miR-146a通過調(diào)節(jié)IPr1基因?qū)Y(jié)核分枝桿菌感染的AEC Ⅱ型細(xì)胞活性作用機(jī)制*

許明昭 林清香 寇昌偉 汪求真

(山東省公共衛(wèi)生臨床中心結(jié)核科,山東 濟(jì)南 250100)

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)感染引起的。Mtb為細(xì)長(zhǎng)略帶彎曲的桿菌,大小1～4×0.4 μm,主要感染肺部以及淋巴系統(tǒng),主要原因是由于肺部環(huán)境利于Mtb生存,也可感染機(jī)體其他器官,如腦、關(guān)節(jié)、中樞神經(jīng)等[1]。Mtb分為牛型、鳥型、人型等,人型和牛型Mtb的基因具有99.95%同源性,很容易交叉感染而致病。由于Mtb的致病機(jī)理十分復(fù)雜,尤其是近年來(lái)多耐藥結(jié)核菌的出現(xiàn),給結(jié)核病的防治帶來(lái)很大的困難。因此,只有從感染機(jī)制和發(fā)病機(jī)理上進(jìn)行深入研究,才能為結(jié)核病的檢測(cè)和防控提供有效的途徑。肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(Type 2 alveolar epithelial cells,AEC Ⅱ)是“物理屏障”,同肺泡巨噬細(xì)胞一起在機(jī)體對(duì)抗Mtb感染中發(fā)揮著重要的免疫調(diào)控功能,微小RNA(microRNA,miRNA)作為一種內(nèi)源性具有調(diào)控功能的非編碼RNA,在機(jī)體發(fā)育、生理和病理發(fā)生過程中有著重要的調(diào)控功能[2]。miRNA可以影響宿主抵抗Mtb的感染過程,其異常表達(dá)也與結(jié)核病的發(fā)生密切相關(guān)。2005年已有相關(guān)人員在結(jié)核超易感基因座1(Super susceptibility to tubercu-losis 1,sst1)中發(fā)現(xiàn)了胞內(nèi)病原體抗性基因1(Intracel-lular pathogen resistance 1,Ipr1),又稱SP110,同時(shí)證實(shí)了Ipr1可通過調(diào)控巨噬細(xì)胞抵抗Mtb的感染[3]。但目前鮮有miR-146a對(duì)Ipr1治療肺結(jié)核的具體作用機(jī)制研究。因此,本研究旨在探討miR-146a通過調(diào)節(jié)IPr1基因觀察對(duì)Mtb感染的AECⅡ型細(xì)胞活性作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株來(lái)源 AECⅡ細(xì)胞購(gòu)自上海澤葉生物科技有限公司。Mtb標(biāo)準(zhǔn)株(H37Rv)由北京結(jié)核病胸部腫瘤研究所提供。

1.2 主要試劑與儀器 流式細(xì)胞儀(上海三崴醫(yī)療設(shè)備公司,型號(hào):FACSVia);miR-146a、Ipr1引物序列(赫澎生物科技公司,上海);PCR儀(濟(jì)南來(lái)寶醫(yī)療器械公司,型號(hào):Lebqen-96型);CCK8溶液(北京百奧萊博生物科技有限公司)。

1.3 H37Rv株感染AECⅡ細(xì)胞模型的建立 參照文獻(xiàn)[4]建立模型:選取H37Rv株,于37 ℃恒溫培養(yǎng),直至培養(yǎng)基由紅變黃,H37Rv濃度為l×l06ccu/mL。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的人AECⅡ細(xì)胞以1×105個(gè)/mL接種于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)48 h,待細(xì)胞融合度達(dá)75%左右時(shí),利用H37Rv株感染細(xì)胞24 h,感染復(fù)數(shù)(MOI)為10。利用DIO對(duì)H37Rv細(xì)胞膜進(jìn)行熒光染色,然后利用免疫熒光技術(shù)鑒定人AECⅡ細(xì)胞的感染狀況。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 將細(xì)胞分為結(jié)核組(感染Mtb)、 NC組(轉(zhuǎn)染miR-146a NC)、轉(zhuǎn)染組(模型+轉(zhuǎn)染miR-146a)。PBS清洗NC組與轉(zhuǎn)染組細(xì)胞,胰酶消化后離心,將細(xì)胞接種于6孔板中,待細(xì)胞融合至75%時(shí),將Lipofeetamine 2000按3 μL/L稀釋,孵育20 min后,無(wú)血清培養(yǎng)基分別將miR-146a mimics和miR-146a NC按50 μmoL/L稀釋,孵育5 min后,與Lipofectamine 2000等體積混勻,分別加入兩組細(xì)胞中繼續(xù)培養(yǎng),12 h后將無(wú)血清培養(yǎng)基更換為完全培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 RT-PCR檢測(cè)miR-146a、Ipr1基因表達(dá) 取各組細(xì)胞,胰蛋白酶消化后提取細(xì)胞懸液,沖洗,放于無(wú)菌試管中。TRIzol法提取總RNA,Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)合成引物。 將逆轉(zhuǎn)后所得的cDNA進(jìn)行熒光反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。所有反應(yīng)嚴(yán)格按照反應(yīng)的條件進(jìn)行擴(kuò)增,PCR 反應(yīng)條件: 95 ℃ 30 s、 95 ℃ 5 s 、60 ℃ 15 s、72 ℃ 15 s。取PCR產(chǎn)物(20 μL)進(jìn)行電泳分析(瓊脂糖凝膠1.5%),以β-actin為內(nèi)參,共40個(gè)循環(huán),取得到的平均值后得到Ct值,計(jì)算方法用2-△△Ct法進(jìn)行分析,引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5.2 CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖 取各組細(xì)胞,離心5 min,1 250 r/min,制成細(xì)胞懸液,接種于96孔板中(1×104個(gè)細(xì)胞)。分別于細(xì)胞貼壁后24、48、72 h加入CCK-8試劑,避光孵育3 h。酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處OD值。

