含吡唑酮基團的喹唑啉衍生物的合成及其作為EGFR/VEGFR-2雙靶標酪氨酸激酶抑制劑

許佳敏,魏洪磊,李亞鑫,楊磊夫,莫善雁,胡利明

(北京工業(yè)大學 化學與生命科學學院,環(huán)境與病毒腫瘤學北京市重點實驗室,北京 100124)

喹唑啉類衍生物具有廣泛的生物活性,在抗病毒、抗腫瘤、抗菌、抗瘧和抗高血壓等方面受到廣泛的關注[1-3]。近年來,含喹唑啉母核結構的藥物用于非小細胞肺癌、慢性粒細胞白血病和乳腺癌等惡性腫瘤的治療中,如吉非替尼(Gefitinib)、厄洛替尼(Erlotinib)、卡奈替尼(Canertinib)、阿法替尼(Afatinib)、達科替尼(Dacomitinib)和來那替尼(Neratinib)等,這類藥物靶向酪氨酸激酶如EGFR、VEGFR-2靶標。由于這類藥物使用后易產(chǎn)生抗性,因此克服這種抗性是目前研究針對酪氨酸激酶的新結構小分子抑制劑是臨床研究的熱點[4-7]。酪氨酸激酶抑制劑的使用導致患者在服藥后數(shù)月內對表皮生長因子受體靶標的酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)產(chǎn)生抗藥性,其中獲得性抗性是繼發(fā)性T790M(外顯子20)中蘇氨酸取代的蛋氨酸突變控制點發(fā)生的最常見機制[8]。為了克服這種抗性,同時考慮到實體瘤細胞的生長轉移都伴隨著血管的生成,因此通過抑制腫瘤血管的生成,從而抑制腫瘤細胞生長。由于腫瘤細胞的大量增殖需要新生血管來供應營養(yǎng)物質和新陳代謝,因此表皮生長因子受體-2(VEGFR-2)表達會比較高[9-13]。帕唑帕尼(Pazopanib)和阿西替尼(Axitinib)等含氮雜環(huán)藥物已用于以VEGFR為靶標的癌癥臨床治療中[14-15]。(圖1)

圖1 以EGFR或VEGFR-2為靶標用于治療腫瘤的臨床藥物

本實驗室前期分別針對EGFR和VEGFR開展了酪氨酸激酶抑制劑的研究工作[16-18],在研究過程中發(fā)現(xiàn)適當結構的小分子能同時與EGFR和VEGFR相互作用,這就提示了是否能開發(fā)出一類EGFR和VEGFR雙靶標的抑制劑?多靶標藥物是酪氨酸激酶抑制劑研究的熱點之一,一方面多靶標藥物能改善腫瘤耐藥性的出現(xiàn),另一方面能降低多組分藥物的毒副作用,控制藥物使用量。

基于本實驗前期研究的新型二噁烷并喹唑啉衍生物作為EGFR靶標的酪氨酸激酶抑制劑骨架結構,引入吡唑啉酮環(huán)以增強其同VEGFR-2靶標的相互作用,基于多藥效團的拼合設計出EGF/VEGFR雙靶標酪氨酸激酶抑制劑(圖2)。

圖2 目標化合物設計

反應物二噁烷并喹唑啉中間體參考本實驗室的研究工作[16-18]合成,反應物吡唑酮中間體的合成參考文獻[19]合成。目標化合物是由二噁烷并喹唑啉中間體和吡唑酮中間體通過親核取代反應合成。目標化合物骨架結構上的修飾位點較多,能夠為其結構改造獲得較強生物活性化合物提供可能性。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

FA2004A型電子天秤(上海精天電子儀器有限公司);精密顯微熔點測定儀(北京福凱儀器有限公司);Advance 400型核磁共振儀(德國Bruker,TMS為內標,氘代氯仿為溶劑);G3250AALC/MSD TOF型system-高分辨質譜儀(美國安捷倫公司)。

乙酰乙酸乙酯,二氯甲烷,乙酸乙酯,石油醚,甲醇(福晨化學(天津)試劑有限公司),所有試劑均為分析純;中間體2的合成參考本實驗室前期合成路線[16-18],中間體4的合成參考文獻[19]。

1.2 中間體氯代二噁烷并喹唑啉衍生物(2)的合成

中間體2的合成路線見圖3,具體合成方法參考文獻[16-18]。以2,3,4-三羥基苯甲酸為原料,依次于碘甲烷、氯化芐、冰乙酸、1,2-二溴乙烷、鈀炭催化脫芐基和與不同的脂肪族鹵代烴等6步反應形成相應的8-取代氧基-2,3-二氫苯并[b][1,4]二噁烷-5-羧酸甲酯(1a～1e)。該中間體經(jīng)硝化、鈀炭-氫氣催化還原、乙酸甲瞇關環(huán)反應、再與與三氯氧磷反應生成中間體10-氯-5-取代氧基-2,3-二氫-[1,4]二噁烷[2,3-f]喹唑啉(2a～2e)。

