太子參-牡丹皮藥對治療糖尿病心肌病網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機制探討

張文婷，徐瑾，王時光

1 安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 安徽合肥 230012

2 安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 安徽合肥 230031

1974 年，Hamby等人首先對糖尿病心肌病給了明確的定義，認為在糖尿病患者中出現(xiàn)的一種特異性心肌病，表現(xiàn)為心肌結(jié)構(gòu)和功能重構(gòu)，其發(fā)病過程不取決于冠狀動脈疾病、高血壓病、瓣膜病或其他心肌病變，而是以心肌肥大、纖維化和低心肌收縮力的小血管病變等病理變化為主，最后進展為慢性心力衰竭[1]。糖尿病心肌病發(fā)生機理復(fù)雜，目前尚缺乏特異性的診斷手段。傳統(tǒng)的藥物療法包括了血糖調(diào)節(jié)和改善心功能。在中醫(yī)上，糖尿病心肌病被稱作“消渴病心病”，其主要原因是消渴病沒有得到及時的治療，導(dǎo)致其進一步發(fā)展和演變。消渴病的根本病機在于肺腎陰虛燥熱，如果沒有得到及時的治療，則會不斷耗氣傷陰，進而會影響到心臟，導(dǎo)致心脈瘀阻，從而導(dǎo)致心衰。益氣養(yǎng)陰、活血化瘀是中醫(yī)藥治療糖尿病及其并發(fā)癥的主要治則，因此治療消渴的首選治療思路以益氣養(yǎng)陰活血通絡(luò)思想指導(dǎo)進行組方，可控制糖尿病及其并發(fā)癥的進一步發(fā)展?；诖死碚撘罁?jù)，丹蛭降糖膠囊選擇太子參、生地黃、牡丹皮、菟絲子、澤瀉、水蛭組成新安驗方。

太子參-牡丹皮藥對出自丹蛭降糖膠囊，既往試驗驗證其對于糖尿病心肌損傷有顯著的療效[2]。太子參始是《本草從新》中記載的一種具有益氣健脾，生津潤肺功效的中藥。太子參具有降糖調(diào)脂、心肌保護、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗應(yīng)激、 抗疲勞、抗腫瘤等現(xiàn)代藥理作用[3]。牡丹皮是《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載的一種具有清熱涼血，活血化瘀，散瘀消癰功效的中藥，牡丹皮具有消炎解熱、抗血小板聚集、抗血栓形成、抗腫瘤等現(xiàn)代藥理學(xué)作用[4]。本研究基于藥物和疾病的藥理學(xué)網(wǎng)絡(luò)，試從分子水平上探討太子參-牡丹皮藥對治療糖尿病心肌病的作用機制，為中醫(yī)藥防治糖尿病心肌損傷提供理論依據(jù)。

材料與方法

1 太子參-牡丹皮藥對活性成分的獲取及靶點預(yù)測

獲取太子參-牡丹皮藥對的活性成分及靶點預(yù)測，首先通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫選條件設(shè)定為口服藥物生物利用度（OB）≥15%，類藥性（DL）≥0.15，篩選出太子參和牡丹皮的活性成分。將篩選出的各個活性成分在Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）網(wǎng)站中找出對應(yīng)Canonical SMILES結(jié)構(gòu)。并將各個結(jié)構(gòu)輸入Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch）數(shù)據(jù)庫中，設(shè)置species為“Homo sapiens”，設(shè)定 probability＞0篩選出符合條件的各活效成分的作用靶點。得到各個活性成分作用的全部靶點。

2 糖尿病心肌病相關(guān)靶點的獲取

通過搜索“Diabetic Cardiomyopathies”這一關(guān)鍵字，在Disgenet數(shù)據(jù)庫（https：//disgenet.org）和GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//genecards.org）中搜索出對應(yīng)的靶點基因，同時在GeneCards數(shù)據(jù)庫中得到糖尿病心肌病的候選靶點，選取評分（表示 DCM與靶點基因之間的關(guān)聯(lián)程度）大于等于5的靶點為 DCM的候選靶點。取兩數(shù)據(jù)庫中靶點進行整合，刪除重復(fù)靶點，構(gòu)建糖尿病心肌病靶點數(shù)據(jù)庫。

