大鼠子宮肌瘤模型造模方法研究進(jìn)展*

楊榮蘭 李鳳靈 魏 青 彭必龍 徐萌萌

子宮肌瘤是女性生殖系統(tǒng)最常見的良性腫瘤之一[1],好發(fā)于性激素分泌旺盛的育齡期婦女,絕經(jīng)后肌瘤發(fā)展停止或縮小,發(fā)病率難以準(zhǔn)確統(tǒng)計(jì),中國育齡期婦女的患病率約25%,且近年來仍呈上升趨勢[2]。其發(fā)病機(jī)制尚不明確,臨床癥狀多有不相同,亦可無明顯癥狀。常以腹部疼痛、經(jīng)量增加、經(jīng)期延長、月經(jīng)周期縮短、貧血、早產(chǎn)、流產(chǎn)、不孕、壓迫直腸或膀胱等為臨床表現(xiàn)[1-5]。中醫(yī)將子宮肌瘤歸屬于“癥瘕、石瘕”范疇[6]。臨床上以手術(shù)治療和藥物保守治療為主,且臨床上暫無明顯有效藥物治療可以減少平滑肌瘤的大小以及復(fù)發(fā)的預(yù)防。隨病情發(fā)展,當(dāng)患者體內(nèi)子宮肌瘤體積增大,該病存在一定的惡變風(fēng)險[3]。因此,常用動物造模實(shí)驗(yàn)研究該疾病的病因病機(jī)、發(fā)病機(jī)制以及治療和預(yù)防的方法。

子宮肌瘤動物模型的造模方法主要有自發(fā)法、基因工程法、移植法和化學(xué)誘導(dǎo)法等,由于自發(fā)法、基因工程法和移植法需要極高的實(shí)驗(yàn)成本以及技術(shù),故動物實(shí)驗(yàn)最常用的造模方法是化學(xué)誘導(dǎo)法[7]?；瘜W(xué)誘導(dǎo)法是指通過化學(xué)藥物(相關(guān)激素)等運(yùn)用于實(shí)驗(yàn)動物誘導(dǎo)構(gòu)建動物模型的一種方法,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為該造模方法與子宮肌瘤發(fā)生機(jī)制中血清雌激素與孕激素水平升高有一定的相似性?；瘜W(xué)誘導(dǎo)法比較符合人體子宮中肌瘤生長、發(fā)育的過程和疾病發(fā)生發(fā)展的生理病理機(jī)制。動物實(shí)驗(yàn)中,以大鼠為造模對象尤其較多,其造模成功率大致有80%[7]。具體方法包括雌激素單模法和雌孕激素雙模法,其中雌孕激素雙模法又有全程聯(lián)用和后期加入孕激素的方法。此外,從造模時間而言,有短期造模和長期造模之分,目前尚未有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。文章對這些造模方法的具體差異進(jìn)行總結(jié),旨在為臨床治療子宮肌瘤提供基礎(chǔ)技術(shù)和理論支持。

1 大鼠的選擇

1.1 大鼠的年齡大鼠子宮肌瘤模型制備成功決定性的因素很多,選擇適齡的大鼠也是重要因素之一。因子宮肌瘤的發(fā)病人群廣,臨床表現(xiàn)較多且不明顯,具體發(fā)病率難以統(tǒng)計(jì),在孕齡期婦女尤為多見,根據(jù)現(xiàn)在的社會壓力及醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展,該病發(fā)病人群逐漸有年輕化趨勢[8]。雖然暫無確切的發(fā)病機(jī)制,但有不少研究者認(rèn)為該病的高危因素包括年齡>40歲、 初潮年齡小、未生育、晚育、肥胖、多囊卵巢綜合征、 激素補(bǔ)充治療、黑色人種及子宮肌瘤家族史等[1],以上因素均與子宮肌瘤的發(fā)病風(fēng)險增加密切相關(guān)。選取大鼠年齡較小則可能大鼠子宮及平滑肌細(xì)胞未成熟,不利于后期觀察子宮肌瘤大小;選取大鼠年齡較大則可能大鼠的激素和子宮平滑肌組織中鈣神經(jīng)磷酸酶的活性即達(dá)到最高并趨于穩(wěn)定,因而可能降低其造模成功率。根據(jù)子宮肌瘤的發(fā)病率多在育齡期婦女,大多研究選擇鼠齡在2～8個月,平均鼠齡(4.5±0.3)個月的壯年雌性SD大鼠,也有部分研究使用Wistar品系大鼠[9]。

