蚯蚓多肽的提取純化工藝及應(yīng)用研究進(jìn)展

劉忠慧,周燕代子,王存文

(武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院 綠色化工過(guò)程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 新型反應(yīng)器與綠色化學(xué)工藝湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430205)

蚯蚓又名地龍,為巨蚓科動(dòng)物參環(huán)毛蚓或縞蚯蚓的全體蟲(chóng),是我國(guó)重要的動(dòng)物類中藥材之一?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》記載,蚯蚓具有清熱、定驚、通絡(luò)、平喘、利尿的功效;《本草綱目》記載,蚯蚓具有通經(jīng)活絡(luò)、活血化瘀、預(yù)防心腦血管疾病的功效。蚯蚓是陸地生態(tài)系統(tǒng)中生物量最大的無(wú)脊椎土壤動(dòng)物,且生長(zhǎng)周期較短,在環(huán)保領(lǐng)域具有極大的開(kāi)發(fā)價(jià)值。例如在濕地中人工養(yǎng)殖蚯蚓,可去除廢水中的TP、TN、COD及重金屬Cu、Zn等[1];在污泥中養(yǎng)殖蚯蚓,可去除污泥中的大部分有機(jī)物[2],對(duì)生態(tài)環(huán)境起到極大的優(yōu)化作用。但目前蚯蚓大多以鮮體或干體的形式作為飼料應(yīng)用于水產(chǎn)和家禽養(yǎng)殖等領(lǐng)域[3],存在利用率較低、附加值不高、浪費(fèi)嚴(yán)重等問(wèn)題。因此,提高蚯蚓的利用價(jià)值成為目前亟需解決的問(wèn)題。

蚯蚓含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分,如氨基酸、有機(jī)酸、核苷酸、含氮類物質(zhì)等[4],其中蛋白含量高達(dá)70%,多肽活性成分高達(dá)55%～68%[5],在醫(yī)藥和臨床方面極具應(yīng)用價(jià)值。因此,蚯蚓多肽的提取純化受到廣泛關(guān)注。覃麟等[6]利用Alcalase蛋白酶提取蚯蚓多肽,發(fā)現(xiàn)其具有良好的抗氧化性能。Hidayat等[7]利用木瓜蛋白酶提取蚯蚓蛋白中的氨基酸,可用作食品添加劑,極大地提高了蚯蚓蛋白的利用率。劉廷強(qiáng)等[8]利用蚯蚓自溶酶提取蚯蚓中的小分子多肽,發(fā)現(xiàn)其能有效提高成人皮膚成纖維細(xì)胞和表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的活性,可用作化妝品添加劑。在此,作者對(duì)蚯蚓蛋白的酶解工藝進(jìn)行介紹,對(duì)蚯蚓多肽純化工藝的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行分析,包括層析法、電泳法、膜分離法等,并對(duì)蚯蚓多肽在神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)等方面的藥理作用進(jìn)行綜述,擬為蚯蚓多肽的進(jìn)一步研究和高效利用提供參考。

1 蚯蚓蛋白的酶解工藝

利用外源蛋白酶分解未溶解的蛋白質(zhì)可以最大限度地提高蛋白質(zhì)的水解程度,并且不會(huì)影響或減少蛋白質(zhì)中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[9]。Baehaki等[10]研究證明,酶比化學(xué)試劑更加溫和,酶解蛋白工藝不會(huì)破壞蛋白質(zhì)中的活性多肽和氨基酸結(jié)構(gòu),相較于化學(xué)水解蛋白工藝更有利于活性物質(zhì)的提取。此外,蚯蚓蛋白水解得到的多肽多用于藥物類研究,而化學(xué)試劑的添加會(huì)降低多肽作為藥物成分的安全性,因此,酶解工藝是目前水解蚯蚓蛋白的最優(yōu)選擇。

