma membrane）、細 胞 溶 質(zhì)（Cytosol）、胞 外 區(qū)（Extracellular region）、高爾基體（Golgi apparatus）、葉綠體（Chloroplast）、色素體（plastid）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜（Endoplasmic reticulum）、線粒體（Mitochondrion）、胞間連絲（Plasmodesma）、細胞內(nèi)膜結(jié)合細胞器（Intracellular membrane-bounded organelle）、高爾基體膜（Golgi membrane）。HT958 vs HT335 對比組中差異表達miRNA 靶基因富集較多的10 個分子功能條目分別為轉(zhuǎn)移酶活性（Transferase activity）、ATP結(jié)合（ATP binding）、DNA 結(jié)合（DNA binding）、核苷酸結(jié)合（Nucleotide binding）、蛋白質(zhì)結(jié)合（Protein binding）、水解酶活性（Hydrolase activity）、金屬離子結(jié)合（Metal ion binding）、激酶活性（Kinase activity）、蛋白激酶活性（Protein kinase activity）、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性（DNA-binding transcription factor activity）。

圖5 HT958 vs HT335對比組中差異表達miRNA靶基因的GO富集分析Fig.5 GO enrichment analysis of target genes of differentially expressed miRNA in HT958 vs HT335 group

HT958 vs HT335 對比組中差異表達miRNA 的靶基因富集較顯著的20 個代謝通路分別是鞘脂類代謝（Sphingolipid metabolism）、淀粉和蔗糖代謝（Starch and sucrose metabolism）、其他多糖降解（Other glycan degradation）、代謝通路（Metabolic pathways）、半胱氨酸及甲硫氨酸代謝（Cysteine and methionine metabolism）、卟 啉 代 謝（Porphyrin metabolism）、類胡蘿卜素生物合成（Carotenoid biosynthesis）、類 單 萜 生 物 合 成（Monoterpenoid biosynthesis）、精 氨 酸 生 物 合 成（Arginine biosynthesis）、氨 基 酸 生 物 合 成（Biosynthesis of amino acids）、葉 酸 一 碳 庫（One carbon pool by folate）、維生素B6 代謝（Vitamin B6 metabolism）、硫依賴系統(tǒng)（Sulfur relay system）、植物晝夜節(jié)奏（Circadian rhythm-plant） 、 核 質(zhì) 轉(zhuǎn) 運（Nucleocytoplasmic transport）、次級代謝物生物合成（Biosynthesis of secondary metabolites）、植物激素信號傳導(dǎo)（Plant hormone signal transduction）、ABC 轉(zhuǎn)運體（ABC transporters）、戊糖磷酸化通路（Pentose phosphate pathway）、吞噬體（Phagosome）（圖6）。

圖6 HT958 vs HT335對比組中差異表達miRNA靶基因的KEGG富集分析Fig 6 KEGG enrichment analysis of target genes of differentially expressed miRNA in HT335 vs CK335 group

2.3.4 HT958 vs CK958 VS HT335 vs CK335 對比組 對HT958 vs CK958 VS HT335 vs CK335 對比組中檢測到的94 個差異表達miRNA 的靶基因進行預(yù)測，共獲得了4 569 個基因轉(zhuǎn)錄本。由圖7 可以看出，HT958 vs CK958 VS HT335 vs CK335 對比組中差異表達miRNA 的靶基因富集較多的25 個生物學(xué)過程條目分別為轉(zhuǎn)錄調(diào)控DNA-模板（Regulation of transcription，DNA-templated）、磷 酸 化 作 用（Phosphorylation）、蛋 白 質(zhì) 磷 酸 化（Protein phosphorylation）、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運（Protein transport）、蛋白質(zhì)水解（Proteolysis）、RNA 聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄調(diào)控（Regulation of transcription by RNA polymerase Ⅱ）、蛋白質(zhì)泛素化（Protein ubiquitination）、跨膜轉(zhuǎn)運（Transmembrane transport）、初級代謝過程（Primary metabolic process）、甲基化作用（Methylation）、細胞大分子代謝過程（Cellular macromolecule metabolic process）、翻 譯（Translation）、DNA 修 復(fù)（DNA repair）、細胞內(nèi)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運（Intracellular protein transport）、細胞對DNA 損傷刺激的響應(yīng)（Cellular response to DNA damage stimulus）、泛素依賴的蛋白質(zhì)分解代謝過程（Ubiquitin-dependent protein catabolic process）、囊 泡 介 導(dǎo) 的 轉(zhuǎn) 運（Vesiclemediated transport）、調(diào)控催化劑活性（Regulation of catalytic activity）、信號傳導(dǎo)（Signal transduction）、離子 傳 輸（Ion transport）、防 御 響 應(yīng)（Defense response）、碳水化合物代謝過程（Carbohydrate metabolic process）、細胞分裂（Cell division）、DNA 重組（DNA recombination）、轉(zhuǎn)錄正向調(diào)控DNA-模板（Positive regulation of transcription，DNA-templated）。

