細(xì)菌纖維素明膠/絲素蛋白雙層支架的制備及其性能

孫衛(wèi)華 陳馳昊 李喆 呂向國(guó) 王秀華

收稿日期： 2022-03-14網(wǎng)絡(luò)出版日期：2023-07-03網(wǎng)絡(luò)出版日期

基金項(xiàng)目： 浙江省基礎(chǔ)公益研究計(jì)劃項(xiàng)目（LGG21E030010）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（51703078）

作者簡(jiǎn)介： 孫衛(wèi)華（1996-），河南鶴壁人，碩士研究生，主要從事生物醫(yī)用材料方面的研究。

通信作者： 李喆，E-mail：lizhe830817@163.com

細(xì)菌纖維素-明膠/絲素蛋白雙層支架的制備及其性能

孫衛(wèi)華1，陳馳昊2，李喆2，呂向國(guó)3，王秀華1

（1.浙江理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，杭州 310018；2.嘉興學(xué)院材料與紡織工程學(xué)院，浙江嘉興 314001；3.上海交通大

學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院泌尿科，上海 200127）

摘要： 為了獲得能夠模擬尿道組織多尺度結(jié)構(gòu)的細(xì)菌纖維素復(fù)合明膠/絲素蛋白雙層支架，以明膠（Gelatin， Gel）/絲素蛋白（Silk fibroin， SF）為原料，通過(guò)冷凍干燥法制備Gel/SF管狀多孔支架，并以Gel/SF為模板，采用原位發(fā)酵法將細(xì)菌纖維素（Bacterial cellulose， BC）與Gel/SF支架復(fù)合，獲得細(xì)菌纖維素-明膠/絲素蛋白（Gel/SF/BC）雙層支架，并對(duì)Gel/SF/BC雙層支架的結(jié)構(gòu)及性能進(jìn)行測(cè)試表征。結(jié)果表明：Gel/SF/BC雙層支架具有尿道組織的宏觀形貌，形成了內(nèi)致密外疏松的多孔雙層結(jié)構(gòu)，外層以Gel/SF多孔支架為骨架，內(nèi)層由單純BC膜構(gòu)成，BC納米纖維分布在多孔孔壁表面；Gel/SF/BC雙層支架具有良好的力學(xué)性能、吸水性能及生物相容性。通過(guò)該方法制備的雙層支架能夠高度模擬尿道組織的多尺度結(jié)構(gòu)，有望應(yīng)用于尿道組織的再生修復(fù)。

關(guān)鍵詞： 雙層支架；明膠；絲素蛋白；原位發(fā)酵法；細(xì)菌纖維素

中圖分類(lèi)號(hào)： Q811.8

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)： 1673-3851 （2024） 01-0030-09

引文格式：孫衛(wèi)華，陳馳昊，李喆，等. 細(xì)菌纖維素-明膠/絲素蛋白雙層支架的制備及其性能［J］. 浙江理工大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)），2024，51（1）：30-38.

Reference Format： SUN Weihua， CHEN Chihao， LI Zhe， et al. Preparation and properties of a bacterial cellulose gelatin/silk fibroin bilayer scaffold［J］. Journal of Zhejiang Sci-Tech University，2024，51（1）：30-38.

Preparation and properties of a bacterial cellulose gelatin/silk fibroin bilayer scaffold

SUN Weihua1， CHEN Chihao2， LI Zhe2， L Xiangguo3， WANG Xiuhua1

（1.School of Materials Science & Engineering， Zhejiang Sci-Tech University， Hangzhou 310018， China; 2.College of Materials and Textile Engineering， Jiaxing University， Jiaxing 314001， China; 3.Urology， Renji Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine， Shanghai 200127， China）

Abstract： To obtain a bacterial cellulose composite gelatin/silk fibroin bilayer scaffold that can simulate the multi-scale structure of urethral tissue， gelatin（Gel）/silk fibroin （SF） was used as the raw material to prepare Gel/SF tubular porous scaffold by freeze-drying method. Gel/SF was used as the template and bacterial cellulose （BC） was compounded with the Gel/SF scaffold by in situ fermentation， bacterial cellulose-gelatin/silk fibroin （Gel/SF/BC） bilayer scaffold was obtained， and the structure and performance of the Gel/SF/BC bilayer scaffold were tested and characterized. The results show that the Gel/SF/BC bilayer scaffold has a macroscopic morphology of urethral tissue， forming a porous bilayer structure with dense inner and loose outer layers. The outer layer takes the Gel/SF porous scaffold as the skeleton， and the inner layer is composed of a simple BC membrane. BC nanofibers are distributed on the surface of the porous pore wall. The Gel/SF/BC double-layer scaffold has good mechanical properties， water absorption performance， and biocompatibility. The double-layer scaffold prepared by this method can highly simulate the multi-scale structure of urethral tissue， and is expected to be applied to the regeneration and repair of urethral tissue.