1.2 大鼠的體質(zhì)量及基礎(chǔ)疾病大鼠的體質(zhì)量、大鼠是否存在基礎(chǔ)疾病,都與子宮肌瘤造模的成功有一定的關(guān)系。根據(jù)多數(shù)大鼠子宮肌瘤的相關(guān)研究實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)得知實(shí)驗(yàn)大鼠體質(zhì)量一般為180～230 g[2,10-12],大鼠年齡及體質(zhì)量增長選擇平均體質(zhì)量在(210±10)g即可。根據(jù)毛惠娟等[4]的研究,子宮肌瘤的發(fā)生與代謝綜合征包括心血管疾病及糖尿病等指標(biāo)有一定的關(guān)系,其中血清胰島素樣生長因子-1水平、空腹血糖、三酰甘油、高密度脂蛋白膽固醇水平是子宮肌瘤發(fā)生的危險因素。亦有研究者提出子宮肌瘤的發(fā)病機(jī)制可能與遺傳易感性、性激素水平和干細(xì)胞功能失調(diào)等存在一定的關(guān)系[1]。為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性,減少不可控因素和增加造模成功的機(jī)率,故可選用健康SD雌性大鼠體質(zhì)量(210±10)g。

2 造模方法

2.1 雌激素單模法雌激素單模法是指僅用雌激素進(jìn)行構(gòu)建子宮肌瘤動物模型的一種方法。此方法也有少數(shù)相關(guān)研究人員運(yùn)用,造模周期上也有所不同。張?zhí)m蘭等[13]使用隔日肌肉注射苯甲酸雌二醇注射液 0.05 mg /100 g,3 次/周,共計(jì)10 周的造模方法,子宮系數(shù)、子宮分角下及分角根 部橫徑、子宮平滑肌厚度顯著增大。陳智昌等[14]、周立等[7]采用苯甲酸雌二醇(0.5 mg/kg),每周3次,連續(xù)12周給大鼠腹腔注射進(jìn)行模型構(gòu)建。此造模方法與正常組比較,模型組子宮系數(shù)和雌激素水平均有增加,子宮平滑肌厚度以及血濃度均有一定上調(diào)。單一的雌激素造模劑量、造模周期與子宮肌瘤發(fā)生率也呈正相關(guān),同時雌激素運(yùn)用的頻率與動物病死率也呈正相關(guān)的關(guān)系,但整體造模成功率可達(dá)60%左右。

2.2 雌孕激素雙重造模法雌孕激素雙模法是指運(yùn)用雌激素以及孕激素構(gòu)建子宮肌瘤動物模型的一種方法,該造模方法更符合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為的子宮肌瘤與雌孕激素水平升高存在一定關(guān)系的作用機(jī)制,造模的成功率也有一定上升。雙模法造模子宮平滑肌細(xì)胞增生活躍程度更高,成模后表現(xiàn)更為穩(wěn)定[10],且與子宮肌瘤的發(fā)病原因相吻合,更容易觀察到藥物的治療作用。雌孕激素雙模法從激素的使用情況看,有全程聯(lián)用和后期加入孕激素之分,從造模周期的長短看,存在長期與短期雙模法之分。此外,還有雌孕激素負(fù)荷結(jié)合多因素刺激造模的方法,以期更好地模擬人類患子宮肌瘤的過程。