圖7 HT958 vs CK958 VS HT335 vs CK335對比組中差異表達miRNA靶基因的GO富集分析Fig.7 GO enrichment analysis of target genes of differentially expressed miRNA in HT958 vs CK958 VS HT335 vs CK335 group

HT958 vs CK958 VS HT335 vs CK335 對比組中差異表達miRNA 的靶基因富集較多的15 個細胞組分條目分別是細胞核（Nucleus）、細胞膜（Membrane）、細胞膜必需組成成分（Integral component of membrane）、細胞質(zhì)（Cytoplasm）、原生質(zhì)膜（Plasma membrane）、細 胞 溶 質(zhì)（Cytosol）、內(nèi) 質(zhì) 網(wǎng)（Endoplasmic reticulum）、高 爾 基 體（Golgi apparatus）、線粒體（Mitochondrion）、細胞內(nèi)膜結(jié)合細胞器（Intracellular membrane-bounded organelle）、核糖體（Ribosome）、細胞核（nucleolus）、葉綠體（Chloroplast）、色素體（Plastid）、微管（Microtubule）。HT958 vs CK958 VS HT335 vs CK335 對比組中差異表達miRNA 靶基因富集較多的10 個分子功能條目分別為蛋白質(zhì)結(jié)合（Protein binding）、DNA 結(jié)合（DNA binding）、ATP 結(jié)合（ATP binding）、核苷酸結(jié)合（Nucleotide binding）、轉(zhuǎn)移酶活性（Transferase activity）、金屬離子結(jié)合（Metal ion binding）、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性（DNA-binding transcription factor activity）、水解酶活性（Hydrolase activity）、激酶活性（Kinase activity）、蛋 白 激 酶 活 性（Protein kinase activity）。

由圖8 可見，HT958 vs CK958 VS HT335 vs CK335 對比組中差異表達miRNA 的靶基因富集較顯著的20 個代謝通路分別是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白質(zhì)加工過程（Protein processing in endoplasmic reticulum）、真核生物核糖體生物合成（Ribosome biogenesis in eukaryotes）、剪接體（Spliceosome）、鞘脂類代謝（Sphingolipid metabolism）、內(nèi)吞作用（Endocytosis）、其他多糖降解（Other glycan degradation）、吞噬體（Phagosome）、氨酰轉(zhuǎn)運RNA 生物合成（AminoacyltRNA biosynthesis）、核 質(zhì) 轉(zhuǎn) 運（Nucleocytoplasmic transport）、ABC轉(zhuǎn)運體（ABC transporters）、谷胱甘肽代謝（Glutathione metabolism）、泛酸鹽及輔酶A生物合成（Pantothenate and CoA biosynthesis）、植物激素信號傳導(dǎo)（Plant hormone signal transduction）、光合作用天線蛋 白（Photosynthesis-antenna proteins）、DNA 修復(fù)（DNA replication）、蛋白質(zhì)輸出（Protein export）、賴氨酸降解（Lysine degradation）、泛醌和其他萜類醌生物合成（Ubiquinone and other terpenoidquinone biosynthesis）、葉酸一碳庫（One carbon pool by folate）、單 胺 菌 素 生 物（Monobactam biosynthesis）。