圖3 氯代二噁烷并喹唑啉中間體的合成路線

1.3 中間體吡唑酮衍生物4的合成

中間體4的合成路線見圖4,合成方法參考文獻[19]。以4-取代苯肼鹽酸鹽和乙酰乙酸乙酯為原料反應生成2-(4-取代苯基)-5-甲基-1,2-二氫-3H-吡唑-3-酮,通過甲基化反應、Vilsmeier反應、氧化反應、酰胺化反應等5步反應生成2-(4-取代苯基)-N-(4-羥基苯基)1,5-二甲基-3-氧代-2,3-二氫-1H-吡唑-4-甲酰胺(4a～4d)。

圖4 中間體吡唑酮衍生物 4 合成路線

1.4 目標化合物5的合成

目標化合物5的合成采用圖5的合成路線,其合成方法為:將化合物2(0.2 mmol)用5 mL異丙醇溶解,加入碳酸鉀(69 mg,0.5 mmol),攪拌10 min,再加入化合物4(0.26 mmol),回流反應8 h后冷卻至室溫有固體析出,過濾,濾餅用異丙醇洗滌(3×45 mL),得白色或灰白色終產(chǎn)物5a～5o。

圖5 目標化合物 5 合成路線

N-(4-((5-甲氧基-2,3-二氫-[1,4]二噁烷[2,3-f]喹唑啉-10-基)氧基)苯基)-1,5-二甲基-3-氧代-2-苯基-2,3-二氫-1H-吡唑-4-甲酰胺(5a):產(chǎn)率62%;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:10.78(s,1H),8.52(s,1H),7.79(d,J=8.8 Hz,2H),7.57(t,J=7.6 Hz,2H),7.48(t,J=7.4 Hz,1H),7.39(d,J=7.6 Hz,2H),7.28(s,1H),7.18(d,J=8.8 Hz,2H),7.01(s,1H),4.82(dt,J=12.1 Hz,6.0 Hz,1H),4.47(s,4H),3.50(d,J=5.3 Hz,2H),3.36(d,J=10.6 Hz,3H),2.81(d,J=9.2 Hz,3H),1.51(d,J=6.0 Hz,6H);13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ:166.00,164.02,161.46,155.33,153.62,153.06,148.72,148.21,139.26,136.39,133.15,129.80,128.95,128.75,126.42,122.36,120.81,103.01,101.70,100.50,100.06,71.52,64.44,64.19,50.87,33.60,21.78,12.02;HR-MS(ESI)m/z:calcd for C29H26N5O6{[M+H]+},540.1883,found,540.1883。

N-(4-((5-異丙氧基-2,3-二氫-[1,4]二噁烷[2,3-f]喹唑啉-10-基)氧基)苯基)-1,5-二甲基-3-氧代-2-苯基-2,3-二氫-1H-吡唑-4-甲酰胺(5b):產(chǎn)率75%;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:10.78(s,1H),8.52(s,1H),7.79(d,J=8.8 Hz,2H),7.57(t,J=7.6 Hz,2H),7.48(t,J=7.4 Hz,1H),7.39(d,J=7.6 Hz,2H),7.18(d,J=8.8 Hz,2H),7.01(s,1H),4.82(dt,J=12.1 Hz,6.0 Hz,1H),4.47(s,4H),3.50(d,J=5.3 Hz,2H),3.36(d,J=10.6 Hz,3H),2.95～2.76(m,3H),1.51(d,J=6.0 Hz,6H);13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ:166.00,164.02,161.46,155.33,153.62,153.06,148.72,148.21,139.26,136.39,129.80,128.95,128.75,126.42,122.36,120.81,103.01,101.70,100.50,100.06,71.52,64.44,64.19,50.87,33.60,21.78,12.02; HR-MS(ESI)m/z:calcd for C31H30N5O6{[M+H]+} 568.2196,found 568.2198。

N-(4-((5-甲氧基丙氧基-2,3-二氫-[1,4]二噁烷[2,3-f]喹唑啉-10-基)氧基)苯基)-1,5-二甲基-3-氧代-2-苯基-2,3-二氫-1H-吡唑-4-甲酰胺(5c):產(chǎn)率64%;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:10.78(s,1H),8.53(s,1H),7.78(dd,J=9.5 Hz,2.5 Hz,2H),7.55(dd,J=6.7 Hz,4.8 Hz,2H),7.48(t,J=7.4 Hz,1H),7.43～7.34(m,2H),7.21～7.15(m,2H),7.08(s,1H),4.47(q,J=4.6 Hz,4H),4.12(t,J=7.1 Hz,2H),3.62(t,J=6.1 Hz,2H),3.38(d,J=7.2 Hz,6H),2.81(s,3H),2.21(m,2H);13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ:166.03,164.00,161.46,155.28,154.39,153.10,148.59,148.14,139.15,136.44,133.20,132.73,129.79,128.95,126.43,122.36,120.79,101.00,100.01,70.41,68.35,64.47,64.09,59.33,33.59,25.39,12.01; HR-MS(ESI)m/z:calcd for C32H32N5O7{[M+H]+} 598.2302,found 598.2302。

