土壤微生物環(huán)保修復(fù)技術(shù)的具體應(yīng)用

王 駿，蔣莎莎，余 敏

（1.浙江交科環(huán)境科技有限公司，浙江 杭州 310000；2.溫嶺市環(huán)境綜合整治事務(wù)中心，浙江 臺(tái)州 317500；3.浙江秀水環(huán)保有限公司，浙江 杭州 310000）

0 引言

土壤污染作為一種非常復(fù)雜的環(huán)境問題，其具有隱蔽性、潛伏性、持續(xù)性、廣泛性等特點(diǎn)，如果不對(duì)其進(jìn)行有效治理，將會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的環(huán)境污染后果。隨著我國城市化進(jìn)程的不斷加快，城市垃圾、工業(yè)廢棄物、農(nóng)藥化肥等各種固體廢棄物源源不斷地流入農(nóng)村地區(qū)，在不斷的積累下，這些固體廢棄物已經(jīng)嚴(yán)重污染了土壤環(huán)境[1]。土壤污染已經(jīng)成為了我國農(nóng)村地區(qū)主要的環(huán)境問題之一，也是影響我國農(nóng)業(yè)發(fā)展和農(nóng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展的主要原因之一。近年來，國家也開始高度重視土壤污染問題，并將其作為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的重要組成部分進(jìn)行全面推進(jìn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

實(shí)驗(yàn)土壤：從某石油化工管線輸送公司的工廠場地中采集，經(jīng)過14 d 的陳化后，用30 目（0.613 mm）篩篩選后將其冷凍、干燥處理，并置于4℃的避光室中保存，稱為CK。該土壤為粉砂質(zhì)壤土，其石油烴含量為16 622.89 mg/kg，pH 值為8.37，含水量為1.57%，電導(dǎo)率為154 μS/cm，有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.7%，氧化還原電位為86 mV，陽離子交換容量為0.088 mol/kg，總碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.8%，總氮含量為937 mg/kg，以及總磷含量為720 mg/kg。

用于TPHs 降解的特定細(xì)菌：通過內(nèi)部培養(yǎng)及篩選技術(shù)，獲得一株能在低溫環(huán)境（＜15 ℃）下生長的細(xì)菌株，歸類于霍氏腸桿菌屬，本實(shí)驗(yàn)中標(biāo)記為GZ6。該種細(xì)菌不僅能夠合成生物表面活性物質(zhì)，而且能夠?qū)θ缺椒舆M(jìn)行降解[2]。

實(shí)驗(yàn)試劑包括過硫酸鈉、鐵粉、FeSO4·7H2O、正己烷、丙酮、β-環(huán)糊精。

實(shí)驗(yàn)儀器包括氣相色譜儀、便攜式ORP/DO/pH/EC儀、可見光分光光度計(jì)、氣象色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀等。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用過硫酸鹽氧化（PS 氧化）和過硫酸鹽氧化-微生物（PS 微生物）修復(fù)兩種方案，每種實(shí)驗(yàn)方案均設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。其中，PS 氧化實(shí)驗(yàn)方案對(duì)照組將1.5%的PS、0.071%的鐵粉和0.876%的FeSO4·7H2O（其中百分?jǐn)?shù)分別為對(duì)應(yīng)物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）的溶液混合后加入實(shí)驗(yàn)土壤匯總，土壤和實(shí)驗(yàn)藥劑質(zhì)量比為10∶（8～10），該對(duì)照組記為OX1。實(shí)驗(yàn)組在OX1 的基礎(chǔ)上加入0.357%的β-環(huán)糊精螯合劑，該實(shí)驗(yàn)組記為OX2；PS 微生物實(shí)驗(yàn)方案對(duì)照組與OX1相同，同時(shí)采用土著菌微生物修復(fù)土壤，記為CB。實(shí)驗(yàn)組與OX2 相同，微生物采用GZ6 菌，記為CMB。

在PS 微生物修復(fù)實(shí)驗(yàn)流程中，0～12 d 設(shè)定為PS氧化修復(fù)階段，隨后的13～17 d 為過渡期，此時(shí)土壤完成PS 氧化后接受微生物修復(fù)的準(zhǔn)備，而從18～60 d則為微生物修復(fù)階段。