Key words： double layer scaffold; gelatin; silk fibroin; in situ fermentation; bacterial cellulose

0引言

長(zhǎng)段尿道狹窄是泌尿外科一種常見(jiàn)的疾病，組織工程技術(shù)有望成為治愈該疾病的有效方法。支架材料可以為細(xì)胞生長(zhǎng)提供空間結(jié)構(gòu)與力學(xué)支撐，并通過(guò)模擬體內(nèi)微環(huán)境促進(jìn)組織重建與再生，因此在組織工程研究中具有重要作用［1-3］。研究表明，高度模擬細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellularmatrix，ECM）的納米三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)會(huì)影響細(xì)胞行為，進(jìn)而提高細(xì)胞黏附、增殖及蛋白表達(dá)，促進(jìn)組織重建［4-7］。

天然可降解的生物材料已廣泛用于制備尿道組織工程支架。明膠（Gelatin， Gel）和絲素蛋白（Silk fibroin， SF）是尿道組織工程中常用的兩種天然生物材料。Gel具有良好的生物相容性及可降解性，且降解產(chǎn)物毒性較低；SF具有良好的力學(xué)強(qiáng)度及可塑性。以明膠和絲素蛋白為原料制備的疏松多孔支架，兼具兩者的優(yōu)良性能。BC具有良好的持水性能、機(jī)械性能及生物相容性，且其三維納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)能夠完美模擬天然ECM［8-10］。因此，BC三維納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)與Gel/SF多孔支架進(jìn)行結(jié)合，有望應(yīng)用于尿道組織修復(fù)。

本文將Gel與SF水溶液進(jìn)行混合，通過(guò)冷凍干燥法制備Gel/SF管狀多孔支架，探究了不同預(yù)凍溫度對(duì)支架多孔結(jié)構(gòu)的影響，選擇與尿道組織多孔結(jié)構(gòu)相近的Gel/SF支架，并以其為模板，采用原位發(fā)酵法使BC與Gel/SF支架復(fù)合，最終得到具有多尺度結(jié)構(gòu)的雙層支架Gel/SF/BC。對(duì)Gel/SF/BC雙層支架的結(jié)構(gòu)及性能進(jìn)行測(cè)試表征，分析其微觀形貌、化學(xué)結(jié)構(gòu)、力學(xué)性能及生物相容性。本文的研究結(jié)果可為尿道、血管、皮膚等組織工程支架的設(shè)計(jì)與構(gòu)筑提供新的思路與方法。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1實(shí)驗(yàn)材料與儀器

主要材料：木葡糖酸醋桿菌1.1812，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；酵母膏、魚(yú)粉蛋白胨和戊二醛（生物試劑），購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖、磷酸氫二鈉、檸檬酸、磷酸二氫鉀、無(wú)水乙醇和明膠（分析純），購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；曲拉通 X-100（化學(xué)純），購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；最低限量基本培養(yǎng)基（MEM，AH29917357），購(gòu)自上海橋星貿(mào)易有限公司；L-929細(xì)胞（購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)）；胎牛血清（FBS，NYN0769），購(gòu)自上海橋星貿(mào)易有限公司；二苯基四氮唑溴鹽（MTT，J17GS15117），購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；青霉素鏈霉素（J210042），購(gòu)自上海橋星貿(mào)易有限公司；高糖液體培養(yǎng)基（DMEM，PM150210），購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司；苯酚和溴化鋰（分析純），購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；2，4-二硝基氯苯（分析純），購(gòu)自上海博飛美科化學(xué)科技有限公司；十二烷基硫酸鈉（色譜純），購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；高密度聚乙烯薄膜（海門(mén)市揚(yáng)子醫(yī)療器械有限公司）；雄性豚鼠（普通級(jí)），購(gòu)自邳州市東方養(yǎng)殖有限公司；道康寧硅膠及其固化劑（DC184），購(gòu)自北京瑞德佑業(yè)科技有限公司；蠶繭（浙江嘉欣絲綢股份有限公司）。

主要儀器：超聲診斷儀（東芝Aplio 500），購(gòu)自日本東芝醫(yī)療系統(tǒng)株式會(huì)社；冷凍干燥機(jī)（SCIENTZ-18N），購(gòu)自上海雙旭電子有限公司；3D打印機(jī)（Creater Pro），購(gòu)自浙江閃鑄三維科技有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9082），購(gòu)自濟(jì)源千司生物技術(shù)有限公司；立式高壓蒸汽滅菌鍋（申安LDZX-50KBS），購(gòu)自上海習(xí)仁科學(xué)儀器有限公司；掃描電鏡（Apreo S），購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司；傅里葉變換紅外光譜儀（VERTEX 70），購(gòu)自德國(guó)布魯克公司；X射線薄膜衍射儀（D8 ADVANCE型），購(gòu)自德國(guó)布魯克公司；萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)（Instron 5982），購(gòu)自美國(guó)英斯特朗公司。