N-(4-((5-(3-嗎啉基丙氧基)-2,3-二氫-[1,4]二噁烷[2,3-f]喹唑啉-10-基)氧基)苯基)-1,5-二甲基-3-氧代-2-苯基-2,3-二氫-1H-吡唑-4-甲酰胺(5d):產(chǎn)率62%;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:10.79(s,1H),8.52(s,1H),7.78(d,J=8.9 Hz,2H),7.56(t,J=7.6 Hz,2H),7.47(t,J=7.4 Hz,1H),7.38(d,J=7.5 Hz,2H),7.18(d,J=8.9 Hz,2H),7.03(s,1H),4.46(d,J=2.4 Hz,4H),4.27(t,J=6.6 Hz,2H),3.85～3.62(m,4H),3.34(d,J=12.3 Hz,3H),2.83～2.71(m,3H),2.57(t,J=7.0 Hz,2H),2.49(s,4H),2.12(p,J=6.8 Hz,2H);13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ:166.10,163.96,161.51,155.18,153.04,148.54,148.16,139.12,136.41,133.15,132.50,130.90,129.79,129.01,128.80,126.52,122.31,120.84,103.43,100.02,68.17,64.51,64.20,56.46,50.70,33.53,11.97,10.95; HR-MS(ESI)m/z:calcd for C35H37N6O7{[M+H]+}653.2724,found 653.2718。

N-(4-((5-甲氧基乙氧基-2,3-二氫-[1,4]二噁烷[2,3-f]喹唑啉-10-基)氧基)苯基)-1,5-二甲基-3-氧代-2-苯基-2,3-二氫-1H-吡唑-4-甲酰胺(5e):產(chǎn)率71%;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:10.79(s,1H),8.54(s,1H),7.79(d,J=8.9 Hz,2H),7.57(t,J=7.6 Hz,2H),7.48(t,J=7.4 Hz,1H),7.41～7.35(m,2H),7.19(d,J=8.9 Hz,2H),7.04(s,1H),4.47(s,4H),4.40～4.28(m,2H),3.97～3.85(m,2H),3.50(s,3H),3.37(s,3H),2.82(s,3H);13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ:166.03,164.00,161.46,155.28,154.39,153.10,148.59,148.14,139.15,136.44,133.20,132.73,129.79,128.95,126.43,122.36,120.79,101.00,100.01,70.41,68.35,64.47,64.09,59.33,33.59,25.39,12.01; HR-MS(ESI)m/z:calcd for C31H30N5O7{[M+H]+} 584.2145,found 584.2140。

2-(4-氯苯基)-N-(4-((5-甲氧基-2,3-二氫-[1,4]二噁烷[2,3-f]喹唑啉-10-基)氧基)苯基)-1,5-二甲基-3-氧代-2-苯基-2,3-二氫-1H-吡唑-4-甲酰胺(5f):產(chǎn)率72%;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:10.69(s,1H),8.57(s,1H),7.79(d,J=8.4 Hz,2H),7.55(d,J=7.9 Hz,2H),7.34(d,J=8.0 Hz,2H),7.19(d,J=8.4 Hz,2H),7.15(s,1H),4.49(s,4H),4.08(s,3H),3.37(s,3H),2.86(d,J=33.6 Hz,3H);13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ:166.03,164.00,161.46,155.28,154.39,153.10,148.59,148.14,139.15,136.44,133.20,132.73,129.79,128.95,126.43,122.36,120.79,101.00,100.01,70.41,68.35,64.47,64.09,59.33,33.59,25.39,12.01; HR-MS(ESI)m/z:calcd for C29H25ClN5O6{[M+H]+} 574.1493,found 574.1488。

2-(4-氯苯基)-N-(4-((5-異丙氧基-2,3-二氫-[1,4]二噁烷[2,3-f]喹唑啉-10-基)氧基)苯基)-1,5-二甲基-3-氧代-2-苯基-2,3-二氫-1H-吡唑-4-甲酰胺(5g):產(chǎn)率76%;1H NMR(400 MHz)δ:10.68(s,1H),8.54(s,1H),7.78(d,J=8.9 Hz,2H),7.58～7.50(m,2H),7.33(d,J=8.7 Hz,2H),7.18(d,J=8.9 Hz,2H),7.10(s,1H),4.84(dt,J=12.1 Hz,6.0 Hz,1H),4.47(s,4H),3.34(d,J=12.0 Hz,3H),2.80(d,J=9.6 Hz,3H),1.51(d,J=6.0 Hz,6H);13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ:166.03,164.00,161.46,155.28,154.39,153.10,148.59,148.14,139.15,136.44,133.20,132.73,129.79,128.95,126.43,122.36,120.79,101.00,100.01,70.41,68.35,64.47,64.09,59.33,33.59,25.39,12.01; HR-MS(ESI)m/z:calcd for C31H29ClN5O6{[M+H]+} 602.1806,found,602.1801。