酶解法是在特定的溫度和pH值下,利用蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行水解,將高分子量蛋白質(zhì)分解成低分子量多肽。不同酶水解蛋白質(zhì)可以得到不同的生物活性肽,且同一種酶以不同的酶解工藝得到的生物活性肽也會(huì)有所差異。因此,針對(duì)不同種類的小分子生物活性肽產(chǎn)物,篩選合適的酶及酶解工藝尤為重要。

Alcalase蛋白酶往往被用于提取抗氧化肽和更小分子量的N-氨基化合物,其中抗氧化肽可作為一種優(yōu)良的天然抗氧化劑,應(yīng)用于藥食兩用食品中,而N-氨基化合物作為生物生長(zhǎng)的必要營(yíng)養(yǎng)成分通常用作營(yíng)養(yǎng)品添加劑[7]。酸性蛋白酶具有極強(qiáng)的水解活性,可以將蚯蚓蛋白水解成分子量更小的氨基酸[11];而彈性蛋白酶和胰蛋白酶可水解蚯蚓蛋白得到含有抑制肺腺癌細(xì)胞的多肽物質(zhì)[12];將胃蛋白酶和胰蛋白酶混合后水解蚯蚓蛋白,得到具有抗凝活性的多肽物質(zhì)[13];蚯蚓自溶酶作為蚯蚓自身存在的一種水解酶,對(duì)蚯蚓中各種活性成分的提取安全性最高,但其水解程度相對(duì)較低[14-15]。表1總結(jié)了不同酶的酶解工藝。

表1 不同種類酶的酶解工藝

2 蚯蚓多肽的純化工藝

蚯蚓蛋白酶解后會(huì)產(chǎn)生多種不同分子量的活性多肽,往往具有不同的功效,針對(duì)不同分子量多肽的純化尤為重要。常見(jiàn)的蚯蚓多肽純化工藝主要有層析法、電泳法、膜分離法等。

2.1 層析法

層析法由俄國(guó)植物學(xué)家Tswett首先提出,是基于待分離物質(zhì)的理化性質(zhì)差異建立的分離方法。層析體系由固定相和流動(dòng)相組成,其中固定相為固體物質(zhì)或固定于固體物質(zhì)上的成分,流動(dòng)相是可以流動(dòng)的物質(zhì),如水或各種溶劑。由于多肽為小分子活性物質(zhì),應(yīng)用于多肽純化的層析法通常分為凝膠過(guò)濾層析法、柱層析法和離子交換層析法等3種。

2.1.1 凝膠過(guò)濾層析法

凝膠過(guò)濾層析法又稱排阻層析或分子篩方法,主要是根據(jù)蛋白質(zhì)質(zhì)量的大小差異進(jìn)行分離和純化,其分離原理如圖1所示。

圖1 凝膠過(guò)濾層析法的分離原理Fig.1 Separation principle of gel filtration chromatography

凝膠過(guò)濾層析法所用的凝膠屬于惰性載體,不帶電荷,吸附力弱,操作條件較溫和,可在相當(dāng)寬的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行,不需要有機(jī)溶劑。張?zhí)m娥等[24]采用凝膠過(guò)濾層析法成功提純了蚯蚓中的活性多肽,發(fā)現(xiàn)其對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)活性有抑制作用。Li等[25]采用凝膠過(guò)濾層析法提取了蚯蚓酶解液中的三肽復(fù)合物,發(fā)現(xiàn)其對(duì)HeLa細(xì)胞的病變和凋亡起到一定作用,且對(duì)正常人類皮膚成纖維細(xì)胞的細(xì)胞毒性很低,可用于新抗癌化合物的開(kāi)發(fā)。

2.1.2 柱層析法

柱層析法又稱柱色譜法,主要是根據(jù)樣品混合物中各組分在固定相和流動(dòng)相中分配系數(shù)的不同將組分有效分離。相較于其它純化方法,柱層析法使用的固定相的成本較低,且易處理。杜智勇等[26]通過(guò)柱層析法從蚯蚓中提取了谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶,其比活力達(dá)到1.236 U·(mg Pr)-1,純化倍數(shù)達(dá)到14倍,收率為17.7%,具有良好的純化效果。

