近紅外光譜法快速檢測何首烏炮制過程中多糖含量的研究

賈 彬，陳啟文，賴嘉敏，張龍開，向超群，郭 拓，程 敏，肖 雪*

（1.國家藥品監(jiān)督管理局藥品快速檢驗技術重點實驗室（廣東省藥品檢驗所），廣東 廣州 510663；2.廣東藥科大學 廣東省代謝病中西醫(yī)結合研究中心（中醫(yī)藥研究所），廣東 廣州 510006；3.弘正道（中國）中藥研究有限公司，廣東 廣州 510665；4.陜西科技大學 電子信息與人工智能學院，陜西 西安 710021）

何首烏為蓼科植物何首烏（Pleuropterus multifloruThunb.）的干燥塊根，多以生首烏和制首烏做藥用。制首烏是生首烏的加工品，有補肝腎、益精血、強筋骨、烏須發(fā)、化濁降脂的作用。何首烏經(jīng)炮制后，瀉下作用降低，補益作用增強，呈明顯的“生熟異用”功效。近代藥理學研究顯示，何首烏在抗衰老、抗腫瘤、改善心血管功能、增強免疫力等方面具有良好的療效［1-3］。而何首烏多糖作為何首烏中的主要藥效成分，具有極高的藥理活性，包括抗衰老［4］、抗炎［5］、降血脂［6］、抗腫瘤、免疫調節(jié)［7］等多種作用。多糖在炮制過程中的變化是何首烏藥性改變的主要原因?，F(xiàn)有研究多聚焦在古法炮制何首烏過程中多糖結構和含量的變化等，但古法炮制何首烏中含有黑豆多糖，難以闡釋炮制過程對何首烏多糖的影響。因此有必要建立一種可以快速準確地分析何首烏炮制過程中多糖含量變化的方法。

近紅外光譜技術具有快速、無損、綠色等優(yōu)點，已廣泛應用于醫(yī)藥［8］、化工［9］、食品［10］等領域。姬生國團隊基于近紅外光譜技術分別開展了制何首烏中二苯乙烯苷、游離蒽醌、醇溶性浸出物、水分等指標的快速測定研究［11-14］，為何首烏藥材合規(guī)性快檢提供了技術支持。

但復雜樣品的近紅外光譜存在譜帶寬、吸收峰重疊等問題，需要借助化學計量學方法對光譜進行模型校正［15］。同時，由于檢測儀器的影響，近紅外光譜信號中的背景、噪聲、基線、雜散光等會影響模型質量，需對光譜進行預處理［16］。

本研究以何首烏清蒸炮制過程中多糖的含量變化為基礎，采用傅里葉變換紅外光譜儀采集何首烏的近紅外光譜數(shù)據(jù)，并通過偏最小二乘法（PLS）對樣本光譜進行校正。采用SG 平滑、變量標準化（SNV）、一階解卷積導數(shù)（1stDec）、二階解卷積導數(shù)（2ndDec）對光譜進行預處理。同時，為提高模型的預測能力及穩(wěn)定性，選擇競爭自適應重加權采樣（CARS）、蒙特卡洛無信息變量消除法（MCUVE）、隨機蛙跳法（RF）對光譜變量進行篩選。在此基礎上建立了快速準確的何首烏多糖定量分析模型，以為何首烏炮制過程的狀態(tài)分析等研究提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與樣品

MPAⅡ型傅里葉變換近紅外光譜分析儀（德國布魯克公司）；UV-3100PC 型紫外分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；KQ5200E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ELGA 超純水機（法國威立雅集團）；Sartorius BS110S 萬分之一電子天平（德國賽多利斯集團）；LD-200 型高速多功能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）。布魯克近紅外光譜分析軟件OPUS 8.5（德國布魯克公司）、MATLAB R2020b（美國MathWorks公司）、Unscrambler X 10.4（64-bit）（挪威Camo analytics公司）。

無水乙醇、濃硫酸（分析純），純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司），葡萄糖（廣州化學試劑廠），蒽酮（上海麥克林生化科技股份有限公司）。

生何首烏（產(chǎn)地廣東，批號20211260）、黑豆制何首烏（產(chǎn)地貴州，批號D2012132）均由弘正道（中國）中藥研究有限公司提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 制何首烏的制備參照《中國藥典》［17］2020 年版通則（0213）蒸法炮制加工制何首烏。分別取約10 kg 何首烏片，加入6 700 mL 超純水，拌勻，靜置過夜使汁吸盡，隔水加熱，分別在0、2、4、8、12、18、24、30、36、48 h 取出一定量樣品，曬干，得到10 批清蒸制何首烏樣品，依次標記為Q0、Q2、Q4、Q8、Q12、Q18、Q24、Q30、Q36、Q48。