1.2Gel/SF管狀多孔支架的制備

圖1為Gel/SF管狀多孔支架的制備流程圖。通過(guò)超聲掃描獲取尿道組織二維斷層圖片（圖1（a）），對(duì)二維斷層圖片做數(shù)據(jù)識(shí)別處理，利用imaris軟件對(duì)處理后的系列二維斷層圖片進(jìn)行三維重建及擬合（圖1（b）），再經(jīng)3DMax軟件平滑處理后得到尿道三維數(shù)字模型（圖1（c）），3D打印得到ABS材質(zhì)的尿道節(jié)段性三維實(shí)體模型（圖1（d））。硅膠和固化劑按照質(zhì)量比100∶5進(jìn)行混合，將3D打印模型放入方形透明塑料器皿中并注入上述混合試劑，固化后的硅膠進(jìn)行倒模處理，得到具有尿道組織宏觀形貌的硅膠模具（圖1（e））。將Gel/SF混合倒入硅膠模具，冷凍干燥后得到Gel/SF管狀多孔支架（圖1（f））。

將10 g脫膠處理后的蠶繭在質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%的溴化鋰溶液中60℃條件下溶解5 h，多層紗布過(guò)濾，然后用去離子水透析3 d，每隔12 h換水；透析完成后的SF溶液冷凍干燥，制得純SF。取純SF溶于去離子水中，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的SF水溶液，將Gel溶于45℃去離子水中，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的明膠溶液，將兩種溶液等體積混合后注入硅膠模具中，分別在-20、-80℃以及液氮（-196℃）中冷凍12 h，然后進(jìn)行冷凍干燥，得到Gel/SF管狀多孔支架。

1.3Gel/SF/BC雙層支架的制備

配制發(fā)酵培養(yǎng)液（5 g/L酵母膏、5 g/L魚(yú)粉蛋白胨、50 g/L葡萄糖、2 g/L磷酸氫二鈉、1 g/L檸檬酸、1 g/L磷酸二氫鉀），待上述物質(zhì)充分溶解后，放入立式高壓蒸汽滅菌鍋中進(jìn)行滅菌，并在121℃、0.1 MPa下滅菌30 min。

采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的戊二醛無(wú)水乙醇溶液交聯(lián)Gel/SF管狀多孔支架10 min，用發(fā)酵培養(yǎng)液清洗3次，置換出多余的戊二醛溶液。將處理后的Gel/SF管狀多孔支架重新放置于硅膠模具中，配制菌種密度為107個(gè)/mL的木葡糖酸醋桿菌發(fā)酵培養(yǎng)液，并將其注入模具內(nèi)。待發(fā)酵培養(yǎng)液充分浸潤(rùn)Gel/SF管狀多孔支架后，放入恒溫培養(yǎng)箱中，35℃發(fā)酵培養(yǎng)7 d，獲得Gel/SF/BC雙層支架。將雙層支架浸入醫(yī)用酒精消毒處理24 h，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的曲拉通 X-100浸泡處理24 h，并用超純水清洗3次，除去多余的試劑。

1.4樣品表征

1.4.1形貌及結(jié)構(gòu)分析

采用掃描電鏡對(duì)管狀樣品內(nèi)表面及橫截面結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，采用Image J軟件進(jìn)行測(cè)量，并用Origin軟件統(tǒng)計(jì)進(jìn)行分析（n=200，n為統(tǒng)計(jì)數(shù)量），利用傅里葉變換紅外光譜儀及X射線薄膜衍射儀對(duì)雙層支架進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)測(cè)試。

1.4.2孔隙率測(cè)試

采用乙醇置換法測(cè)量支架孔隙率。取凍干后的支架稱(chēng)重為m1，將其完全浸沒(méi)在無(wú)水乙醇中，用濾紙輕蘸去表面多余液體后稱(chēng)重為m2；將多孔支架放入20 mL量筒中，緩慢倒入乙醇至10 mL，添加乙醇的體積為V；計(jì)算樣品的孔隙率，每組支架測(cè)試3個(gè)樣品?？紫堵蔖用式（1）計(jì)算：

P/%=（m2-m1）/ρc（10-V）×100（1）

其中：m1為支架凍干后的質(zhì)量，g；m2為浸泡無(wú)水乙醇2 h后的質(zhì)量，g；V為添加的乙醇的體積，mL；ρc為無(wú)水乙醇密度，g/mL。

1.4.3吸水量測(cè)試

將支架置于去離子水中浸泡24 h，支架取出后用濾紙將支架表面多余的水分擦拭干凈，用電子天平稱(chēng)重得到濕態(tài)質(zhì)量Ws，然后將支架進(jìn)行冷凍干燥，稱(chēng)重得到干態(tài)質(zhì)量Wd。計(jì)算出支架的吸水量，每組支架測(cè)試3個(gè)樣品。吸水量通過(guò)式（2）計(jì)算：