1.3 分析方法

1.3.1 土壤理化特性分析

對(duì)于土壤中的總石油烴（TPHs）含量，采用HJ 1021—2019 標(biāo)準(zhǔn)的氣相色譜法進(jìn)行定量分析；土壤的電導(dǎo)率（EC）依照HJ802—2016 標(biāo)準(zhǔn)的電極法進(jìn)行測量；為評(píng)估土壤的氧化還原電位（ORP），執(zhí)行HJ 746—2015 標(biāo)準(zhǔn)的電位法；土壤pH 值的測定遵循HJ 962—2018 標(biāo)準(zhǔn)的電位法；使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）檢測土壤微生物修復(fù)階段中分解代謝產(chǎn)物的變化[3]。

1.3.2 土壤酶活性分析

用改良三苯基四唑氯化物還原方法（按三苯基甲胺1 h 內(nèi)在1 g 土壤中的產(chǎn)出率計(jì)算）檢測土壤中的脫氫酶活力；土壤中脂解酶活性的測定采用分光光度測量技術(shù)；同時(shí)，數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)和基因序列的比對(duì)分析則利用SOAP aligner 軟件平臺(tái)進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 土壤中TPHs 及其組分的修復(fù)期變化情況

2.1.1 TPHs 的時(shí)序變化趨勢

圖1 為不同處理時(shí)期污染土壤中石油烴含量變化情況。從圖1 可以看出，經(jīng)過PS 氧化實(shí)驗(yàn)后，PS 微生物實(shí)驗(yàn)土壤中TPHs 含量呈現(xiàn)快速下降趨勢；當(dāng)經(jīng)過12d 的處理后，CB 和CMB 處理的土壤中TPHs 含量從初始的16 521.76 mg/kg 降至7 523.61 mg/kg 和7 848.80 mg/kg，去除率分別達(dá)到了53.9%和52.7%。結(jié)果表明，在PS 氧化實(shí)驗(yàn)的早期階段，β-環(huán)糊精對(duì)于TPHs 降解的促進(jìn)作用并不明顯。可能是由于螯合劑及土壤中的有機(jī)質(zhì)與污染物之間發(fā)生了自由基競爭作用，從而影響了PS 的有效利用率。

圖1 污染土壤中TPHs 含量隨修復(fù)時(shí)間的變化

隨著修復(fù)進(jìn)程的延續(xù)，CB 與CMB 處理策略下的TPHs 水平持續(xù)降低。在處理的第60d，CB 與CMB 方法處理后的土壤TPHs 含量分別降至4 632.61 mg/kg和2 715.76 mg/kg，對(duì)應(yīng)的TPHs 去除效率達(dá)到了72.1%和82.3%。與CB 方案相比，CMB 方案在去除TPHs 方面的效率提升了29.6%，顯著優(yōu)于CB 方案。

CB 方案中采用了鐵離子（Fe2+）激活的氧化微生物修復(fù)策略，而CMB 方案結(jié)合了β-環(huán)糊精螯合鐵離子激活的氧化微生物。通過兩種策略的比較分析，明顯可以看出β-環(huán)糊精通過螯合Fe2+延長了激活劑的作用時(shí)間，并減緩了游離基團(tuán)對(duì)土壤和微生物的負(fù)面影響，從而為微生物修復(fù)創(chuàng)造了有利條件。此外，引入GZ6 功能性微生物不僅為生物修復(fù)和化學(xué)氧化的間隔期提供了降解石油烴的有效菌種，還能通過降低原油的表面張力來增強(qiáng)石油的溶解性和降低黏度，進(jìn)而提升對(duì)TPHs 的降解能力。

2.1.2 TPHs 餾分變化

圖2 為受污染的土壤中，各種TPHs 組份的含量隨時(shí)間變化情況。TPHs 各組份的降解性從大到小分別是C31～C40、C18～C30、C10～C17。

圖2 污染土壤中不同TPHs 餾分含量的變化

從圖2 可以看出，CK 中，C10～C17 餾分的含量為10 986.69 mg/kg，含量最高；C31～C40 餾分的含量為169.29 mg/kg，含量最低；C18～C30 餾分的含量為5 398.01 mg/kg；PS 對(duì)OX1 和OX2 的餾分進(jìn)行了深度氧化后，OX1 中C10～C17 的脫除率達(dá)到了45.1%，OX2 中C10～C17 的脫除率達(dá)到了71.2%。

