甘草聯(lián)合順鉑對(duì)H22 荷瘤小鼠腫瘤抑制作用及腎損傷保護(hù)作用

連小龍，張尚龍，鄧 毅，2*，張 楠，葉禮巧，馬趣環(huán)，3，楊志軍

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000； 2.甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000； 3.甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院藥物研究所，甘肅 蘭州 730050）

順鉑作為臨床常用抗腫瘤藥物，廣泛用于肝癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌等多種實(shí)體瘤的治療［1］，因其具有的毒副作用，臨床使用受到嚴(yán)重的劑量依賴性限制，表現(xiàn)最為明顯的是腎毒性［2］。而腎損傷是順鉑腎毒性最常見和最嚴(yán)重的表現(xiàn)形式［3］，直接影響化療患者的療效和耐受性。故尋找化療藥的輔助藥物成為癌癥研究領(lǐng)域急需解決的熱點(diǎn)問題。

傳統(tǒng)中醫(yī)藥在輔助臨床用藥方面效果顯著且逐步廣泛應(yīng)用。甘草為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.、脹果甘草GlycyrrhizainflataBat.或光果甘草GlycyrrhizaglabraL.的干燥根和根莖［4］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，甘草具有抗腫瘤、抑菌抗炎、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫等作用。此外，據(jù)《本草正》 記載甘草“味至甘，得中和之性，有調(diào)補(bǔ)之功，故毒藥得之解其毒，剛藥得之和其性”，為解毒“圣藥”。課題組前期研究表明，甘草能夠緩解順鉑誘導(dǎo)的機(jī)體急性毒性［5］。但甘草與順鉑聯(lián)合用藥在抗腫瘤中的研究較少，故本研究通過建立H22荷瘤小鼠模型，探討甘草對(duì)順鉑化療的增效及其腎毒性的保護(hù)作用，以期為甘草和抗腫瘤藥物的聯(lián)合應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)雌雄各半的昆明種小鼠60 只，體質(zhì)量（20±2） g，購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （甘） 2020-0001。小鼠飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK （甘） 2020-0009，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為23 ～25 ℃，相對(duì)濕度55% ～65%，自由飲水進(jìn)食。實(shí)驗(yàn)經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核通過（倫理號(hào)2019-049）。

1.2 細(xì)胞株 小鼠H22肝癌細(xì)胞購自于武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.3 試劑與藥物 甘草采自甘肅省酒泉市，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥教研室馬曉輝鑒定為正品； 順鉑（批號(hào)1A0115B03），購自齊魯制藥有限公司。一抗B 細(xì)胞淋巴瘤2 （Bcl-2，批號(hào)C82721042103）、B 細(xì)胞淋巴瘤2 相關(guān)X 蛋白（Bax，批號(hào)12616090906）、二抗辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體（HRP-IgG，批號(hào)CR2207031） 購自武漢賽維爾生物科技有限公司； 超氧化物歧化酶（SOD，批號(hào)20220505）、丙二醛（MDA，批號(hào)20220506） 試劑盒購自于南京建成生物工程研究所。

1.4 儀器 cobas-c-311 全自動(dòng)生化分析儀（日本日立公司）； 3K15 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（美國Sigma 公司）； JBP5 包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司）； RM2016 切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）； E100 顯微鏡（日本Nikon 公司）； DZF-6210 真空干燥箱 （上海和呈儀器制造有限公司）。

2 方法

2.1 模型建立 取兩次傳代的H22肝癌細(xì)胞懸液，調(diào)整密度為1×106/mL，于小鼠右前肢腋窩下接種0.2 mL 細(xì)胞懸液，5 d 后可觸及結(jié)節(jié)表示建模成功［6-7］。

2.2 分組與給藥 將建模成功的荷瘤小鼠隨機(jī)分為模型組、順鉑組（3 mg/kg） 和順鉑聯(lián)合甘草低、中、高劑量組（3 mg/kg＋0.65、1.30、2.60 g/kg）。2020 年版《中國藥典》 記載甘草的常用劑量為2～10 g，依據(jù)體表面積換算法得到甘草0.65、1.30、2.60 g/kg 相當(dāng)于0.5 倍、1 倍、2倍臨床用量（稱取粉碎后的甘草粉末置于圓底燒瓶中，加入10 倍量70%乙醇熱回流提取2 次，每次3 h，合并藥液，濃縮，在60 ℃、-0.07 MPa 條件下真空干燥，備用）。除模型組外，其余各組小鼠灌胃給予相應(yīng)藥物，每天1 次，順鉑隔天腹腔注射1 次，連續(xù)給藥12 d。隔天測量瘤體長直徑和短直徑，計(jì)算腫瘤體積，末次給藥24 h 后，禁食不禁水，采血，剝離腫瘤組織和腎組織。