Sr=Ws-WdWd（2）

其中：Sr為吸水量；Ws為支架在去離子水中浸泡24 h后的質(zhì)量，g；Wd為冷凍干燥后所得干態(tài)質(zhì)量，g。

1.4.4力學(xué)性能測(cè)試

采用萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)對(duì)材料進(jìn)行力學(xué)性能測(cè)試。將樣品統(tǒng)一裁剪為25×4×2 mm3的樣條進(jìn)行拉伸力學(xué)性能的測(cè)試，拉伸速率為5 mm/min。

循環(huán)壓縮力學(xué)性能測(cè)試：濕態(tài)下的Gel/SF多孔支架以及Gel/SF/BC雙層支架進(jìn)行壓縮循環(huán)測(cè)試。將樣品采用相同的工藝條件，統(tǒng)一制備為直徑15 mm，高16 mm的圓柱狀樣品，壓縮至樣品發(fā)生60%形變，然后恢復(fù)至0%，壓縮速率為10 mm/min，重復(fù)10次循環(huán)。

1.4.5細(xì)胞毒性試驗(yàn)

體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)按照GB/T 16886.5—2017《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第5部分：體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)》（GB/T 16886.5—2017）進(jìn)行測(cè)試。將L-929細(xì)胞在含10%胎牛血清和抗生素（青霉素100 μg/mL，鏈霉素100 μg/mL）的MEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)后，分別加入100 μL Gel/SF/BC試驗(yàn)樣品浸提液（100%）、陽(yáng)性對(duì)照（含0.5%苯酚的DMEM培養(yǎng)液）和陰性對(duì)照液（高密度聚乙烯薄膜的浸提液），37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h，每組做6個(gè)平行；培養(yǎng)24 h后，做細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及吸光度的測(cè)定。

1.4.6皮膚致敏和皮膚刺激試驗(yàn)

皮膚致敏試驗(yàn)和皮膚刺激試驗(yàn)按照《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第10部分：刺激與皮膚致敏試驗(yàn)》（GB/T 16886.10—2017）進(jìn)行測(cè)試。

皮膚致敏試驗(yàn)過(guò)程：選取15只雄性豚鼠將其分為2組：其中陰性對(duì)照組為5只動(dòng)物/組，試驗(yàn)組為10只動(dòng)物/組。試驗(yàn)前24 h將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背部左側(cè)去毛，去毛范圍約為4～6 cm2。無(wú)菌條件下制備Gel/SF/BC樣品與陰性對(duì)照組，樣品規(guī)格為2.5 cm×2.5 cm，將試驗(yàn)組（Gel/SF/BC）及對(duì)照組（醫(yī)用紗布）樣品在動(dòng)物背部去毛區(qū)域進(jìn)行貼敷并誘導(dǎo)激發(fā)致敏反應(yīng)。在24 h與48 h后觀察動(dòng)物激發(fā)部位皮膚反應(yīng)，并按照Magnusson and Kligman分級(jí)表評(píng)分。

皮膚刺激試驗(yàn)過(guò)程：在給藥前24 h內(nèi)，將動(dòng)物背部?jī)蓚?cè)去毛，去毛面積約為10 cm×15 cm。將試驗(yàn)組（Gel/SF/BC）及對(duì)照組（醫(yī)用紗布）樣品在兩側(cè)去毛區(qū)域進(jìn)行貼敷并做包扎處理，貼敷持續(xù)4 h后，移除樣品。移除樣品后分別于1、24、48 h和72 h觀察動(dòng)物皮膚紅斑和水腫反應(yīng)并按照皮膚反應(yīng)記分表進(jìn)行記分。

2結(jié)果與討論

2.1Gel/SF管狀多孔支架在不同預(yù)凍溫度下的多孔結(jié)構(gòu)

圖2為不同預(yù)凍溫度下制備的Gel/SF管狀多孔支架截面SEM圖像及孔徑分布。圖2顯示：預(yù)凍溫度為-20℃的Gel/SF管狀多孔支架為大孔結(jié)構(gòu)，孔洞之間連通性較好，孔徑為（141±78）μm（圖2（a））；隨著預(yù)凍溫度降低至-80℃，Gel/SF多孔結(jié)構(gòu)的孔徑變小，且孔洞周?chē)植加虚]合的凹陷結(jié)構(gòu)，孔洞之間的連通性較差，孔徑為（23±18）μm（圖2（b））；在-20 ℃和-80 ℃下，Gel/SF管狀多孔支架孔徑大小以及結(jié)構(gòu)變化，發(fā)現(xiàn)在恒定溫度場(chǎng)下，冰晶顆粒生長(zhǎng)至最終定型時(shí)的尺寸隨著溫度降低而變小，冷凍干燥升華從而形成具有不同孔徑的多孔結(jié)構(gòu)；-196 ℃的Gel/SF支架的多孔結(jié)構(gòu)類(lèi)似于一種取向結(jié)構(gòu)，孔徑為（88±23）μm（圖2（c））。研究發(fā)現(xiàn)，-196℃下的多孔結(jié)構(gòu)孔徑并沒(méi)有隨著溫度的下降而減小。這是因?yàn)楣枘z模具自身的低導(dǎo)熱性，在冷凍時(shí)一維方向上存在溫度場(chǎng)（即-196℃到室溫35℃），冰晶沿著一維方向的溫度場(chǎng)而生長(zhǎng)，導(dǎo)致冷凍干燥所形成的多孔結(jié)構(gòu)會(huì)存在取向結(jié)構(gòu)，且不同位置處截面的多孔結(jié)構(gòu)及孔徑大小存在差異［10-11］。由于人尿道脫細(xì)胞基質(zhì)海綿體層孔徑大小為100～300 μm，因此，在-20℃的冷凍條件制備的Gel/SF管狀多孔支架更適合作為尿道組織修復(fù)支架。