2.1.3 離子交換層析法

離子交換層析法是在一定pH值條件下,根據(jù)蛋白質(zhì)所帶電荷不同來(lái)分離蛋白質(zhì)的一種方法,其分離原理如圖2所示。

圖2 離子交換層析法的分離原理Fig.2 Separation principle of ion exchange chromatography

離子交換層析法具有操作簡(jiǎn)單、流動(dòng)相成本低、蛋白回收率高等優(yōu)點(diǎn),尤其對(duì)于蚯蚓多肽的純化,保證其活性尤為重要。李嬌等[27]利用CM-22離子交換層析和DEAE離子交換層析實(shí)現(xiàn)了蚯蚓葡萄糖氧化酶的純化,回收率達(dá)到60.8%,比活力達(dá)到2 684.2 mU·mg-1,純化倍數(shù)達(dá)到37.2倍。

2.2 電泳法

電泳法是指在電場(chǎng)作用下,帶電荷的供試品(如蛋白質(zhì)、多肽等)在惰性介質(zhì)(如紙、醋酸纖維素、聚丙烯酰胺凝膠等)中,向其對(duì)應(yīng)的電極方向按各自的速度進(jìn)行泳動(dòng),使組分分離成狹窄的區(qū)帶,達(dá)到分離純化的目的。由于多肽的分子量通常在10 kDa以下,常采用毛細(xì)管電泳法、雙向電泳法純化多肽。

2.2.1 毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳法是一類以毛細(xì)管為分離通道、高壓直流場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力的新型液相分離技術(shù)。根據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為的差異實(shí)現(xiàn)分離,其分離原理如圖3所示。

圖3 毛細(xì)管電泳法的分離原理Fig.3 Separation principle of capillary electrophoresis

周鑫悅等[28]通過(guò)高效毛細(xì)血管電泳法同時(shí)分離檢測(cè)出6種蚯蚓多肽,6種蚯蚓多肽可在10 min內(nèi)達(dá)到基線分離。顏松益等[29]通過(guò)毛細(xì)管電泳-大體積樣品堆積法同時(shí)富集4種蚯蚓多肽VQ-5、OEP3121、F-1和AQ-5,測(cè)得蚯蚓蛋白粉中多肽AQ-5含量為0.0012%,4種蚯蚓多肽的回收率在91.97%～102.67%之間,達(dá)到了極好的分離純化效果。

2.2.2 雙向電泳法

雙向電泳是等電聚焦電泳(根據(jù)pH值分離)和SDS-PAGE電泳(根據(jù)分子量大小分離)的組合,其分離原理如圖4所示。

圖4 雙向電泳法的分離原理Fig.4 Separation principle of bidirectional electrophoresis

雙向電泳法具有樣品不易擴(kuò)散、用量少、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),可以得到更清晰的蛋白質(zhì)分布圖。郭錦等[30]利用SDS-PAGE電泳和雙向電泳評(píng)價(jià)了三氯乙酸-丙酮沉淀法、裂解液法和酚抽提法對(duì)蚯蚓總蛋白的提取效果,確定改良后的三氯乙酸-丙酮沉淀法為蚯蚓總蛋白的最佳提取方法。

2.3 膜分離法

膜分離法是指在分子水平上不同粒徑分子的混合物通過(guò)半透膜實(shí)現(xiàn)選擇性分離的技術(shù),其分離原理如圖5所示。

圖5 膜分離法的分離原理Fig.5 Separation principle of membrane separation

對(duì)于蚯蚓多肽等熱敏性物質(zhì),膜分離法能有效減少成分損失,且不改變蚯蚓多肽的物理性質(zhì)。Fu 等[31]通過(guò)中空纖維膜分離-體積排阻色譜法從蚯蚓粗提物中分離純化出3種高純度的活性多肽,純化效率較高。