圖8 HT958 vs CK958 VS HT335 vs CK335對比組中差異表達miRNA靶基因的KEGG富集分析Fig.8 KEGG enrichment analysis of target genes of differentially expressed miRNA in HT958 vs CK958 VS HT335 vs CK335 group

3 結(jié)論與討論

本研究發(fā)現(xiàn)，在高溫脅迫下，鄭單958 花粉中miRNA6478 極顯著差異表達。在NaCl 脅迫下，毛竹中miRNA6478 也上調(diào)表達，調(diào)控毛竹萌發(fā)[34]。甘蔗中miRNA6478 通過調(diào)控乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基因CTR1（Constitutive triple response 1）的表達來負調(diào)控乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)響應(yīng)黑穗病菌脅迫[35]。另外，miRNA3630 在高溫脅迫下鄭單958 花粉中極顯著上調(diào)表達。研究發(fā)現(xiàn)，小桐子中miRNA3630響應(yīng)低溫脅迫顯著下調(diào)表達[36]。泡桐中miRNA3630 通過調(diào)控靶基因NLR（Nucleotide biding site-leucine rich repeat）基因家族成員在抗病中發(fā)揮作用，NLR 基因家族成員啟動子區(qū)含有水楊酸、茉莉酸甲酯等激素響應(yīng)元件[37]。本研究發(fā)現(xiàn)，在高溫脅迫下，低耐熱玉米品種先玉335 中miRNA166 極顯著下調(diào)表達。研究發(fā)現(xiàn)，在低溫脅迫下，miRNA166 在冷敏感玉米自交系B73 葉片中上調(diào)表達[38]。42 ℃高溫脅迫處理15 d 后，miRNA166 在耐熱性強蕹菜品種中下調(diào)表達，在耐熱性較差蕹菜品種中顯著上調(diào)表達[39]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在高溫脅迫下，不同耐熱玉米品種花粉中miRNA1661 顯著下調(diào)表達。對水稻miRNA 基因上游1 000 bp 序列進行抗性元件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miRNA1661 含有GA 元件，其對光反應(yīng)敏感[40]。低磷脅迫處理玉米根系24 h 后發(fā)現(xiàn)，miRNA1661 下調(diào)表達[41]。miRNA167 在禾本科植物中高度保守，響應(yīng)非生物脅迫。擬南芥中miRNA167 調(diào)控花器官發(fā)育，其靶基因為生長素響應(yīng)因子，生長素響應(yīng)因子參與植物激素信號傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)多種植物的生長發(fā)育過程[42]。滲透脅迫條件下，擬南芥miRNA167下調(diào)表達，促進生長素積累及側(cè)根伸長[43]。在番茄中過量表達miRNA167 造成葉片變小、雄蕊及花柱變短，引發(fā)雄性不育[44]。本研究發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫下，高耐熱玉米品種鄭單958花粉中miRNA167、miRNA482 均顯著差異表達。在4 ℃儲藏條件下，馬鈴薯中miRNA482上調(diào)表達，參與低溫糖化調(diào)控[45]；在敲除miRNA482 的轉(zhuǎn)基因番茄中，抗氧化酶活性升高，脯氨酸含量增加，丙二醛含量降低，最終提高耐鹽性[45]。miRNA482 的靶基因為響應(yīng)脅迫相關(guān)的CBF（C-repeat responsive element binding factor）轉(zhuǎn)錄因子家族成員和由GAI（Gibberellic acid insensitive）、RGA（Repressor of GA1-3 mutant）和SCR（Scarecrow）所組成的GRAS超級轉(zhuǎn)錄因子家族成員。miRNA482 在鹽脅迫大豆根尖中上調(diào)表達，推測miRNA482 參與調(diào)控大豆對鹽脅迫的響應(yīng)[46]。本研究發(fā)現(xiàn)，miRNA160 在高溫脅迫處理鄭單958 花粉中極顯著表達。miRNA160 在高等植物中普遍高度保守，因此，調(diào)控網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜且多樣化。miRNA160 通過調(diào)控ARF（Auxin response factors）家族成員參與植物生長發(fā)育及響應(yīng)生物脅迫過程。過表達miRNA160 的擬南芥開花時間提前，miRNA160 參與了花期調(diào)控[47]。預(yù)測發(fā)現(xiàn)，小麥中miRNA160 的靶基因為過氧化物酶基因、ARF 家族基因、鉀離子轉(zhuǎn)運蛋白基因等[48]。低溫脅迫條件下，西瓜中miRNA160 下調(diào)表達，負調(diào)控靶基因表達，從而提高西瓜耐冷性[49]。