2.2Gel/SF/BC雙層支架微觀形貌分析

圖3為-20℃預(yù)凍溫度下所制備的Gel/SF/BC雙層支架SEM圖像。Gel/SF/BC內(nèi)側(cè)是單純BC形成的致密層，外側(cè)是以Gel/SF管狀多孔支架為骨架復(fù)合BC納米纖維的多孔疏松層，多孔疏松層是由微米級(jí)的多孔結(jié)構(gòu)組成，孔與孔之間相互連通，孔徑的大小為（143±40）μm（圖3（a）），與同條件下制備的Gel/SF管狀多孔支架孔徑一致。

進(jìn)一步對(duì)多孔結(jié)構(gòu)內(nèi)壁同一位置進(jìn)行分級(jí)觀察，在微米級(jí)多孔結(jié)構(gòu)內(nèi)壁存在BC三維納米網(wǎng)絡(luò)纖維，納米級(jí)纖維直徑為（78±24）nm（圖3（b））。觀察Gel/SF/BC雙層支架的致密層，其內(nèi)表面擁有致密的細(xì)菌纖維素層，厚度為（29±4）μm，納米纖維相互交錯(cuò)形成的蛛網(wǎng)結(jié)構(gòu)，構(gòu)成蛛網(wǎng)結(jié)構(gòu)的納米纖維直徑在（44±8）nm（見(jiàn)圖3（c））。納米纖維的分布呈現(xiàn)蛛網(wǎng)結(jié)構(gòu)，是由于Gel/SF管狀多孔支架與木醋桿菌在培養(yǎng)液中的靜電作用力，改變了木醋桿菌的聚集狀態(tài)，進(jìn)而影響到納米纖維的自組裝過(guò)程，最后呈現(xiàn)出不同形貌結(jié)構(gòu)的納米纖維網(wǎng)絡(luò)［12］。靜態(tài)培養(yǎng)的細(xì)菌纖維素為三維無(wú)序納米纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，而通過(guò)靜電作用力的控制可得到特殊的蛛網(wǎng)結(jié)構(gòu)或樹(shù)枝狀結(jié)構(gòu)［13］。在雙層支架的多尺度結(jié)構(gòu)中，納米級(jí)纖維占比為87.5%，亞微米級(jí)纖維占比12.5%。因此，BC的納米纖維貫穿于Gel/SF管狀多孔支架的內(nèi)壁及其內(nèi)表面。

對(duì)比原位發(fā)酵法所制備的Gel/SF/BC雙層支架與人尿道脫細(xì)胞基質(zhì)的多尺度結(jié)構(gòu)，結(jié)果如表1所示。由表1可知，Gel/SF/BC雙層支架與尿道脫細(xì)胞基質(zhì)的厚度近乎一致，雙層支架的疏松多孔層平均孔徑（143±40）μm，其內(nèi)壁納米纖維直徑為（78±24）nm，致密層納米纖維直徑（44±8）nm。而人尿道的脫細(xì)胞基質(zhì)海綿體層孔徑（146±39）μm，納米纖維直徑（30±7）nm，致密層納米纖維直徑（25±5）nm。因此，Gel/SF/BC雙層支架的多尺度結(jié)構(gòu)接近于人體尿道脫細(xì)胞基質(zhì)。