2-(4-氯苯基)-N-(4-((5-甲氧基丙氧基-2,3-二氫-[1,4]二噁烷[2,3-f]喹唑啉-10-基)氧基)苯基)-1,5-二甲基-3-氧代-2-苯基-2,3-二氫-1H-吡唑-4-甲酰胺(5h):產(chǎn)率72%;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:10.68(s,1H),8.54(s,1H),7.78(d,J=8.9 Hz,2H),7.58～7.50(m,2H),7.33(d,J=8.6 Hz,2H),7.19(d,J=8.9 Hz,2H),7.09(s,1H),4.48(s,4H),4.32(td,J=6.5 Hz,3.0 Hz,3H),3.62(t,J=6.1 Hz,2H),3.37(d,J=12.9 Hz,6H),2.81(s,3H),2.29～2.13(m,3H);13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ:166.03,164.00,161.46,155.28,154.39,153.10,148.59,148.14,139.15,136.44,133.20,132.73,129.79,128.95,126.43,122.36,120.79,101.00,100.01,70.41,68.35,64.47,64.09,59.33,33.59,25.39,12.01; HR-MS(ESI)m/z:calcd for C32H31ClN5O7{[M+H]+} 632.1912,found 632.1907。

2-(4-氯苯基)-N-(4-((5-甲氧基乙氧基-2,3-二氫-[1,4]二噁烷[2,3-f]喹唑啉-10-基)氧基)苯基)-1,5-二甲基-3-氧代-2-苯基-2,3-二氫-1H-吡唑-4-甲酰胺(5i):產(chǎn)率63%;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:10.78(s,1H),8.53(s,1H),7.78(dd,J=9.5 Hz,2.5 Hz,2H),7.55(dd,J=6.7 Hz,4.8 Hz,2H),7.48(t,J=7.4 Hz,1H),7.43～7.34(m,2H),7.21～7.15(m,2H),7.08(s,1H),4.47(q,J=4.6 Hz,4H),4.12(t,J=7.1 Hz,2H),3.62(t,J=6.1 Hz,2H),3.38(d,J=7.2 Hz,6H),2.81(s,3H),2.21(m,J=6.3 Hz,2H);13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ:167.72,164.15,161.18,156.55,148.20,139.24,136.35,134.72,132.91,132.33,131.86,130.92,128.85,127.31,122.34,120.85,100.69,70.39,65.57,64.49,64.09,59.30,30.58,19.19,13.74,12.08; HR-MS(ESI)m/z:calcd for C31H29ClN5O7{[M+H]+} 618.1756,found 618.1750。

2-(4-氟苯基)-N-(4-((5-異丙氧基-2,3-二氫-[1,4]二噁烷[2,3-f]喹唑啉-10-基)氧基)苯基)-1,5-二甲基-3-氧代-2-苯基-2,3-二氫-1H-吡唑-4-甲酰胺(5j):產(chǎn)率81%;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:10.72(s,1H),8.52(s,2H),7.41～7.33(m,2H),7.30～7.25(m,2H),7.18(d,J=8.9 Hz,2H),7.04(s,1H),4.92～4.73(m,1H),4.47(s,4H),4.32(t,J=6.7 Hz,2H),3.31(s,3H),2.80(s,3H),1.51(d,J=6.1 Hz,7H);13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ:166.03,164.00,161.46,155.28,154.39,153.10,148.59,148.14,139.15,136.44,133.20,132.73,129.79,128.95,126.43,122.36,120.79,101.00,100.01,70.41,68.35,64.47,64.09,59.33,33.59,25.39,12.01; HR-MS(ESI)m/z:calcd for C31H29FN5O6{[M+H]+} 586.2102,found 586.2096。

2-(4-氟苯基)-N-(4-((5-甲氧基丙氧基-2,3-二氫-[1,4]二噁烷[2,3-f]喹唑啉-10-基)氧基)苯基)-1,5-二甲基-3-氧代-2-苯基-2,3-二氫-1H-吡唑-4-甲酰胺(5k):產(chǎn)率74%;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:10.72(s,1H),8.52(s,1H),7.80～7.75(m,2H),7.39～7.34(m,2H),7.30～7.22(m,2H),7.21～7.15(m,2H),7.06(s,1H),4.46(q,J=4.6 Hz,4H),4.31(td,J=6.6 Hz,4.4 Hz,3H),3.61(t,J=6.1 Hz,2H),3.36(d,J=18.5 Hz,6H),2.79(s,3H),2.31～2.14(m,2H);13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ:166.03,164.00,161.46,155.28,154.39,153.10,148.59,148.14,139.15,136.44,133.20,132.73,129.79,128.95,126.43,122.36,120.79,101.00,100.01,70.41,68.35,64.47,64.09,59.33,33.59,25.39,12.01; HR-MS(ESI)m/z:calcd for C32H31FN5O7{[M+H]+} 616.2208,found 616.2202。