2.2.1 雌孕激素全程聯(lián)用法雌孕激素全程聯(lián)用是全程以雌激素和孕激素同時參與造模。因目前子宮肌瘤造模方法尚未統(tǒng)一,采用的藥物、劑量以及頻次等都存在差異。較為常見的短期雌孕激素全程聯(lián)用造模法是每天腹腔注射苯甲酸雌二醇注射液0.5 mg/kg連續(xù)30 d,期間每周注射1次孕酮注射液4 mg/kg,最后 5 d 2種激素同時注射,劑量不變[15-20]。雌孕激素全程聯(lián)用法造模在一定的程度上符合了馬林納等[21]的激素異常分泌,使孕激素介導(dǎo)和推動了子宮肌瘤生成的觀點(diǎn)。

造模周期較長的方法,如李亞梅等[22]應(yīng)用持續(xù)8周每周肌內(nèi)注射3次(周一、三、五)黃體酮(1 mg/kg)和3次(周二、四、六)苯甲酸雌二醇(2 mg/kg)造模的方法,通過雌激素和孕激素的交叉干預(yù)成功建立了大鼠模型。雖然在造模過程中出現(xiàn)了8只大鼠死亡,但雌激素和孕激素通過激活相應(yīng)受體誘導(dǎo)了細(xì)胞增殖和分化,從而促進(jìn)子宮肌瘤細(xì)胞有絲分裂和子宮肌瘤的發(fā)生。造模周期相同也有可能在濃度和頻次上有差異。王家平等[23]則連續(xù)8周對大鼠雙腿每日交替注射0.1 ml黃體酮和乙烯雌酚注射液進(jìn)行造模。造模模型組子宮系數(shù)顯著增加,子宮平滑肌肌層顯著增厚,伴有局灶性增生,達(dá)到預(yù)期效果。另有更長周期造模法,使用的是乙烯雌酚和黃體酮配合造模,方法是每周肌內(nèi)注射己烯雌酚(0.4 mg/ml)0.1 ml;和黃體酮(10 mg/ml)0.1 ml[24], 共 15 周建立子宮肌瘤模型,造模效果良好。

2.2.2 后期加入孕激素法雌孕激素雙模法造模后期加入孕激素是相當(dāng)于將造模分為2個階段,第1個階段運(yùn)用的雌激素,第2個階段在第1個階段的基礎(chǔ)上加入孕激素參與造模。與雌孕激素全程聯(lián)用法相比,相同造模周期與劑量的前提下,后期加入孕激素法在孕激素加入的時間上進(jìn)行了調(diào)整。方法是每天1次腹腔注射苯甲酸雌二醇溶液 0.5 mg /kg連續(xù)25 d后,改為每天1次腹腔注射黃體酮注射液4 mg/kg,連續(xù) 5 d[25,26],此法造模組織學(xué)變化和臨床子宮肌瘤病理組織學(xué)相似,較為常用。另有研究者在劑量和造模周期又有些許不同,苯甲酸雌二醇溶液(0.5 mg/kg)的注射時間增至28 d,再以相同劑量的黃體酮加入,連續(xù) 5 d 造模,共計(jì)33 d[27]。

此外,還有造模周期更長的造模方法,周期有8周、12周、16周和20周之分。如楊敏春等[2]應(yīng)用每周2次肌注苯甲酸雌二醇注射液1 mg/kg的劑量連續(xù)8周肌注,于第5周起加用黃體酮注射液5 mg/kg每周2次肌注至第8周進(jìn)行造模。12周造模法則是每周3次肌肉注射苯甲酸雌二醇注射液0.5 mg/kg連續(xù)注射8周后,再每周2次腹腔注射黃體酮注射液4mg/kg連續(xù)注射4周,共計(jì)12周進(jìn)行造模[28,29]。16周造模法是3次/周肌肉注射苯甲酸雌二醇溶液0.06 ml/只(含藥量0.12 mg)16周,于第10周起2次/周加黃體酮注射液0.05 ml/只(含藥量1 mg)[30];或者黃體酮注射周期縮短為4周[31]。20周造模法,每周3次肌內(nèi)注射苯甲酸雌二醇注射液0.05 mg/100 g,共 20 周; 第 14 周至20周2次/周,加注黃體酮注射液0.04 mg/100 g,共7周[11, 32],同樣也能達(dá)到造模預(yù)期效果。