3 構(gòu)建藥物-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

利用Cytoscape 3.9.0軟件構(gòu)建藥物-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，并對網(wǎng)絡(luò)圖進行分析。其中在該網(wǎng)絡(luò)圖中節(jié)點代表太子參、牡丹皮、活性成分、靶點等；邊代表上述節(jié)點之間的相互關(guān)系。

4 構(gòu)建蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖

運用Venny圖獲取疾病與中藥的交集靶點。在此基礎(chǔ)上，利用STRING 11.5平臺（https：// cn.stringdb.org）對二者的交集靶點進行拓撲分析，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。并通過Cytoscape 3.9.0軟件對于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖進一步優(yōu)化，利用內(nèi)部插件Cytohubba篩選出核心靶點，并構(gòu)建核心靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

5 富集分析與通路分析

在Metascape數(shù)據(jù)庫（https：//cn.metascape.org）中選定物種為人，設(shè)置Min Overlap＝3，P Value Cutoff＝0.01，Min Enrichment＝1.5為篩選條件，將疾病與中藥的交集靶點基因輸入數(shù)據(jù)庫中，對上述靶點基因選擇生物過程（biological process）、細胞組成（cellular component）、分子功能（molecular function）、京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）上述四個部分進行基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析和通路分析。GO分析結(jié)果以柱狀圖進行展示，KEGG結(jié)果以氣泡圖的形式進行展示。

結(jié) 果

1 太子參-牡丹皮藥對活性成分的獲取及靶點預(yù)測

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫的篩選，篩選出8個太子參活性成分，11個牡丹皮活性成分，共得到19個活性成分，見表1。通過Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫篩選出太子參8個活性成分共435個靶點，牡丹皮11個活性成分中有7個活性成分在Swiss Target Prediction中預(yù)測到靶點，包括槲皮素（quercetin）、5-[亞甲基]巴比妥酸（5-[[5-（4-methoxyphenyl）-2-furyl]methylene]barbituric acid）、苯甲酰芍藥苷（benzoyl paeoniflorin）、堪非醇（kaempferol）、谷甾醇（sitosterol）、丁子香萜（Mairin）、芍藥苷（paeoniflorin_qt），共381個靶點。兩中藥共預(yù)測到了815個靶點，通過去除重復(fù)項后得到277個靶點。

表1 太子參-牡丹皮藥對活性成分

2 糖尿病心肌病關(guān)鍵靶點的篩選

在Disgenet數(shù)據(jù)庫中查到與糖尿病心肌病相關(guān)的靶點共220個，在GeneCards數(shù)據(jù)庫中查到與糖尿病心肌病相關(guān)的靶點共5977個，選擇打分值≥5 的2334個靶點作為糖尿病心肌病候選靶點，將兩數(shù)據(jù)庫中的靶點進行合并，通過去除相同靶點后共得到2424個靶點。將靶點與太子參-牡丹皮藥對活性成分的277個靶點繪制成韋恩圖，見圖1，將該共有的靶點與太子參-牡丹皮藥對活性成分的靶點進行匹配映射，得到共同靶點109個。也就是太子參-牡丹皮藥對主要以作用上述關(guān)鍵靶點為主，起到預(yù)防和治療糖尿病心肌損傷作用。

圖1 藥物與疾病的韋恩圖

3 構(gòu)建藥物-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

將中藥、活性成分以及靶點導(dǎo)入Cytoscape軟件，進行藥理學(xué)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建，見圖2。其中根據(jù)各節(jié)點的度值，設(shè)置各節(jié)點的面積大小，度值越大，各節(jié)點的面積越大，表明活性成分與靶點作用越大，說明二者之間聯(lián)系越大，在發(fā)揮防治糖尿病心肌損傷的作用貢獻越大。該網(wǎng)絡(luò)中山奈酚（kaempferol）、槲皮素（quercetin）、刺槐素（acacetin）、木犀草素（luteolin）的度值排名靠前，說明這些有效成分在治療糖尿病心肌病的潛在靶點更多。