2.3 抑瘤率和腎臟指數(shù) 用生理鹽水清洗各組小鼠腫瘤組織和腎臟表面血漬后，稱定質(zhì)量，分別計(jì)算抑瘤率和腎臟指數(shù)。公式為抑瘤率＝ ［（模型組平均瘤質(zhì)量-給藥組平均瘤質(zhì)量） /模型組平均瘤質(zhì)量］ ×100%，腎臟指數(shù)＝ （腎臟質(zhì)量/體質(zhì)量） ×100%。

2.4 血清BUN、Cr 水平檢測 采集的血液靜置2 h 后，4 ℃、3 000 r/min 離心10 min，收集血清，使用全自動(dòng)生化分析儀檢測尿素氮（BUN）、肌酐（Cr） 水平。

2.5 HE 染色 將剝離的腫瘤組織用4%多聚甲醛固定24 h后，脫水、石蠟包埋、切片，常規(guī)HE 染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤和腎臟的病理形態(tài)變化。其中腎臟的病理形態(tài)變化通過腎小管損傷（如腎小管擴(kuò)張、破壞和腎小管壞死等） 百分比來評(píng)估。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［8-9］為0% （正常） 計(jì)0分； 1% ～10%計(jì)1 分； 11% ～25% 計(jì)2 分； 26% ～45% 計(jì)3分； 46% ～75%計(jì)4 分； 76% ～100%計(jì)5 分。

2.6 免疫組化法檢測Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá) 將各組小鼠石蠟包埋的腫瘤和腎組織脫蠟至水化，抗原修復(fù)，加入3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物，用3%BSA 溶液在室溫下封閉30 min。加Bcl-2 （1 ∶500）、Bax （1 ∶400） 一抗4 ℃下孵育過夜。PBS 洗滌后，用辣根過氧化物酶（HRP） 標(biāo)記的二抗在室溫下孵育50 min，DAB 顯色和蘇木精復(fù)染，封片，于顯微鏡下觀察，黃色或棕色沉積即為陽性表達(dá)。每張切片選取中央和四周共5 個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域再隨機(jī)選取5 個(gè)視野，用Image J 軟件計(jì)算平均光密度值，分析Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)。

2.7 腎組織SOD 活性和MDA 水平檢測 嚴(yán)格按照相關(guān)試劑盒說明書操作，采用WST-1 法檢測SOD 活性，TBA 法檢測MDA 水平。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 21.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)均以（±s） 表示，2 組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 順鉑聯(lián)合甘草對(duì)腫瘤生長的影響 由表1 可知，與模型組比較，在第7 天后，順鉑組與順鉑聯(lián)合甘草各劑量組小鼠腫瘤體積減?。≒＜0.05，P＜0.01）； 與順鉑組比較，在第9 天后，順鉑聯(lián)合甘草高劑量組小鼠腫瘤體積減小（P＜0.05，P＜0.01）。由表2 可知，與模型組比較，順鉑組和順鉑聯(lián)合甘草各劑量組小鼠腫瘤質(zhì)量降低（P＜0.01），并呈劑量依賴性。

表1 各組荷瘤小鼠腫瘤體積比較（±s，n＝12）

表1 各組荷瘤小鼠腫瘤體積比較（±s，n＝12）

注： 與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01； 與順鉑組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別腫瘤體積/mm3第1 天第3 天第5 天第7 天第9 天第11 天模型組111.31±36.52546.03±112.53862.17±215.311 239.59±350.511 622.78±318.542 086.48±322.34順鉑組115.63±34.12491.65±98.16776.00±171.50929.89±261.26* 1 098.43±177.35**1 235.12±275.71**順鉑聯(lián)合甘草低劑量組119.96±24.95499.85±162.97760.31±275.03880.41±213.54* 1 093.35±225.31**1 194.83±372.36**順鉑聯(lián)合甘草中劑量組117.75±24.82487.60±143.11739.93±129.93864.16±169.08**946.76±205.94**1 067.93±304.16**順鉑聯(lián)合甘草高劑量組116.38±32.46475.64±95.22635.46±145.59*681.39±213.04**698.48±181.60**＃＃708.40±282.41**＃

表2 各組荷瘤小鼠腫瘤質(zhì)量和抑制率比較（±s，n＝12）

表2 各組荷瘤小鼠腫瘤質(zhì)量和抑制率比較（±s，n＝12）

注： 與模型組比較，**P＜0.01； 與順鉑組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別腫瘤質(zhì)量/mg抑制率/%模型組2 625.32±576.71—順鉑組1 591.71±373.37**39.37順鉑聯(lián)合甘草低劑量組1 462.96±367.14**44.27順鉑聯(lián)合甘草中劑量組1 205.10±361.19**＃54.10順鉑聯(lián)合甘草高劑量組1 007.14±213.28**＃＃61.64