1.5.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取各組細(xì)胞接種于6孔板中,胰酶消化,配成密度為1×105/mL 的細(xì)胞液,PBS清洗,換用ECM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,離心5 min(1 250 r/min),棄上清,混入500 μL Binding Buffer(結(jié)合緩沖液) 重懸,加入 5 μL Annexin V-FITC混勻、10 μL PI混勻,常規(guī)孵育15 min后,進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5.4 雙熒光素酶報(bào)告 將融合至80%的Mtb感染的AECⅡ細(xì)胞接種于6孔板中,按照LipofectamineTM2000說(shuō)明將Ipr1-3′-UTR-WT、Ipr1-3′-UTR-MUT質(zhì)粒轉(zhuǎn)染miR-146a(NC組),miR-146a lifescience(miR-146a組)共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞,按照說(shuō)明檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 Mtb感染AECⅡ細(xì)胞模型的建立 本研究采用熒光法檢驗(yàn)Mtb在細(xì)胞中的分布情況。激光共聚焦顯示,DIO熒光染色的Mtb在感染人AECⅡ細(xì)胞12 h內(nèi)會(huì)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中,并圍繞細(xì)胞核分布(圖1),表明Mtb感染模型建立成功。

圖1 熒光染色(200×)

2.2 AECⅡ細(xì)胞中miR-146a、Ipr1基因表達(dá) 結(jié)核組與NC組AECⅡ細(xì)胞中miR-146a、Ipr1基因表達(dá)比較無(wú)差異(P>0.05);與NC組相比,轉(zhuǎn)染組AECⅡ細(xì)胞中miR-146a、Ipr1基因表達(dá)水平升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組AECⅡ細(xì)胞miR-146a、Ipr1基因表達(dá)比較

2.3 AECⅡ細(xì)胞增殖情況 結(jié)核組與NC組AECⅡ細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的OD值比較均無(wú)差異(P>0.05);與NC組相比,轉(zhuǎn)染組AECⅡ細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的OD值均升高(P<0.05)。見表3。

表3 各組AECⅡ細(xì)胞OD值比較

2.4 AECⅡ細(xì)胞凋亡情況 結(jié)核組AECⅡ細(xì)胞凋亡率(56.24±6.31)%與NC組AECⅡ細(xì)胞凋亡率(55.06±6.17)%相比無(wú)差異(t=0.050,P=0.961);與NC組相比,轉(zhuǎn)染組AECⅡ細(xì)胞凋亡率(18.15±1.73)%顯著降低(t=14.110,P<0.001)。見圖2。

圖2 各組 AECⅡ細(xì)胞凋亡情況

2.5 雙熒光素酶報(bào)告 雙熒光素酶報(bào)告結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-146a后野生型Mtb感染的AECⅡ細(xì)胞中Ipr1活性升高(P<0.05),突變型Mtb感染的AECⅡ細(xì)胞中Ipr1活性無(wú)明顯變化(P>0.05),表明Ipr1是miR-146a的靶基因,見表4。

表4 雙熒光素酶報(bào)告

3 討論

相關(guān)報(bào)道顯示[5],在世界范圍內(nèi),每年新增肺結(jié)核患者近1 000萬(wàn)人,其中有近200萬(wàn)人死于該病。目前,我國(guó)肺結(jié)核年發(fā)病人數(shù)約為130萬(wàn),位居全球第2位,并且在以畜牧業(yè)為主的我國(guó)西部地區(qū)和農(nóng)村,感染和發(fā)病情況更為嚴(yán)重[6]。有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[7],miRNA對(duì)肺結(jié)核的治療具有一定作用。