本研究發(fā)現(xiàn)，鄭單958 玉米花粉中（HT958 vs CK958對比組）19個差異表達miRNA的靶基因顯著富集到GO:0007165 信號傳導(dǎo)（Signal transduction）條目和GO:0009908 花發(fā)育（Flower development）條目。 GO:0007165 信號傳導(dǎo)（Signal transduction）條目相關(guān)的miRNA 包括miRNA1661，其靶基因為Zm00001eb223610；miRNA11970，其 靶 基 因 為Zm00001eb206990；miRNA1511，其 靶 基 因 為Zm00001eb182010；miRNA5139，其 靶 基 因 為Zm00001eb182010。由此可以推測miRNA1661、miRNA11970、miRNA1511、miRNA5139 通過信號傳導(dǎo)模式共同調(diào)控玉米花粉的耐熱性。GO:0009908花發(fā)育（Flower development）條目相關(guān)的miRNA 為miRNA164，其靶基因為Zm00001eb264380。推測miRNA164 通過正調(diào)控靶基因Zm00001eb264380 的表達來調(diào)控玉米花的發(fā)育，從而提高鄭單958 花粉的耐熱性。

本研究發(fā)現(xiàn)，先玉335 玉米花粉（HT335 vs CK335 對比組）中15 個高溫脅迫差異表達miRNA的靶基因顯著富集到GO：0009864 茉莉酸介導(dǎo)的系統(tǒng)抗性信號通路（Induced systemic resistance，jasmonic acid mediated signaling pathway） 、GO：0009733 植物激素響應(yīng)（Response to auxin）、GO：0004672 蛋白激酶活性（Protein kinase activity）、GO：0099402 植 物 器 官 發(fā) 育（Plant organ development）、GO：0016301 激 酶 活 性（Kinase activity）。GO:0009864 茉莉酸介導(dǎo)的系統(tǒng)抗性信號通 路（Induced systemic resistance，jasmonic acid mediated signaling pathway）條 目 相 關(guān) 的miRNA 為miRNA8175，其 靶 基 因 為 Zm00001eb363100、Zm00001eb196470、Zm00001eb093200、Zm00001eb-141160、Zm00001eb405060。GO：0009733 植物激素響 應(yīng)（Response to auxin）條 目 相 關(guān) 的miRNA 為miRNA8175，其 靶 基 因 為 Zm00001eb343460、Zm00001eb353400、Zm00001eb353410、Zm00001eb-353370。GO:0016301 激酶活性（Kinase activity）條目相關(guān)的miRNA 為miRNA8175、miRNA9774。由此推測miRNA8175 通過調(diào)控茉莉酸介導(dǎo)的系統(tǒng)抗性信號通路、植物激素響應(yīng)等條目相關(guān)的多個靶基因的表達正調(diào)控先玉335花粉耐熱性。

本研究首先通過miRNA 高通量測序技術(shù)對高溫脅迫條件下不同耐熱玉米品種花粉中的miRNA進行了對比分析，篩選出高溫脅迫相關(guān)的顯著差異表達miRNA，并對差異表達miRNA 的靶基因進行了GO 功能注釋和KEGG 通路分析。高溫脅迫相關(guān)miRNA 及其靶基因通過復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在玉米花期高溫脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，為進一步探明具體miRNA功能和闡明玉米耐熱性提供理論依據(jù)。