2-(4-氟氯苯基)-N-(4-((5-甲氧基乙氧基-2,3-二氫-[1,4]二噁烷[2,3-f]喹唑啉-10-基)氧基)苯基)-1,5-二甲基-3-氧代-2-苯基-2,3-二氫-1H-吡唑-4-甲酰胺(5l):產(chǎn)率69%;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:10.72(s,1H),8.54(s,1H),7.77(t,J=7.9 Hz,2H),7.43～7.33(m,2H),7.27(d,J=8.9 Hz,2H),7.19(d,J=8.9 Hz,2H),7.04(d,J=15.0 Hz,1H),4.47(s,4H),4.31(d,J=6.7 Hz,2H),3.97～3.83(m,2H),3.50(s,3H),3.35(s,3H),2.81(s,3H);13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ:166.03,164.00,161.46,155.28,154.39,153.10,148.59,148.14,139.15,136.44,133.20,132.73,129.79,128.95,126.43,122.36,120.79,101.00,100.01,70.41,68.35,64.47,64.09,59.33,33.59,25.39,12.01; HR-MS(ESI)m/z:calcd for C31H29FN5O7{[M+H]+} 602.2051,found 602.2046。

2-(4-甲基苯基)-N-(4-((5-異丙氧基-2,3-二氫-[1,4]二噁烷[2,3-f]喹唑啉-10-基)氧基)苯基)-1,5-二甲基-3-氧代-2-苯基-2,3-二氫-1H-吡唑-4-甲酰胺(5m):產(chǎn)率69%,1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:10.82(s,1H),8.52(s,1H),7.81～7.74(m,2H),7.35(d,J=8.1 Hz,2H),7.25(d,J=8.3 Hz,2H),7.20～7.15(m,2H),7.04(s,1H),4.82(m,J=6.0 Hz,1H),4.46(s,4H),3.34(s,3H),2.79(s,3H),2.43(s,3H),1.50(d,J=6.1 Hz,6H);13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ:166.03,164.00,161.46,155.28,154.39,153.10,148.59,148.14,139.15,136.44,133.20,132.73,129.79,128.95,126.43,122.36,120.79,101.00,100.01,70.41,68.35,64.47,64.09,59.33,33.59,25.39,12.01; HR-MS(ESI)m/z:calcd for C32H32N5O6{[M+H]+} 582.2353,found 582.2347。

2-(4-甲基苯基)-N-(4-((5-甲氧基丙氧基-2,3-二氫-[1,4]二噁烷[2,3-f]喹唑啉-10-基)氧基)苯基)-1,5-二甲基-3-氧代-2-苯基-2,3-二氫-1H-吡唑-4-甲酰胺(5n):產(chǎn)率78%;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:10.82(s,1H),8.52(s,1H),7.78(d,J=8.4 Hz,2H),7.35(d,J=7.6 Hz,2H),7.25(d,J=7.7 Hz,2H),7.17(d,J=8.4 Hz,2H),7.05(s,1H),4.46(s,4H),4.30(t,J=5.6 Hz,2H),3.61(t,J=5.5 Hz,2H),3.36(d,J=17.7 Hz,6H),2.78(s,3H),2.43(s,3H),2.31～2.12(m,2H);13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ:166.03,164.00,161.46,155.28,154.39,153.10,148.59,148.14,139.15,136.44,133.20,132.73,129.79,128.95,126.43,122.36,120.79,101.00,100.01,70.41,68.35,64.47,64.09,59.33,33.59,25.39,12.01; HR-MS(ESI)m/z:calcd for C33H34N5O7{[M+H]+} 612.2458,found 612.2453。

2-(4-甲基苯基)-N-(4-((5-甲氧基乙氧基-2,3-二氫-[1,4]二噁烷[2,3-f]喹唑啉-10-基)氧基)苯基)-1,5-二甲基-3-氧代-2-苯基-2,3-二氫-1H-吡唑-4-甲酰胺(5o):產(chǎn)率79%;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:10.83(s,1H),8.55(s,1H),7.79(d,J=8.9 Hz,2H),7.36(d,J=8.1 Hz,2H),7.28(d,J=6.6 Hz,2H),7.18(d,J=8.9 Hz,2H),7.08(s,1H),4.47(s,4H),4.37～4.25(m,4H),4.00～3.85(m,J=11.9 Hz,3H),3.34(d,J=13.5 Hz,3H),2.80(s,3H),2.44(s,3H);13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ:166.03,164.00,161.46,155.28,154.39,153.10,148.59,148.14,139.15,136.44,133.20,132.73,129.79,128.95,126.43,122.36,120.79,101.00,100.01,70.41,68.35,64.47,64.09,59.33,33.59,25.39,12.01; HR-MS(ESI)m/z:calcd for C32H32N5O7{[M+H]+} 598.2302,found 598.2296。