miRNA作為一種具有調(diào)控功能的內(nèi)源性非編碼RNA,在機(jī)體的發(fā)育、生理和病理發(fā)生過程中有著重要的調(diào)控功能。然而,在細(xì)菌感染miRNA的作用是比較少探索區(qū)域,但最近的發(fā)現(xiàn)細(xì)菌感染有許多miRNA參與調(diào)節(jié)或擾亂機(jī)體的免疫應(yīng)答[8]。研究證實(shí)[9]miRNA在Mtb感染宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用,如Mtb強(qiáng)毒株活菌或其脂甘露聚糖感染人巨噬細(xì)胞,導(dǎo)致miR-125b的高表達(dá)和miR-155的低表達(dá),抑制了絲裂原活化蛋白激酶2的活化,從而抑制了巨噬細(xì)胞TNF的合成,破壞了宿主免疫系統(tǒng),增加了其感染潛力,這一過程也受到miRNA的調(diào)控。miR-146a是近年來(lái)研究比較前沿和廣泛的miRNA。miR-146a主要作為一種抑制炎癥的因子參與免疫調(diào)節(jié)。miR-146a是結(jié)核病患者中低表達(dá)的miRNA之一,通過抑制細(xì)胞因子TNF-α等的產(chǎn)生來(lái)發(fā)揮可能的抗結(jié)核免疫作用[10]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-146a在Mtb感染的AECⅡ細(xì)胞中低表達(dá),miRNA腺病毒過表達(dá)載體是miRNA過表達(dá)研究的常用技術(shù)之一,為了深入研究miR-146a在AECⅡ細(xì)胞抗Mtb的免疫調(diào)控作用,構(gòu)建了miR-146a的腺病毒過表達(dá)載體,利用miR-146a轉(zhuǎn)染至Mtb毒株感染AECⅡ細(xì)胞模型中,發(fā)現(xiàn)miR-146a在Mtb感染的AECⅡ細(xì)胞中低表達(dá),在經(jīng)過轉(zhuǎn)染后,AECⅡ細(xì)胞增殖增加,凋亡減少,表明其參與了AECⅡ細(xì)胞抗Mtb感染過程。程龍等[11]研究發(fā)現(xiàn),AECⅡ細(xì)胞抗Mtb感染過程中,miR-146a負(fù)調(diào)控TLRs信號(hào)通路中MyD88、TRAF6、NF-κB和IL-6等來(lái)調(diào)控AECⅡ細(xì)胞對(duì)Mtb的感染過程。陳輝國(guó)等[12]研究發(fā)現(xiàn),在肺癌中,miR-146a可調(diào)控肺癌細(xì)胞的增殖與凋亡。本研究與上述研究結(jié)果相似,因此認(rèn)為轉(zhuǎn)染高表達(dá)的miR-146a可調(diào)控AECⅡ細(xì)胞的活性,從而達(dá)到抗Mtb的作用。

Ipr1基因是新近發(fā)現(xiàn)的與小鼠結(jié)核病易感性相關(guān)的基因,在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物水平及體外細(xì)胞水平觀察到該基因的表達(dá)可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞抗分枝桿菌等胞內(nèi)病原體的能力[13-14]。Ipr1基因含有 SP100 基序、染色質(zhì)結(jié)合域、核定位信號(hào)及細(xì)胞核激素受體結(jié)合域,并發(fā)現(xiàn)其表達(dá)受干擾素的調(diào)節(jié),因此推測(cè)Ipr1基因編碼蛋白可能通過參與干擾素信號(hào)途徑、核激素受體途徑等誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活化、基因表達(dá)及細(xì)胞死亡[15-16]。另有研究證實(shí)[17],Ipr1 通過多種機(jī)制介導(dǎo)巨噬細(xì)胞抗結(jié)核。正常情況下,巨噬細(xì)胞中Ipr1 低水平表達(dá),Mtb或其他因子誘導(dǎo)Ipr1表達(dá)上調(diào)。Ipr1與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶相互作用介導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡;另一方面,Ipr調(diào)控與免疫和細(xì)胞凋亡相關(guān)的miRNA表達(dá),也能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、Mtb清除[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn),Ipr1在Mtb感染的AECⅡ細(xì)胞中為低表達(dá),在經(jīng)過轉(zhuǎn)染高表達(dá)的miR-146a后,Ipr1水平升高,同時(shí)增殖增加,凋亡減少。吳勇延等[20]研究已經(jīng)證實(shí),Ipr1調(diào)控與免疫和細(xì)胞凋亡相關(guān)的miRNA表達(dá),如miR-146a、miR-155等,起始或促進(jìn)細(xì)胞凋亡和胞內(nèi)Mtb清除。本研究與上述研究結(jié)果相似,同時(shí)本研究雙熒光素酶報(bào)告結(jié)果也顯示,Ipr1是miR-146a的靶基因,因此本研究認(rèn)為,轉(zhuǎn)染高表達(dá)的miR-146a后,通過提高Ipr1水平,調(diào)控細(xì)胞的增殖與凋亡,發(fā)揮抗Mtb的作用。

4 結(jié)論

過表達(dá)的miR-146a可增加Mtb感染的AECⅡ細(xì)胞活性,降低凋亡,研究機(jī)制認(rèn)為可能與通過激活I(lǐng)pr1水平相關(guān)。Ipr1是miR-146a靶基因,可通過激活表達(dá)而發(fā)揮減少M(fèi)tb對(duì)AECⅡ細(xì)胞活性的損傷。