1.2.2 多糖的制備以上述不同清蒸時間的何首烏與市售制何首烏（標記為Z）共計11 批次樣品為對象，在各批次樣品中隨機取6份作為獨立樣本，共收集何首烏樣品66個。

1.2.2.1 何首烏樣品預處理精密稱定何首烏樣品100 g（過20目篩），置于圓底燒瓶內，加入80%乙醇1 000 mL，加熱回流1 h除去藥材中的脂溶性成分，趁熱過濾，濾渣用80%乙醇洗滌至無色，揮干表面殘留的醇溶液，干燥至恒重備用。

1.2.2.2 何首烏多糖的提?。?8］按照料液比1∶25 的比例將預處理的樣品與純凈水置于圓底燒瓶中，提取2.5 h；第二次按料液比1∶20，提取2 h。趁熱過濾，合并水提液后濃縮至100 mL，隨后緩慢加入無水乙醇至醇含量達60%，搖勻，置于4 ℃冰箱靜置8 h。取出，在濾餅中依次加入丙酮、石油醚2～3次進行抽濾操作，烘干濾餅即得到何首烏水提粗多糖固體。精密稱定各何首烏水提粗多糖15 mg，加適量熱水溶解并定容至250 mL容量瓶中備用。

1.3 蒽酮-硫酸法測定何首烏粗多糖中的單糖含量

移取2 mL 待測液置于比色管中，加入6 mL 蒽酮-硫酸試劑，劇烈振蕩搖勻，浸于冰水浴中冷卻，于100 ℃水浴煮沸5 min，取出，在冰水浴中冷卻后于625 nm下測定吸光度值。

1.4 近紅外光譜采集

何首烏樣品粉末的近紅外光譜均使用MPAⅡ型傅里葉變換近紅外光譜分析儀獲得。采用MATLAB 2020b、Unscrambler X 10.4 化學計量學軟件對數(shù)據(jù)進行處理。光譜測定條件：光譜范圍11 550～3 950 cm-1，掃描次數(shù)32 次，分辨率16 cm-1，軟件為OPUS 8.5。以每個樣品平行測定3 次后的平均光譜作為該樣品的光譜。

2 結果與討論

2.1 何首烏多糖含量測定方法學考察

移取2 mL 葡萄糖標準品溶液，加入6 mL 蒽酮-硫酸溶液，劇烈振蕩搖勻，浸于冰水浴中冷卻3 min，再置于100 ℃水浴中煮沸5 min取出，冰浴3 min，于440～800 nm波長下測定吸光度值。結果顯示樣品在625 nm處有最大吸收波長。

2.1.1 標準曲線建立配制質量濃度分別為0.02、0.04、0.05、0.06、0.08、0.1、0.15 mg/mL的葡萄糖標準品溶液，各取2 mL 測定其吸光度，以葡萄糖質量濃度（X，mg/mL）為橫坐標，吸光度值（Y）為縱坐標，繪制標準曲線。結果表明，硫酸-蒽酮法測定的葡萄糖在0.02～0.15 mg/mL范圍內線性關系良好，回歸方程為Y=4.807 4X+0.095 4，相關系數(shù)（r2）為0.999 5。

2.1.2 精密度分別吸取Q0樣品粗多糖溶液2 mL 至7個比色管中，測定吸光度值，計算得到各樣品質量濃度的相對標準偏差（RSD）為0.40%，表明儀器精密度良好。

2.1.3 重復性平行制備Q0 樣品粗多糖溶液7 份，分別測定吸光度值，計算得到各樣品質量濃度的RSD為1.9%，表明方法重復性良好。

2.1.4 穩(wěn)定性取Q0 樣品粗多糖溶液2 mL，測定吸光度值，以第一次測量的時間為0 min，分別測定0、10、20、30、40、50、60 min 時樣品的吸光度值，計算得到各樣品質量濃度的RSD 為1.4%，表明溶液在60 min內穩(wěn)定性良好。

2.1.5 加標回收率平行制備Q0 樣品粗多糖溶液6份，分別加入已知樣品含量相當?shù)钠咸烟菢藴势饭腆w，在625 nm 下測定吸光度值，計算得到平均加標回收率為98.6%，RSD為2.5%，表明方法的準確度良好。