1.5 EGFR和VEGFR-2抑制活性評價

采用ADP-Glo激酶活性檢測方法測定15個目標化合物對EGFR或VEGFR-2的抑制活性,方法如下:(1)化合物稀釋:從最高濃度5000 nM開始進行5倍梯度稀釋,配制成5000 nM、1000 nM、200 nM、40 nM和8 nM共5個濃度; (2)底物配制:取10 μL DMSO和190 μL(1×Buffer)配置成5%的DMSO溶液; (3)加抑制劑:取一塊白底96孔板,除對照組外,在每孔中加入5 μL不同濃度的抑制劑(用5% DMSO稀釋制得),用5 μL 5% DMSO設置對照組,陽性對照(激酶,底物+ATP、5% DMSO)、陰性對照(底物+ATP、5% DMSO、1×反應Buffer); (4)加激酶溶液(除陰性對照組外):在上述每孔中加入10 μL激酶溶液(1×反應Buffer稀釋制得),陰性對照組中用10 μL×反應Buffer設置激酶對照組 ;(5)加底物及ATP混合液:在上述每孔中加入10 μL混合溶液(含5 μL底物酪蛋白及5 μL的ATP),室溫下孵育60 min; (6)加入ADP-Glo TM試劑:在上述每孔中分別加入25 μL ADP-Glo TM試劑室溫下孵育40 min,終止反應進程; (7)激酶試劑檢測:向上述每個孔中分別加入50 μL激酶檢測試劑室溫下避光孵育30 min; (8)將96孔板放入Envision儀,調取相應的程序檢測信號; (9)原始數(shù)據(jù)的分析和處理:將藥物濃度和相應抑制率輸入GraphPad Prism 5計算處理,化合物的抑制率計算方法如下:抑制率(%)=[1-(實驗孔讀值-陰性對照孔讀值)/(陽性對照孔讀值-陰性對照孔讀值)]×100%。用GraphPad Prism5軟件處理得出相應的IC50值(均設置2個重復組)。

1.6 A549和Hela細胞抗增殖評價

分別選用人肺癌細胞(A549)和人宮頸癌細胞(Hela)采用CCK-8法測試部分化合物的體外抗腫瘤活性,方法如下:(1)從液氮中取出Hela/A549細胞,37 ℃溫水中復蘇細胞,將細胞放入含有10% FBS、80 U/mL青霉素及0.08 mg/mL鏈霉素的培養(yǎng)基中,在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中撫育48h; (2)將培養(yǎng)基中的培養(yǎng)液吸出,用10% PBS緩沖溶液洗滌細胞2次,在細胞培養(yǎng)瓶中加入300 μL胰酶,稍后加入1 mL PBS緩沖溶液中和胰酶,將培養(yǎng)瓶放入37 ℃培養(yǎng)箱中消化1min,將消化后的細胞吹打均勻后移入15 mL離心管中,以800 rpm 轉速離心5h; (3)移出上清液,加入含有10% PBS的DMEM培養(yǎng)液吹打均勻,取10 μL細胞懸浮液和10μL 0.4%胎盼藍混勻,在細胞計數(shù)儀下進行計數(shù); (4)在96孔板中,給每孔加入100 μL的細胞懸液(約10000個細胞),每組設5個復孔重復實驗,將處理好的96孔板放入37 ℃培養(yǎng)箱中培育48 h,使細胞貼壁; (5)化合物稀釋:用DMSO配置化合物濃度,從最高濃度5000 nM開始進行5倍濃度稀釋,設5000 nM、1000 nM、200 nM、40 nM和8 nM濃度梯度; (6)按照每孔接種3000細胞/80 μL的細胞懸液到96孔板中,設置陽性和空白對照孔; (7)用培養(yǎng)液稀釋對應的化合物濃度,然后在每個對應孔中分別加入20 μL培養(yǎng)液,DMSO終濃度為0.25%; (8)培育72 h后,在每個孔中加入10 μL CCK-8試劑,培養(yǎng)2 h; (9)使用多功能讀板機在450 nm處讀出其吸光值; (10)數(shù)值計算:細胞存活率(%)=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%,As:實驗孔(含有細胞的培養(yǎng)基、CCK-8、化合物)的OD值,Ac:對照孔(含有細胞的培養(yǎng)基、CCK-8)的OD值,Ab:空白孔(不含細胞和化合物的培養(yǎng)基、CCK-8)的OD值; (11)然后將數(shù)值導入Graphpad Prism5軟件進行曲線擬合,計算IC50值。