2.3Gel/SF/BC雙層支架化學(xué)結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)FT-IR和XRD對(duì)BC、Gel/SF以及Gel/SF/BC進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果如圖4所示。圖4（a）顯示：BC具有典型的細(xì)菌纖維素的特征峰，其中在3356 cm-1處的吸收峰歸屬于O—H的伸縮振動(dòng)，2894 cm-1附近為CH2的振動(dòng)吸收，1652 cm-1為O—H的面內(nèi)變形振動(dòng)吸收峰，1323、1162 cm-1和1060 cm-1為C—H、C—O—C、C—O的伸縮振動(dòng)峰；Gel/SF在1632、1531 cm-1均有明顯的吸收峰，對(duì)應(yīng)于酰胺I、酰胺Ⅱ，在1239 cm-1的吸收峰對(duì)應(yīng)于酰胺Ⅲ［14-15］；Gel/SF/BC雙層支架具有BC和Gel/SF的特征峰，與Gel/SF 酰胺I（1632 cm-1）、酰胺Ⅱ（1531 cm-1）吸收峰對(duì)比，Gel/SF/BC的酰胺I（1625 cm-1）、酰胺Ⅱ（1513 cm-1）向低波數(shù)方向移動(dòng)，說(shuō)明細(xì)菌纖維素與明膠/絲素蛋白復(fù)合支架之間產(chǎn)生了少量的氫鍵。圖4（b）顯示：BC特征峰位于14.4°、20.4°和22.6°，分別對(duì)應(yīng)著（11-0）、（110）以及（200）晶面，屬于典型的纖維素I晶型［16］；Gel/SF多孔支架并沒(méi)有出現(xiàn)很強(qiáng)的衍射峰，而是在20°左右出現(xiàn)了較寬的散射峰，表明Gel和SF主要是以無(wú)定形結(jié)構(gòu)而存在的；Gel/SF/BC雙層支架觀察到除了Gel/SF較寬的散射峰，在20°、23°也存在BC微弱的特征峰［17］。結(jié)合FT-IR與XRD分析，說(shuō)明Gel/SF多孔支架存在少量的BC。

2.4Gel/SF/BC雙層支架孔隙率及吸水量

組織工程支架應(yīng)具有較高的孔隙率及相互連通的多孔結(jié)構(gòu)，這對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移以及新陳代謝等有著重要的影響［18］。對(duì)不同樣品孔隙率及吸水量進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知Gel/SF支架和Gel/SF/BC雙層支架的孔隙率都在80%以上，對(duì)于尿道組織工程而言已基本滿足［19］。Gel/SF多孔支架孔隙率為85.8%，Gel/SF/BC雙層支架的孔隙率為81.3%，雙層支架的孔隙率相對(duì)Gel/SF較低，是因?yàn)镚el/SF多孔結(jié)構(gòu)的孔壁上原位生長(zhǎng)的BC對(duì)其孔隙率有一定的影響。Gel/SF/BC雙層支架的吸水量為16.1，是Gel/SF的1.1倍，兩者由于其多孔結(jié)構(gòu)存在，均具有較強(qiáng)的吸水性能。但Gel/SF/BC雙層支架的多孔結(jié)構(gòu)里原位生長(zhǎng)了納米級(jí)BC，并具有更小孔徑的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，使得該雙層支架的吸水性能較Gel/SF具有明顯的提升。

2.5Gel/SF/BC雙層支架力學(xué)性能分析

天然BC本身具有良好的力學(xué)性能，其應(yīng)用于支架材料的制備可使材料的力學(xué)性能得到改善［20］。對(duì)不同樣品的拉伸性能進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果如圖6所示。Gel/SF/BC雙層支架在72.5 kPa處發(fā)生材料的斷裂（見(jiàn)圖6（a）），其斷裂強(qiáng)度與斷裂伸長(zhǎng)率分別是Gel/SF的1.3倍和1.1倍（見(jiàn)圖6（b）），這表明Gel/SF/BC雙層支架具有更好的抵抗外力拉伸形變能力，原位發(fā)酵生長(zhǎng)的BC為Gel/SF支架帶來(lái)力學(xué)性能上的提升。

新生的組織需要適當(dāng)?shù)膲嚎s力學(xué)性能提供支撐，以提供和維護(hù)細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的空間環(huán)境，并維持一定時(shí)間直至新生組織具有一定的自身生物力學(xué)特性［21-22］。對(duì)不同樣品進(jìn)行壓縮性能的比較，結(jié)果如圖7所示。Gel/SF/BC雙層支架第一次循環(huán)壓縮的應(yīng)力-應(yīng)變曲線所對(duì)應(yīng)的最大應(yīng)力為88.2 kPa，楊氏模量為127.7 kPa，在經(jīng)過(guò)第十次循環(huán)壓縮后其最大壓縮應(yīng)力降低為83.1 kPa，楊氏模量降低為90.9 kPa，其第一次循環(huán)壓縮對(duì)應(yīng)的最大壓縮應(yīng)力以及楊氏模量分別為Gel/SF的1.4倍、1.6倍，經(jīng)過(guò)第十次循環(huán)壓縮對(duì)應(yīng)的最大壓縮應(yīng)力以及楊氏模量分別為Gel/SF的1.4倍、1.7倍（見(jiàn)圖7（c）—（d））。這表明Gel/SF/BC雙層支架具有更好的耐壓縮性能，Gel/SF/BC雙層支架上原位生長(zhǎng)的BC含有大量羥基，與Gel/SF形成氫鍵，提高了雙層支架的力學(xué)性能。