2.2 不同炮制時間點的清蒸何首烏粗多糖及其單糖含量

為闡明何首烏炮制過程中多糖的含量變化情況，同時為建立近紅外定量模型提供多糖真實信息，對不同炮制時間點的清蒸何首烏粗多糖及其單糖含量進行了測定。結果顯示，清蒸過程中何首烏多糖的含量先升高后降低并逐漸趨于平穩(wěn)，總體呈上升趨勢（如圖1）。市售制何首烏多糖含量為29.06%，與實驗室制清蒸何首烏多糖含量相當。許煜迪［19］發(fā)現(xiàn)清蒸法炮制何首烏48 h，多糖類成分含量逐漸升至31.39%，單糖和二糖類成分含量逐漸降低，糖類成分總含量呈上升趨勢。結構研究發(fā)現(xiàn)［20］，隨著炮制的不斷深入，何首烏多糖的分子量逐漸降低。表明高溫炮制過程中單糖、二糖以及多糖的糖鏈發(fā)生斷裂，使得其水溶性增加、黏度降低、多糖溶出度增高，提高了多糖的生物活性［21］。但何首烏經(jīng)炮制后轉化為分子量較小的糖類成分，是否對其功效活性產(chǎn)生影響，還有待進一步研究。

圖1 清蒸過程何首烏多糖含量變化Fig.1 Changes of polysaccharide content in Polygoni Multiflori during steaming process

2.3 近紅外光譜數(shù)據(jù)

各樣品的近紅外光譜如圖2A所示。結果顯示，何首烏在清蒸過程不同時間點的樣品光譜呈現(xiàn)基本相似的趨勢，然而由于頻帶重疊程度較高，導致目標組分的特征波長難以確定。因此，有必要對原始光譜進行預處理，以提高信噪比、消除無效變異、提升模型質量。

圖2 不同預處理方式的清蒸何首烏近紅外光譜圖Fig.2 Near-infrared spectra of steamed Polygoni Multiflori with different pretreatment methods

2.4 預處理方法選擇

SG 平滑、SNV、1stDec、2ndDec 是常見的預處理方法，SG 可去除噪聲，提高信噪比；導數(shù)處理可放大關鍵信號，減少背景效應對信號的干擾；SNV 可消除因顆粒大小不同或分布不均導致的散射現(xiàn)象對光譜的影響。另外，由于光譜變量較多，無關變量的引入可導致模型預測能力降低［22］，需對光譜數(shù)據(jù)進行篩選。CARS、MCUVE、RF 是較為常用的變量篩選方法。CARS 是一種用于多目標優(yōu)化的進化算法，魯棒性高，具有較強的自適應性，但面對高維問題時速度較慢［23］。MCUVE 是一種通用的特征選擇方法，該算法不依賴特定的數(shù)據(jù)，適用于各種類型的光譜數(shù)據(jù)，亦能處理數(shù)據(jù)中的干擾因素，提高模型的穩(wěn)定性，但存在計算復雜性高、容易丟失相關性高的特征數(shù)據(jù)等缺點，需根據(jù)具體情況進行適當調整和評估［24］。RF具有全局搜索能力強、簡單和種群多樣的優(yōu)點，但收斂速度慢、參數(shù)選擇困難且易陷入局部最優(yōu)，需根據(jù)具體問題和需求綜合考慮其優(yōu)缺點，并進行合理的參數(shù)設置和調整［25］。

2.5 聚類分析

聚類分析可利用樣本的光譜特征，將具有相似或相同特征的樣本進行聚類，并根據(jù)樣本間的相似度來確定聚集順序。相似度最大的樣本將被首先聚集，最終得到不同類別或顯著共性特征的聚合結果。本實驗采用Ward’s 方法對不同清蒸時間的何首烏樣品粉末的光譜進行聚類分析（圖3），結果顯示各時間點的何首烏樣品差異顯著，在含量上可能有較大的差異。

圖3 不同清蒸時間何首烏樣品聚類分析圖Fig.3 Cluster analysis of Polygoni Multiflori with different steaming times

2.6 多糖含量模型分析

2.6.1 樣本集劃分將不同清蒸時間的何首烏粉末隨機取樣后測定多糖含量，并測定其光譜數(shù)據(jù)用于建立多糖含量的定量模型，共得到66個樣本。利用K-S算法將樣本集劃分成校正集和預測集，其中校正集44個樣本，預測集22個樣本，數(shù)據(jù)集劃分結果如表1所示。校正集的樣品數(shù)據(jù)范圍包含了預測集的樣品數(shù)據(jù)范圍，說明該數(shù)據(jù)方法合理有效。

表1 模型樣本集分類結果Table 1 Classification results of sample collection

2.6.2 預處理方法優(yōu)化樣品的近紅外原始光譜圖存在嚴重的光譜疊加現(xiàn)象，許多吸收峰的吸收強度較弱，可能存在潛在的噪音和基線漂移干擾［26］，導致有效的光譜信息被掩蓋，難以準確提取。本文選擇SG、SNV、1stDec、2ndDec以及兩兩結合等方法對樣品的近紅外光譜數(shù)據(jù)進行預處理，結果如圖2所示。