表2總結(jié)了實(shí)驗(yàn)室采用的蚯蚓多肽純化方法的優(yōu)缺點(diǎn)及主要適用范圍,工業(yè)上采用的蚯蚓多肽的純化工藝還需進(jìn)一步研究。

表2 蚯蚓多肽純化方法的優(yōu)缺點(diǎn)及主要適用范圍

3 蚯蚓多肽的藥理作用

蚯蚓多肽中的多種活性成分具有不同的藥理作用,目前具有抗氧化和抗凝血作用的蚯蚓小分子活性肽在神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)中的應(yīng)用較為成熟。

3.1 對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的作用

蚯蚓中的有效成分抗凝肽、溶栓肽和纖維酶[15]等可通過(guò)抗凝、溶栓、調(diào)節(jié)纖溶系統(tǒng)平衡等機(jī)制,抑制血栓形成,改善腦循環(huán)[32]。蚯蚓中的蚓激酶(LK)具有類似纖溶酶原激活物的作用,聯(lián)合氯吡格雷可治療短暫性腦缺血發(fā)作,并對(duì)糖尿病有明顯療效[33]。癲癇作為一種神經(jīng)系統(tǒng)綜合征,其發(fā)作主要與中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的興奮性氨基酸和抑制性氨基酸之間的平衡失調(diào)有關(guān),蚯蚓不僅可以降低興奮性谷氨酸的含量,同時(shí)可以提高抑制性氨基丁酸的水平,改善興奮性與抑制性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)的平衡失調(diào),從而延長(zhǎng)癲癇發(fā)作的潛伏時(shí)間[34]。蚯蚓中的蚓激酶、不飽和脂肪酸等成分對(duì)血管性癡呆、阿爾茲海默癥等神經(jīng)系統(tǒng)疾病均可以起到不錯(cuò)的治療效果[35]。

3.2 對(duì)呼吸系統(tǒng)的作用

張勝碧等[36]研究發(fā)現(xiàn),高劑量蚯蚓提取液與地塞米松結(jié)合使用能顯著降低基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2/基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)-1值(P<0.05),通過(guò)調(diào)節(jié)MMPs/TIMP-1平衡,對(duì)哮喘小鼠氣道重塑具有一定的改善作用;蚯蚓提取液通過(guò)改善氣道炎癥、抗阻胺、舒張支氣管等作用,以緩解支氣管痙攣,從而發(fā)揮平喘的作用。汪磊等[37]將蚯蚓與其它中藥搭配使用,對(duì)不同程度的哮喘都有一定的緩解作用。

3.3 對(duì)心血管系統(tǒng)的作用

趙信科等[38]研究發(fā)現(xiàn),地龍降壓膠囊通過(guò)抑制RAAS系統(tǒng)過(guò)度激活及TGF-1、VEGF等蛋白的表達(dá)從而發(fā)揮明顯的降壓作用,從蚯蚓中提取的次黃嘌呤已在臨床上用作降壓藥的有效成分。蚯蚓中提取的抗菌活性肽能有效抑制牙齦卟啉單胞菌的生長(zhǎng),預(yù)防牙周炎的發(fā)生[39]。此外,蚯蚓多肽與疏血通結(jié)合,通過(guò)激活MYPT1/LIMK1/Cofilin通路以促進(jìn)缺血后血管的生成,有效改善缺血問(wèn)題[40]。