2.6雙層支架細(xì)胞毒性測(cè)試

采用二苯基四氮唑溴鹽（MTT）比色法，用各實(shí)驗(yàn)組的浸提液培養(yǎng)L-929細(xì)胞，并對(duì)其增殖情況進(jìn)行評(píng)價(jià)。細(xì)胞經(jīng)過(guò)24 h的培養(yǎng)后，對(duì)比不同實(shí)驗(yàn)組的吸光度，結(jié)果如圖8所示。陽(yáng)性對(duì)照組對(duì)比其他組的吸光度較低，顯微鏡觀察L-929細(xì)胞幾乎沒(méi)有增長(zhǎng)，這表明在含0.5%苯酚的DMEM培養(yǎng)液中細(xì)胞無(wú)法正常增殖生長(zhǎng)。對(duì)比陽(yáng)性組，空白樣品、陰性對(duì)照組及Gel/SF/BC浸提液（100%），實(shí)驗(yàn)組的吸光度相對(duì)較強(qiáng)，說(shuō)明細(xì)胞生長(zhǎng)狀況較好。對(duì)比實(shí)驗(yàn)組的吸光度（OD值），發(fā)現(xiàn)Gel/SF/BC實(shí)驗(yàn)組樣品浸提液OD值（0.218±0.002）稍低于空白對(duì)照組（0.324±0.012）。按照標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定空白對(duì)照組對(duì)應(yīng)的存活率為100%，則實(shí)驗(yàn)組Gel/SF/BC的存活率為86.7%。對(duì)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察，僅觀察到輕微的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象，推測(cè)Gel/SF/BC雙層支架在采用曲拉通 X-100浸泡處理去除內(nèi)毒素后，存在微量的殘留，從而影響了細(xì)胞生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)樣品的細(xì)胞存活率為86.7%，高于標(biāo)準(zhǔn)中細(xì)胞存活率應(yīng)不小于70%的要求，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)樣品Gel/SF/BC對(duì)L-929無(wú)明顯細(xì)胞毒性。

2.7雙層支架皮膚致敏性與皮膚刺激性測(cè)試

皮膚致敏性實(shí)驗(yàn)結(jié)果：Gel/SF/BC樣品與陰性對(duì)照組樣品評(píng)分均為0（無(wú)明顯改變），陽(yáng)性對(duì)照組評(píng)分為2（致敏物為2，4-二硝基氯苯，中度融合性紅斑），說(shuō)明Gel/SF/BC樣品無(wú)皮膚致敏性。

皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)結(jié)果：Gel/SF/BC樣品實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組原發(fā)性刺激指數(shù)均為0（極輕微刺激性），陽(yáng)性組（20%十二烷基硫酸鈉）原發(fā)性刺激指數(shù)均為4.1（中等微刺激性），說(shuō)明Gel/SF/BC樣品無(wú)皮膚刺激性。

3結(jié)論

本文采用原位發(fā)酵法將BC與Gel/SF管狀多孔支架復(fù)合，得到具有模擬尿道組織多尺度結(jié)構(gòu)的Gel/SF/BC雙層支架。Gel/SF/BC雙層支架表現(xiàn)出良好的力學(xué)性能、吸水性能及生物相容性，在尿道組織工程材料具有一定的應(yīng)用前景。主要結(jié)論如下：

a）制備的Gel/SF/BC雙層支架，實(shí)現(xiàn)了對(duì)尿道組織宏觀形貌、微米級(jí)多孔、納米級(jí)纖維的結(jié)構(gòu)模擬。Gel/SF/BC雙層支架宏觀形貌長(zhǎng)度為9.3 mm，平均孔隙率為83.1%，其中：內(nèi)側(cè)致密層由直徑為（44±8）nm的單純BC構(gòu)成，外側(cè)多孔疏松層以孔徑為（143±40）μm的Gel/SF多孔支架為骨架，直徑為（78±24）nm的BC納米纖維在其孔壁表面分布。

b）Gel/SF/BC雙層支架其力學(xué)強(qiáng)度相比于Gel/SF多孔支架有所提升，Gel/SF/BC斷裂強(qiáng)度為72.5 kPa，是Gel/SF的1.3倍。Gel/SF/BC經(jīng)過(guò)10次循環(huán)壓縮對(duì)應(yīng)的最大壓縮應(yīng)力以及楊氏模量分別為Gel/SF的1.4倍、1.7倍。Gel/SF/BC雙層支架相比于Gel/SF多孔支架吸水量有所提升，為Gel/SF的1.1倍。

c）Gel/SF/BC雙層支架無(wú)細(xì)胞毒性、無(wú)皮膚致敏與皮膚刺激反應(yīng)，具有較好的生物相容性，能夠應(yīng)用于尿道組織工程。

參考文獻(xiàn)：

［1］李露. 泌尿系統(tǒng)組織工程支架材料的研究進(jìn)展［J］. 生物化工， 2022， 8（5）： 173-175.