3.2 順鉑聯(lián)合甘草對(duì)腫瘤組織病理形態(tài)學(xué)的影響 由圖1可知，模型組小鼠腫瘤組織細(xì)胞排列緊密且均勻，形態(tài)完整，周圍無壞死腫瘤細(xì)胞； 順鉑組和順鉑聯(lián)合甘草各劑量組小鼠腫瘤組織細(xì)胞間隙較大，可見大量壞死的腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞核碎裂、消失。

圖1 各組荷瘤小鼠腫瘤組織病理形態(tài)變化（HE，×400）

3.3 順鉑聯(lián)合甘草對(duì)腫瘤組織Bcl-2、Bax 表達(dá)的影響 由圖2～3、表3 可知，與模型組比較，順鉑組和順鉑聯(lián)合甘草各劑量組小鼠腫瘤組織Bcl-2 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01），Bax 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05，P＜0.01）； 與順鉑組比較，順鉑聯(lián)合甘草高劑量組小鼠腫瘤組織Bcl-2 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），Bax 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。

圖3 各組荷瘤小鼠腫瘤組織Bax 表達(dá)（×400）

表3 各組荷瘤小鼠腫瘤組織Bcl-2、Bax 表達(dá)比較（±s，n＝12）

表3 各組荷瘤小鼠腫瘤組織Bcl-2、Bax 表達(dá)比較（±s，n＝12）

注： 與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01； 與順鉑組比較，＃P＜0.05。

組別Bcl-2Bax模型組0.48±0.060.21±0.02順鉑組0.34±0.05*0.30±0.05*順鉑聯(lián)合甘草低劑量組0.32±0.06**0.34±0.05**順鉑聯(lián)合甘草中劑量組0.31±0.05**0.36±0.03**順鉑聯(lián)合甘草高劑量組0.24±0.03**＃0.39±0.05**＃

3.4 順鉑聯(lián)合甘草對(duì)腎臟指數(shù)和血清BUN、Cr 水平的影響 由表4 可知，與模型組比較，順鉑組小鼠腎臟指數(shù)和血清BUN、Cr 水平升高（P＜0.01）； 與順鉑組比較，順鉑聯(lián)合甘草各劑量組小鼠腎臟指數(shù)和血清BUN、Cr 水平降低（P＜0.05，P＜0.01）。

表4 各組荷瘤小鼠腎臟指數(shù)和血清BUN、Cr 水平比較（±s，n＝12）

表4 各組荷瘤小鼠腎臟指數(shù)和血清BUN、Cr 水平比較（±s，n＝12）

注： 與模型組比較，**P＜0.01； 與順鉑組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別腎臟指數(shù)/%BUN/（mmol·L-1）Cr/（μmol·L-1）模型組1.09±0.349.52±1.5911.17±2.04順鉑組1.46±0.30**31.01±10.83**33.20±10.44**順鉑聯(lián)合甘草低劑量組1.17±0.14＃＃24.43±8.86＃25.43±7.59＃＃順鉑聯(lián)合甘草中劑量組1.04±0.09＃＃21.15±7.86＃＃21.55±6.36＃＃順鉑聯(lián)合甘草高劑量組0.96±0.08＃＃13.89±4.90＃＃16.19±4.23＃＃

3.5 順鉑聯(lián)合甘草對(duì)腎組織病理形態(tài)學(xué)的影響 由圖4 可知，模型組腎小管結(jié)構(gòu)清楚，未見上皮細(xì)胞水腫及變性；順鉑組腎小管結(jié)構(gòu)不清，細(xì)胞明顯濁腫，胞質(zhì)疏松網(wǎng)狀化，細(xì)胞排列紊亂，部分小管管腔可見壞死、脫落細(xì)胞，出現(xiàn)腎小管擴(kuò)張及蛋白管型； 順鉑聯(lián)合甘草各劑量組小鼠腎臟病變有所改善，僅觀察到腎小管細(xì)胞輕度腫脹及空泡變性，管腔內(nèi)有少量脫落的上皮細(xì)胞。與模型組比較，順鉑組小鼠腎損傷評(píng)分升高（P＜0.01）； 與順鉑組比較，順鉑聯(lián)合甘草各劑量組小鼠腎損傷評(píng)分降低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖4 各組荷瘤小鼠腎組織病理形態(tài)變化（HE，×400，±s，n＝12）

3.6 順鉑聯(lián)合甘草對(duì)腎組織SOD 活性、MDA 水平的影響 由表5 可知，與模型組比較，順鉑組小鼠腎組織SOD活性降低（P＜0.01），MDA 水平升高（P＜0.01）； 與順鉑組比較，順鉑聯(lián)合甘草各劑量組小鼠腎組織SOD 活性升高（P＜0.01），MDA 水平降低（P＜0.01）。