3.4 對(duì)免疫系統(tǒng)的作用

蚯蚓提取液通過(guò)抑制JAK-STAT3通路,從而抑制結(jié)腸癌移植瘤的生長(zhǎng)及血管新生[41];蚯蚓提取液通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活化,預(yù)防結(jié)腸炎后結(jié)腸癌的發(fā)生與發(fā)展[42];蚯蚓提取液中還含有抑制肺腺癌細(xì)胞的活性成分[12];蚯蚓組織中存在既可抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng),又可促進(jìn)骨髓原始細(xì)胞增殖造血的活性物質(zhì),能夠改善血液流變,從而改善全身各組織器官代謝[43];蚯蚓中提取的抗氧化酶可有效清除氧自由基,阻斷過(guò)氧化反應(yīng),從而修復(fù)受損部位,加速創(chuàng)面愈合[44];此外,蚯蚓多肽還可調(diào)控炎癥因子表達(dá),抑制炎癥反應(yīng),從而改善炎癥損傷[45]。

3.5 對(duì)運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)的作用

G-90是一種從蚯蚓中提取的蛋白肽[46],含有多種生長(zhǎng)因子,可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和增殖,增強(qiáng)基質(zhì)鈣沉積能力,提高堿性磷酸酶、骨橋蛋白和骨鈣素的表達(dá)水平。Hussain等[47]從分子量大小和氨基酸組成等方面對(duì)從蚯蚓中提取的6種抗菌肽進(jìn)行了評(píng)價(jià),發(fā)現(xiàn)其中1種抗菌肽可以提高神經(jīng)元增殖能力,改善運(yùn)動(dòng)功能障礙和多巴胺神經(jīng)退行性病變[44]。

3.6 止痛類作用

古籍中早有記載,VQ-5和AQ-5是從蚯蚓中提取的2種具有鎮(zhèn)痛和抗炎作用的多肽[48],通過(guò)抑制具有鎮(zhèn)痛和抗炎功能的絲裂原激活蛋白激酶信號(hào)通路,表現(xiàn)出良好的鎮(zhèn)痛作用,是一種新型鎮(zhèn)痛藥物成分。徐杰等[49]研究發(fā)現(xiàn),抗炎消腫藥頸腰康膠囊的有效成分來(lái)源于蚯蚓提取液中的多肽類活性物質(zhì)。包銀萍等[50]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及人體安全性評(píng)價(jià)證明,蚯蚓多肽對(duì)皮膚無(wú)刺激,具有良好的抗炎、抗敏、修復(fù)等功效,可作為安全無(wú)刺激的化妝品原料。

3.7 其它作用

由于蚯蚓多肽的成分復(fù)雜,許多學(xué)者對(duì)蚯蚓多肽的成分及藥理功效進(jìn)行了大量研究[51-55]。除了上述作用外,蚯蚓多肽提取液也可作為一種全方位的特效藥應(yīng)用于臨床試驗(yàn),在胃潰瘍、抗疲勞、預(yù)防高脂、降脂、解熱、抗驚厥等方面都有一定的功效。

4 結(jié)語(yǔ)

我國(guó)蚯蚓資源豐富,利用牛糞、秸稈、污泥等農(nóng)業(yè)廢棄物養(yǎng)殖蚯蚓,具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)保效益。酶解法由于條件溫和且不會(huì)破壞蛋白質(zhì)中的活性多肽和氨基酸結(jié)構(gòu),更有利于蚯蚓活性多肽的提取。針對(duì)不同種類酶,蚯蚓蛋白的最佳酶解工藝還需進(jìn)行具體探索。蚯蚓多肽作為一種新的生物制劑,在神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等方面疾病的治療中發(fā)揮重要作用,地龍注射液、多肽地龍蛋白等多肽類產(chǎn)品已應(yīng)用于臨床。由于蚯蚓多肽的成分較為復(fù)雜,目前針對(duì)不同活性蚯蚓多肽的提取和純化還處在發(fā)展階段,廣泛使用的多肽純化方法主要有層析法、電泳法和膜分離法等,但上述方法僅限于實(shí)驗(yàn)室研究階段,未有成熟的工業(yè)化應(yīng)用。對(duì)于蚯蚓多肽中的活性成分的應(yīng)用也還處于探索階段,多數(shù)活性成分尚未在臨床上驗(yàn)證,因此,蚯蚓多肽具有十分廣闊的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。