［2］田廣超， 范應(yīng)中， 苑思彤， 等. 尿道下裂Duckett術(shù)后并發(fā)吻合口狹窄的相關(guān)因素分析［J］. 臨床小兒外科雜志， 2022， 21（5）： 445-451.

［3］傅強(qiáng). 復(fù)雜性尿道狹窄診療技術(shù)的創(chuàng)新與推廣［J］. 上海醫(yī)學(xué)， 2022， 45（7）： 461-464.

［4］Nnabugwu I I， Onuh A C， Anyimba S K， et al. Comparing complications of urethral stricture across various ages： a retrospective analysis of findings from retrograde urethrogram and voiding cysto-urethrogram over 10 years［J］. BMC Medical Imaging， 2019， 19（1）： 84.

［5］Bakhshandeh B， Zarrintaj P， Oftadeh M O， et al. Tissue engineering; strategies， tissues， and biomaterials［J］. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews， 2017， 33 （2）： 144-172.

［6］張逸， 任思聰， 皇甫慧敏， 等. 支架材料對(duì)成血管微環(huán)境的影響及作用機(jī)制［J］. 中國(guó)組織工程研究， 2023， 27（21）： 3391-3397.

［7］Yang， M， Zhang Y， Fang C， et al.Urine-microenvironment-initiated composite hydrogel patch reconfiguration propels scarless memory repair and reinvigoration of the urethra［J］. Advanced Materials， 2022， 34（14）： e2109522.

［8］徐清棟， 雷彩虹， 朱海霖， 等. 絲素/明膠復(fù)合材料的比例對(duì)小鼠止血性能的影響［J］. 浙江理工大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2018， 39（1）： 45-50.

［9］王莉， 劉濤， 丁新波， 等. 絲素-殼聚糖/聚氧化乙烯雙層納米纖維膜制備及其生物活性［J］. 浙江理工大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2022， 47（4）： 474-481.

［10］江雨， 吳擢彤， 王寶秀， 等. 定向冷凍明膠支架的原位細(xì)菌纖維素培養(yǎng)及支架中的細(xì)胞行為［J］. 合成技術(shù)及應(yīng)用， 2020， 35（2）： 5-8.

［11］李喆， 呂向國(guó)， 王寶秀， 等. 雙層細(xì)菌纖維素基組織工程尿道支架的設(shè)計(jì)與初步構(gòu)建［J］. 組織工程與重建外科雜志， 2016， 12（5）： 276-280.

［12］Wu Z， Jiang Y， Li Z， et al. Bacterial cellulose nanofiber distribution on gelatin and silk fibroin scaffolds and the cell behavior［J］. Cellulose， 2020， 28（1）： 91-102.

［13］李喆. 基于納米纖維空間結(jié)構(gòu)可控的仿生組織工程支架及制法： 112691234A［P］. 2021-04-23.

［14］Chen Y， Zhou X， Lin Q， et al. Bacterial cellulose/gelatin composites： In situ preparation and glutaraldehyde treatment［J］. Cellulose， 2014， 21（4）： 2679-2693.

［15］王曙東， 馬倩， 王可， 等. 絲素蛋白/明膠復(fù)合水凝膠的結(jié)構(gòu)與生物相容性［J］. 紡織學(xué)報(bào)， 2020， 41（11）： 41-47.

［16］萬(wàn)嘉， 吳擢彤， 王寶秀， 等. 細(xì)菌纖維素/明膠復(fù)合止血海綿的制備與性能研究［J］. 合成技術(shù)及應(yīng)用， 2022， 37（1）： 30-36.

［17］王耀強(qiáng)， 王濤， 李旖曦， 等. 細(xì)菌纖維素膜純化條件的優(yōu)化及性能表征［J］. 福建師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2023， 39（1）： 38-47.

［18］Blume C， Kraus X， Heene S， et al. Vascular implants new aspects for in situ tissue engineering［J］. Engineering in Life Sciences， 2022， 22（3）： 344-360.

［19］Huang J W， Lv X G， Li Z， et al. Urethral reconstruction with a 3D porous bacterial cellulose scaffold seeded with lingual keratinocytes in a rabbit model［J］. Biomedical Materials， 2015， 10（5）： 055005.

［20］肖劍虹， 趙正宜， 鄒多宏. 殼聚糖-細(xì)菌纖維素復(fù)合膜的制備及其生物相容性的研究［J］. 安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)， 2022， 57（8）： 1177-1181.

［21］Wang B， Lv X， Li Z， et al. A simple method for controlling the bacterial cellulose nanofiber density in 3D scaffolds and its effect on the cell behavior［J］. Cellulose 2019， 26（12）： 7411-7421.

［22］楊銘， 張楷樂(lè)， 王營(yíng)， 等. 牛血清白蛋白-羥基磷灰石構(gòu)建的組織工程支架用于尿道損傷修復(fù)的效果［J］. 上海醫(yī)學(xué)， 2022， 45（3）： 165-170.

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