吳曉貞等[10]比較了12周全程聯(lián)用法和后期加入孕激素法造模效果的差異,發(fā)現(xiàn)全程給藥、后期加入孕激素組法均能成功制備子宮肌瘤大鼠模型,其中全程聯(lián)用法較優(yōu)。綜上所述,后期加入孕激素造模與雌孕激素全程聯(lián)用造模方法在一定程度上均能表現(xiàn)出大鼠子宮平滑肌不同程度的增生,大鼠血清和子宮中ER與PR水平均有顯著的上升趨勢,但效果稍遜于全程聯(lián)用法。

2.2.3 雌孕激素負(fù)荷結(jié)合多因素刺激法另有少數(shù)研究者使用雌孕激素負(fù)荷結(jié)合多因素刺激法建立子宮肌瘤模型,如有研究[33,34]運(yùn)用己烯雌酚藥液以每天每只1.35 mg·kg-1的量進(jìn)行灌胃,再以3次/周的頻率對每只鼠肌注1.0 mg黃體酮注射液連續(xù)5周進(jìn)行造模;同時于第4周起對每只大鼠進(jìn)行0.9 mg·(kg·d)-1鹽酸腎上腺素注射液皮下注射,并每周隨機(jī)選用以下2種刺激:噪音刺激、冰水浴游泳、晝夜顛倒、懸尾等。該造模方法雖然耗時耗力,但從中、西醫(yī)學(xué)的角度觀察該造模方法較貼近人類患子宮肌瘤的過程。另有何嘉倫等[35]每天1次肌肉注射苯甲酸雌二醇 0.1 mg,每周3次肌肉注射黃體酮1 mg,并每天飼喂高糖高脂飼料,連續(xù)5周進(jìn)行性激素刺激協(xié)同胰島素抵抗的方法建立子宮肌瘤模型,造模效果基本與臨床子宮肌瘤患者的病理改變一致。

3 總結(jié)與展望

綜上所述,常用苯甲酸雌二醇、己烯雌酚和黃體酮等激素藥物構(gòu)建大鼠子宮肌瘤模型。其中應(yīng)用雌激素單模法造模的較少,該方法多使用苯甲酸雌二醇構(gòu)模;而應(yīng)用雌孕激素雙模法造模在化學(xué)誘導(dǎo)模型中占的比例較大。雌激素單模法應(yīng)用的雌激素均為苯甲酸雌二醇,而雌孕激素雙模法多是苯甲酸雌二醇和黃體酮搭配運(yùn)用參與造模,少部分運(yùn)用己烯雌酚和黃體酮搭配構(gòu)模。子宮肌瘤模型構(gòu)建的方法尚未統(tǒng)一,在雌孕激素雙模法中存在造模周期長短之分,長則有20、16、15、12周,短則有1個月甚至7 d之短。因?yàn)樵炷Ｖ芷诘拈L短不一,所以藥物種類、劑量、頻率也存在較大的差異以及較多的選擇。大部分還是以10～16周為造模周期,小部分采用30 d以內(nèi)頻率,不過近年來短期造模的使用也不斷在上升。雖激素藥使用的劑量和頻率以及使用的周期各有不同,但該造模方法的成功率也在使用中不斷上升。

綜合不同研究,采用的大鼠子宮肌瘤模型造模方法、藥物、藥物劑量、藥物的使用頻率及造模周期等,發(fā)現(xiàn)構(gòu)建子宮肌瘤模型采用的基本原理是使雌激素和孕激素水平異常升高來推動子宮肌瘤生成,最常用的造模方法是雌孕激素雙模法。該文旨在為后續(xù)臨床研究獲取更有價值的研究成果提供基礎(chǔ)理論支持。