1.7 HUEVC細胞抗增殖活性評價

選用人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)采用CCK-8法測試部分化合物的體外抗增殖活性,方法如下:(1)首先配置Fibronectin溶液和ECM培養(yǎng)基。Fibronectin的配置:先將Fibronectin置于室溫30 min后加入5 mL無菌水靜置30 min,使其完全溶解,終濃度為1 mg/mL,以200 μL/管的體積分裝,放置于-20 ℃保存。ECM完全培養(yǎng)基:500 mL ECM培養(yǎng)基中加入25 mL FBS、5 mL ECGS和5 mL P/S Solution,注意配制過程中避光; (2)在Fibronectin包被的T75培養(yǎng)瓶中用上述ECM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)狀態(tài)良好的低代次HUVEC細胞; (3)實驗當天包被96孔板(包被時Fibronectin的濃度為2 μg/cm3,每孔40 μL溶液),于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至少2 h; (4)從液氮中取出HUVEC細胞,37 ℃溫水中復蘇細胞,將細胞放入含ECM培養(yǎng)基中,在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育48 h; (5)將培養(yǎng)基中的培養(yǎng)液吸出,用10% PBS緩沖溶液洗滌細胞2次,加入300 μL胰酶在細胞培養(yǎng)瓶中,稍后加入1 mL PBS緩沖溶液中和胰酶,將培養(yǎng)瓶放入37 ℃培養(yǎng)箱中消化1min,消化后的細胞吹打均勻后移入15 mL離心管中,以800 rpm轉速離心5 h; (6)移出上清液加入含有10% PBS的DMEM培養(yǎng)液吹打均勻,取10 μL細胞懸浮液和10 μL 0.4%胎盼藍混勻,在細胞計數(shù)儀下進行計數(shù);7)在96孔板中給每孔加入100 μL的細胞懸液(約10000個細胞),每組設5個復孔進行重復實驗,將加好的96孔板放入37 ℃培養(yǎng)箱中培育48 h使細胞貼壁; (8)化合物稀釋:用DMSO配置化合物濃度,從最高濃度5000 nM開始進行5倍濃度稀釋,設5000 nM、1000 nM、200 nM、40 nM和8 nM共5個濃度梯度; (9)按照每孔接種3000細胞/80 μL的細胞懸液到96孔板中,設置陽性和空白對照孔; (10)用培養(yǎng)液稀釋對應的化合物濃度,然后在每個對應孔中分別加入20 μL培養(yǎng)液,DMSO終濃度為0.25%; (11)培育72 h后,在每個孔中加入10 μL CCK-8試劑培養(yǎng)2h; (12)使用多功能讀板機在450 nm處讀出其吸光值; (13)數(shù)值計算:細胞存活率(%)=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100% As:實驗孔(含有細胞的培養(yǎng)基、CCK-8、化合物)的OD值Ac:對照孔(含有細胞的培養(yǎng)基、CCK-8)的OD值Ab:空白孔(不含細胞和化合物的培養(yǎng)基、CCK-8)的OD值; (14)然后將數(shù)值導入Graphpad Prism5軟件進行曲線擬合,計算IC50值。

1.8 分子對接方法

受體的晶體結構從PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)中下載,其中VEGFR晶體結構的PDB id為3WZD[20],EGFR晶體結構的PDB id為1M17[21]。分子對接前,首先對受體結構進行預處理,包括合并非極性氫,刪除共晶水,合并電荷去除孤對電子,去除非標準氨基酸鏈等。隨后,小分子結構使用Discovery Studio 4.0軟件進行結構優(yōu)化。使用晶體結構中的共晶配體定義結合口袋位置。在默認參數(shù)下,使用AutoDock Vina[22]軟件將化合物5l對接到受體活性位點,選取對接打分最優(yōu)的構象進行后續(xù)分析。使用PyMOL軟件進行蛋白-配體結合模式分析。

2 結果與討論

2.1 目標化合物的生物活性

測定了所有化合物針對EGFR和VEGFR-2激酶的抑制活性和部分化合物對宮頸癌細胞(Hela)、人肺癌細胞(A549)和人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)的抗增殖活性,結果見表1。結果發(fā)現(xiàn)當R1為甲氧基乙基時,化合物對EGFR的抑制活性IC50=10～37 nM,與對照藥物阿法替尼(Afatinib)相當,對VEGFR-2的抑制活性IC50=15～30 nM,與對照藥物索拉菲尼(Sorafenib)相當?；衔?e、5i、5l和5o對EGFR/VEGFR-2同時具有良好的抑制活性。R1為甲氧基丙基時,化合物對EGFR的抑制活性IC50=57～436 nM,對VEGFR-2的抑制活性IC50=88～241 nM,化合物5c、5h、5k和5n的抑制活性明顯低于R1為甲氧基丙基化合物的5e、5i、5l和5o。這說明R1烷烴鏈的長度對化合物的活性有較大的影響,長度增加則化合物的活性降低,原因可能是結合口袋空間較小,化合物不能很好地進入酶的活性口袋。為了驗證這一思路,將R1鏈進一步增長體積增大合成了化合物5d,其對EGFR和VEGFR-2的抑制活性IC50分別為899 nM和712 nM,嗎啉取代的丙基很難結合到激酶的活性口袋,導致化合物5d抑制活性進一步降低。接著研究了取代基R1對化合物活性的影響,結果發(fā)現(xiàn):當R1為鹵素時,其對EGFR和VEGFR-2激酶的抑制活性普遍高于氫和甲基,尤其是R1為氟原子時活性最強,化合物5l對EGFR和VEGFR-2激酶的抑制活性IC50分別為10 nM和15 nM。表中的IC50>500 nM判定為無抑制活性。綜上所述:(1)當取代基R1基團為甲氧基乙基時,化合物的抑制活性較好,而取代基碳鏈太長或太短其抑制活性降低;(2)當取代基R2為吸電子基團時,化合物對EGFR和VEGFR-2具有良好的抑制活性,而為給電子基團時,化合物活性明顯減弱;(3)相比較而言,取代基R1對活性的影響大于取代基R2。