圖2 藥物-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

4 構(gòu)建蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖

將疾病與中藥的交集靶點導(dǎo)入STRING 11.5平臺進行拓撲分析，篩選出關(guān)鍵靶點，通過Cytoscape對網(wǎng)絡(luò)圖進行優(yōu)化分析，見圖3。并利用其內(nèi)部插件Cytohubba，根據(jù)度值篩選出前20個核心靶點，分別為腫瘤壞死因子（TNF）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶（SRC）、腫瘤抑制蛋白（TP53）、表皮生長因子受體（EGFR）、絲裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、過氧化物酶體增生激活受體γ（PPARG）、天冬氨酸蛋白水解酶3（CASP3）、雌激素受體1（ESR1）、熱休克蛋白90α家族A類成員 1（HSP90AA1）、過氧化物合酶2（PTGS2）、細胞周期蛋白D1（CCND1）、沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）、 過氧化物酶體增殖物激活受體-α（PPARA）、絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）、堿性成纖維細胞生長因子（FGF2）、激酶插入?yún)^(qū)受體（KDR）、糖原合成酶激酶3B（GSK3B），對前20個核心靶點再次進行網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建，見圖4。

圖3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 前20核心靶點

5 GO分析與KEGG分析

通過Metascape數(shù)據(jù)庫將藥對與疾病的共同靶點進行富集和通路分析，根據(jù)條件篩選出的結(jié)果中選擇前10個生物過程包括磷酸化的正向調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)磷酸化的正向調(diào)節(jié)、激酶活性的調(diào)節(jié)、激酶活性的正向調(diào)節(jié)等。前10個細胞組成包括膜筏、膜微結(jié)構(gòu)域、胞膜、質(zhì)膜筏等。前10個分子功能包括核受體活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性、類固醇結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等。選擇前20個信號通路，這些通路包括癌癥通路（Pathways in cancer、Proteoglycans in cancer、Rap1 signaling pathway）、MAPK信號通路（MAPK signaling pathway）、PI3K-Akt信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）等。將GO分析結(jié)果以柱狀圖形式展示，見圖5。通過KEGG分析選擇前20個富集結(jié)果較強的信號通路，其中縱坐標表示通路名稱，橫坐標代表基因比率。通路中富集的基因數(shù)目以圓圈的大小表示，基因數(shù)目越多圓圈越大。圓圈顏色的深淺代表Pvalue，其中顏色越深代表可信度越高，見圖6。

圖5 GO分析柱狀圖

圖6 KEGG氣泡圖

討 論

糖尿病心肌病在中醫(yī)上被稱為“消渴病心病”“心悸”“怔忡”等。主要由于糖尿病久治不愈，逐漸影響及心，病機演變主要為陰虛燥熱逐漸耗氣傷陰，導(dǎo)致痰瘀互結(jié)最終進展為陰陽兩虛。主要有4個重要致病因素包括虛、痰、瘀、水[5]。運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法發(fā)現(xiàn)太子參和牡丹皮通過多種活性成分、多個靶點和多條通路來發(fā)揮防治糖尿病心肌病的作用。

通過對藥物-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖的分析可知網(wǎng)絡(luò)中的重要節(jié)點為山奈酚（kaempferol）、槲皮素（quercetin）、刺槐素（acacetin）、木犀草素（luteolin）。山奈酚是一種天然黃酮類化合物，可上調(diào) SIRT1，抑制NF-κB 核轉(zhuǎn)位，并激活核因子E2相關(guān)因子（Nrf2），從而抑制糖尿病引起的心肌炎癥和氧化應(yīng)激[6]。并可通過抑制 ASK1/MAPK 及AGE-RAGE/MAPK 信號通路，發(fā)揮保護糖尿病心肌病作用[7]。槲皮素是一種天然類黃酮，存在于多種植物中。槲皮素可以通過Nrf2通路抑制高糖誘導(dǎo)的細胞焦亡小體激活和線粒體損傷，從而改善糖尿病心肌細胞損傷[8]。槲皮素可對糖尿病大鼠心肌細胞中caspase 9和3的激活減少，防止過度凋亡[9]。通過減少糖尿病心肌病小鼠模型中的炎癥反應(yīng)和甘油磷脂代謝失調(diào)來改善心臟損傷[10]。刺槐素是一種天然黃酮類化合物，在多種心血管疾病中是一種抗氧化劑和抗炎劑。在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病心肌病大鼠模型中，通過PPAR-α/AMPK信號通路，對抗高葡萄糖誘導(dǎo)的Bax和 IL-6增加和Bcl-2的減少。表明通過抑制氧化應(yīng)激、炎癥和細胞凋亡發(fā)揮心臟保護作用[11]。木犀草素是一種天然的黃酮類化合物，通過抑制NF-kB介導(dǎo)的炎癥和激活Nrf2介導(dǎo)的抗氧化反應(yīng)來預(yù)防糖尿病性心肌病，還可以預(yù)防STZ 誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的心臟纖維化、肥大和功能障礙[12]。此外通過上調(diào)磷酸化蛋白AMPK和AKT/GSK-3通路，同時降低蛋白酶體活性，從而預(yù)防小鼠糖尿病心肌病[13]。還可以抑制JNK調(diào)節(jié)的miR-22并阻斷自噬[14]。