以R2（包括校正集相關系數(shù)R2c和預測集相關系數(shù)R2p）、交叉驗證集均方根誤差（RMSECV）和預測集均方根誤差（RMSEP）評價模型性能。R2c和R2p越接近1，則預測值和實際值之間的關聯(lián)越強，預測結果越可靠；R2值大于0.9，則表示模型預測值與目標變量之間的相關性較強，可以很好地解釋目標變量的方差；RMSECV 越小則定量模型效果越好；RMSEP 越小則模型的預測能力越強［27］。表2 中列出了經(jīng)不同方法預處理后的定量模型結果。由表2 可見，對光譜進行導數(shù)處理后，模型質量下降，預測能力降低。這可能是由于導數(shù)處理放大了噪聲信號所致。SG 平滑+SNV 處理的光譜在定量模型方面表現(xiàn)出良好的效果，具有較強的預測能力。但較高的主因子數(shù)（LV）可能對模型的穩(wěn)定性和可解釋性有負面影響［28］。因此，需要進行變量篩選去除冗余光譜數(shù)據(jù)，簡化模型，提高模型的魯棒性。

表2 不同預處理方法的PLS模型分析結果Table 2 Results of PLS model analysis with different preprocessing methods

2.6.3 變量篩選方法優(yōu)化本研究在SG +SNV 預處理的基礎上，選擇MCUVE、CARS、RF 3 種方法進行變量篩選，模型分析結果及變量分布如表3 和圖4（圖中紅色的部分表示對應算法篩選出的關鍵變量）所示。結果顯示，RF 方法可從1 333 個變量中篩選出50 個重要變量，模型提升結果為R2c=0.96，RMSEC=0.74；R2p=0.96，RMSEP=0.28。模型性能良好。

表3 不同變量篩選方法的PLS模型分析結果Table 3 Results of PLS model analysis with different variable screening methods

圖4 清蒸何首烏樣品不同變量篩選后的結果Fig.4 Results of steamed Polygoni Multiflori samples after different variable selection methods

通過對66 批何首烏的原始近紅外光譜圖進行SG+SNV 處理（圖2H），發(fā)現(xiàn)在9 000～8 000 cm-1波段，何首烏樣品在炮制過程中與生品和制品之間存在較大差異。使用RF 算法篩選出的變量分布在12 000～10 000 cm-1范圍，其中包括O—H 伸縮振動以及C—H 伸縮振動。同時，篩選出4 500～4 100 cm-1、6 000～5 500 cm-1和8 000 cm-1附近的變量。其中4 500～4 100 cm-1范圍內的波長點主要由C—H 彎曲振動和C—H 伸縮振動的合頻以及C—H 彎曲振動和O—H 伸縮振動的合頻產(chǎn)生［29］；6 000～5 500 cm-1和8 000 cm-1附近的波長點，由—CH2和—CH3中C—H 伸縮振動的第一和第二合頻引起［30］。RF 所選定的波長點相對較分散，表明樣品的成分非常復雜，每個波段都含有有用信息。然而，要準確地將這些波段分配給特定的成分難度較高。因此，本研究中只列出了粗略的波段分配，詳細的波段分配仍需要進一步研究。綜上所述，RF算法所篩選出的特征變量準確、合理，說明這些特征變量與目標化合物的結構密切相關。2.6.4 模型驗證 將K-S算法劃分的22個預測集樣品近紅外光譜數(shù)據(jù)導入建立的RF-PLS模型中，得到模型預測值并驗證該模型的預測能力。表4 為清蒸何首烏多糖含量模型預測集實際值和預測值的詳細數(shù)據(jù)。結果表明，近紅外光譜預測值與實際值基本一致，相對偏差均小于3.0%，表明模型的預測性能較好，能夠準確預測未知樣本的多糖含量。

表4 預測集多糖含量的參考值與預測值Table 4 Reference and predicted values of polysaccharide content in prediction set /%

（續(xù)表4）

3 結 論

中藥質量是影響中藥臨床療效、產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重大關鍵問題［31］。中藥的質量控制應著重注意生產(chǎn)過程中的監(jiān)控，尤其是在線實時分析。近紅外光譜技術作為一種綠色的快速分析方法，可以便捷、準確、實時、無損的分析中藥炮制過程中成分的含量變化。本研究探討了清蒸何首烏過程中何首烏多糖的含量變化，并采用近紅外光譜技術構建了其含量的快速測定方法，為何首烏的炮制過程研究提供了技術支持。