表1 目標化合物5a～5o的生物活性

利用宮頸癌細胞(Hela)、人肺癌細胞(A549)和人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)分別選取部分化合物進行了細胞增殖活性測定,結果表明:在激酶活性檢測中表現(xiàn)出良好抑制活性的化合物在細胞增殖活性測定中對A549細胞和HUVECs細胞也表現(xiàn)出良好的抑制活性?；衔?e、5i、5l和5o對A549細胞的抑制活性IC50=10～16 nM,與對照藥物Afatinib相當,對HUVEC細胞的抑制活性IC50=11～18 nM,與對照藥物Sorafenib相當。所測化合物對Hela細胞的抗增殖能力較弱,進一步說明目標化合物的抗增殖活性與被測試細胞中靶標激酶EGFR和VEGFR-2相關。

2.2 化合物5l與EGFR和VEGFR-2的結合模式分析

化合物5l對EGFR和VEGFR-2表現(xiàn)出良好的抑制活性,為了探索其與激酶的相互作用模式,分別采用分子對接方法,分子對接結果如圖6所示,化合物5l的喹唑啉氮原子作為氫鍵受體與VEGFR2鉸鏈區(qū)關鍵氨基酸殘基Cys919形成了氫鍵,酰胺基NH與羰基氧原子作為氫鍵供體與氫鍵受體分別與Glu885和Asp1046形成了氫鍵網(wǎng)絡,五元氮雜環(huán)與末端苯環(huán)深入到后口袋部分,同時與Phe1047形成了π-π堆積相互作用(圖6a)。化合物5l的喹唑啉氮原子與EGFR鉸鏈區(qū)Met769形成了關鍵氫鍵相互作用,位于溶劑可及區(qū)的含氧脂肪鏈與Lys704同樣形成了氫鍵相互作用。在5l的氫鍵供體-受體富集區(qū),2個羰基氧原子分別與Lys721和Asp831形成了氫鍵相互作用。值得一提的是,末端吸電子取代的苯環(huán)與去質子化的Asp831還存在陰離子-π相互作用(圖6b)。

圖6 化合物5l與VEGFR-2(a)和EGFR(b)的非共價相互作用,包括氫鍵、π-π堆積和陰離子-π相互作用

3 結論

本文設計并合成了15個以EGFR和VEGFR-2為雙靶標的新型二噁烷并喹唑啉化合物,這些化合物均未見文獻報道,通過1H NMR、13C NMR、HR-MS等進行了結構表征,并測定了它們對EGFR和VEGFR-2兩種激酶的抑制活性,探討了其人肺癌細胞(A549)和人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)的抗增殖活性,并對其結構與活性關系進行了初步研究?；衔?l對EGFR的抑制活性IC50=10 nM,對VEGFR的抑制活性IC50=15 nM;當取代基R1為甲氧基乙基時,所合成的化合物對EGFR和VEGFR-2激酶均表現(xiàn)出良好的抑制活性?；衔?l對A549細胞和HUVEC細胞也表現(xiàn)出良好的抗增殖活性,其抑制活性IC50分別為10 nM和11 nM。同樣,當取代基R1為甲氧基乙基時,所合成的化合物對A549細胞和HUVEC均表現(xiàn)出良好的抑制活性?；钚詼y定結果表明:該化合物的作用靶標為EGFR和VEGFR-2激酶。選用抑制活性最強的化合物5l采用分子對接方法初步研究其與EGFR和VEGFR-2相互作用方式,結果顯示:化合物5l能較好地插入到EGFR激酶和VEGFR-2激酶口袋中,其主要作用方式為氫鍵、π-π堆積和陰離子-π相互作用。該工作為雙靶點抗腫瘤藥物的研究與開發(fā)奠定了良好的基礎。

作者許佳敏和魏洪磊對本工作具有同等貢獻。