通過蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖分析可得TNF、AKT1、SRC、TP53等靶點在作用過程中發(fā)揮主要作用。 TNF與糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展有緊密聯(lián)系，TNF- α在糖尿病患者中過度表達。過量的TNF- α可介導(dǎo)免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)細胞凋亡，抑制心肌收縮，參與心肌重構(gòu)。TNF-α轉(zhuǎn)基因小鼠的過度表達導(dǎo)致心臟增大、心臟功能障礙和心肌纖維化[15]。Akt在調(diào)節(jié)心血管功能（如心臟生長、心肌收縮功能和冠狀血管生成）方面具有明確的作用。PI3K-Akt-FoxO3a 通路可以預(yù)防STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠心功能惡化和結(jié)構(gòu)性心肌病，并減少糖尿病心肌細胞的凋亡。AKT-Foxo1磷酸化水平的降低與DCM胰島素抵抗和細胞凋亡的發(fā)生密切相關(guān)，在抑制細胞凋亡、改善DCM心功能方面具有重要作用[16]。 在糖尿病心肌病中Akt通路的激活為細胞提供了生存信號，通路激活后顯著降低心肌細胞凋亡和心肌損傷[17]。SRC它參與心臟肥大的多種信號通路，如G蛋白偶聯(lián)受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。一些研究人員報告稱，c-Src在糖尿病相關(guān)心血管疾病的病理生理學(xué)中發(fā)揮著重要作用[18]。TP53在糖尿病心肌病中誘導(dǎo)糖酵解和凋亡調(diào)節(jié)因子 （TIGAR），TIGAR在糖尿病心肌病小鼠中提高HG誘導(dǎo)的ROS和細胞凋亡水平[19]。

通過KEGG富集分析，太子參-牡丹皮藥對可直接干預(yù)癌癥、MAPK、PI3K-Akt等信號通路。絲裂原活化蛋白激酶 （MAPK） 信號通路有效地參與了DCM的發(fā)病機制。AMPK 的激活對糖尿病病癥中的缺血性損傷、心臟肥大和心臟細胞凋亡具有許多心臟保護作用。p38作為MAPK的成員，已知被激活并參與心臟肥大、心肌纖維化和細胞凋亡 。靶向p38MAPK是控制DCM心臟細胞凋亡的另一種治療策略[20]。Akt發(fā)揮保護細胞，可以通過抑制多個靶點的有關(guān)細胞凋亡信號通路。研究顯示，心肌細胞的生長、代謝和凋亡，與PI3K/Akt信號通路密切相關(guān)。并可以通過PIK3CA對心臟起到保護作用[21]。Sirt1位于PI3K-Akt的上游，激活Sirt1-Fox1、PI3K-Akt等信號通路可抑制心肌細胞OS和細胞凋亡，從而達到緩解和治療DCM的目的[22]。PI3K/Akt有3 種激活途徑，包括胰島素、GSK-3和 哺乳動物雷帕霉素靶標（mTOR） 。阻斷糖尿病大鼠的PI3K/Akt通路可顯著降低調(diào)節(jié)細胞凋亡的eNOS和mTOR蛋白的表達。PI3K/AKT/mTOR通路參與調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 （ERS） 誘導(dǎo)的細胞死亡[23]。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法從分子水平探討太子參-牡丹皮藥對對治療糖尿病心肌病的機制，太子參-牡丹皮藥能通過多種活性成分、多靶點、多途徑對糖尿病心肌病起到保護作用，為糖尿病心肌病的未來防治提供新思路。