表5 各組荷瘤小鼠腎組織中SOD 活性和MDA 水平比較（±s，n ＝12）

表5 各組荷瘤小鼠腎組織中SOD 活性和MDA 水平比較（±s，n ＝12）

注： 與模型組比較，**P＜0.01； 與順鉑組比較，＃＃P＜0.01。

組別SOD/（U·mg prot-1）MDA/（nmol·mg prot-1）模型組185.40±17.4414.74±2.01順鉑組116.58±27.64**20.85±2.69**順鉑聯(lián)合甘草低劑量組172.42±30.01＃＃13.72±2.41＃＃順鉑聯(lián)合甘草中劑量組189.19±18.53＃＃12.09±2.03＃＃順鉑聯(lián)合甘草高劑量組196.32±25.92＃＃12.86±4.07＃＃

4 討論

肝癌因已成為全球第三大癌癥死亡原因［10］，具有高隱匿性、高病死率、預(yù)后差等特征，其五年生存率約為14.1%［11］。肝癌的早期診斷困難并且病情發(fā)展迅速，故放化療成為主要的治療策略。但抗腫瘤藥物在滅殺腫瘤細(xì)胞時(shí)導(dǎo)致正常細(xì)胞凋亡引起的組織器官損傷是當(dāng)前腫瘤治療中需突破的瓶頸。近年來，中藥因其副作用小、毒性小等優(yōu)點(diǎn)，在抗腫瘤研究領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注，特別是在輔助用藥方面。甘草素有“十方九草” 之說，是傳統(tǒng)中醫(yī)藥的常用中藥，也是“調(diào)和諸藥” 主要藥物，能夠緩解毒性藥物引起的毒性反應(yīng)［12］，而與抗腫瘤藥物聯(lián)用的研究較少，本研究借助H22荷瘤小鼠模型，探討甘草和順鉑聯(lián)用后在化療中的“增效減毒” 作用。

目前，促細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是抗腫瘤最直接有效的方式。Bcl-2 家族蛋白與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，主要分為2類［13］，一類為促凋亡蛋白，包括Bax、Bad、Bid、Bik等； 另一類為抗凋亡蛋白，包括Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-W等。Bcl-2 蛋白是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵抑制劑，與Bax 結(jié)合形成Bax/Bcl-2 二聚體，增加細(xì)胞對(duì)凋亡刺激的敏感性［14］。因此，通過升高Bax 蛋白和降低Bcl-2 蛋白可以促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡［15］。本研究結(jié)果顯示，甘草與順鉑聯(lián)用較順鉑單用Bax 表達(dá)升高，Bcl-2 表達(dá)降低，表明甘草可以增強(qiáng)順鉑的抗腫瘤作用。

此外，攝入機(jī)體的順鉑主要積聚在腎臟中，會(huì)誘導(dǎo)腎細(xì)胞凋亡，臨床上最嚴(yán)重和更常見的表現(xiàn)是急性腎損傷［16］。本研究顯示，順鉑單用組荷瘤小鼠腎小管結(jié)構(gòu)不清，胞質(zhì)疏松網(wǎng)狀化，細(xì)胞排列紊亂，部分小管管腔可見壞死、脫落細(xì)胞，出現(xiàn)腎小管擴(kuò)張及蛋白管型，腎功能生化指標(biāo)（BUN、Cr） 升高，反映了腎組織受到損傷； 而與甘草聯(lián)用后，損傷有所改善。已有研究證實(shí)，氧化應(yīng)激是順鉑毒性中最重要的機(jī)制之一［17］。正常生理狀態(tài)下，產(chǎn)生的自由基被細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶（如SOD） 消除，從而維持自由基產(chǎn)生和消除之間的平衡［18］。MDA 是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，造成細(xì)胞凋亡［19］。順鉑可以增加超氧化物的產(chǎn)生并抑制SOD 活性，造成腎損傷［20］。本研究結(jié)果顯示，甘草與順鉑聯(lián)用較順鉑單用組小鼠腎組織中SOD 活性升高，MDA水平降低，表明甘草通過抑制順鉑引起的氧化應(yīng)激，阻止細(xì)胞凋亡，與前期研究相一致［5］。

綜上所述，甘草與順鉑聯(lián)合用藥，可以增強(qiáng)順鉑的抗腫瘤作用且能預(yù)防其誘導(dǎo)的腎毒性，可能是一種有前途的順鉑臨床應(yīng)用的輔助藥物，故對(duì)其增效和減毒作用機(jī)制的研究值得進(jìn)一步探索。