在實(shí)驗(yàn)期60 d 內(nèi)，CB 實(shí)驗(yàn)方案中C10～C17 餾分的總含量為2 594.05 mg/kg 脫除率為76.1%；C18～C30 的總含量為2 048.30 mg/kg，脫除率為79.1%；C31～C40 的總含量為36.15 mg/kg，脫除率為78.9%；CMB 實(shí)驗(yàn)方案中C10～C17 餾分總含量為1 321.53 mg/kg，脫除率為87.8%；C18～C30 餾分總含量為1 426.55 mg/kg，脫除率為74.1%；C31～C40 餾分為41.29 mg/kg，脫除率為73.1%。

與CB 實(shí)驗(yàn)方案相比，CMB 實(shí)驗(yàn)方案中C10～C17和C18～C30 去除率有較大幅度的提升，提升幅度分別為12%、11.5%，由此可見CMB 實(shí)驗(yàn)方案修復(fù)土壤效果優(yōu)于CB 實(shí)驗(yàn)方案。

通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)TPHs 的分解產(chǎn)物進(jìn)行分析。檢測到的降解產(chǎn)物類別包括長鏈烷烴、烯烴、支鏈烷烴、芳香烴以及環(huán)烷烴等類型，具體化合物涵蓋環(huán)己烷、鄰苯二甲酸酯、苯酚、C15～C20 的長鏈烷烴以及其他支鏈化合物，其中主要以中鏈烷烴為主要成分。長鏈烷烴（C25～C40）因其為固態(tài)疏水性化合物、溶解度較低而難以被生物作用降解；然而，GZ6 菌株能通過分泌生物表面活性劑來增加TPHs 的溶解度，從而提升其降解效率。

2.2 修復(fù)期間土壤化學(xué)性質(zhì)的變化

圖3 為不同處理時(shí)期的土壤pH 值、EC 值和ORP 值的變化情況。從圖3-1 可以看出，在PS 氧化期，CB 和CMB 兩種修復(fù)方案中土壤的pH 值都有較大幅度的下降，在12 d 后，pH 值從最初的8.25 分別下降到7.79 和7.80；在修復(fù)時(shí)間60 d 后，兩種修復(fù)方案下的土壤pH 值分別上升到7.86 和7.90。

圖3 土壤pH、EC、ORP 隨修復(fù)時(shí)間的變化

從圖3-2 可以看出，在PS 氧化期，CB 和CMB 實(shí)驗(yàn)方案的土壤中的EC 都有較大幅度的增長，在12 d修復(fù)期間，EC 由152.4 μS/cm 的最初值分別上升到3 018 μS/cm 和3 101 μS/cm。EC 急劇增加由于在修復(fù)過程中引入的亞鐵活化劑和PS 氧化作用生成了額外的離子，這些離子的增多導(dǎo)致EC 值的顯著提高。隨著修復(fù)治療的持續(xù)，硫酸根（SO42-）和鈣離子（Ca2+）等可能會(huì)以礦物的形式沉淀，同時(shí)部分可溶解的礦物質(zhì)會(huì)被微生物吸收并代謝。當(dāng)修復(fù)時(shí)間達(dá)到60d 的時(shí)候，CB 和CMB 土壤的EC 逐步下降到1 449 μS/cm和1 720 μS/cm。

從圖3-3 可以看出，在PS 氧化期，CB 和CMB 兩種實(shí)驗(yàn)方案的土壤中的ORP 快速升高，在12 d 后，ORP 從最初的86 mV 分別升高到126 mV 和145 mV；在60 d 后，CB 實(shí)驗(yàn)方案的ORP 值達(dá)到162 mV，而CMB 實(shí)驗(yàn)方案的ORP 值則達(dá)到169 mV。CMB 實(shí)驗(yàn)方案的ORP 較CB 有顯著升高，主要是由于GZ6 與土壤降解菌群之間存在著相互協(xié)作關(guān)系，從而增加了TPHs 的生物可利用性，并提高了微生物的總呼吸速率，因此CMB 實(shí)驗(yàn)方案的ORP 值高于CB 實(shí)驗(yàn)方案。

2.3 土壤酶活性變化

圖4 為不同處理時(shí)期，不同處理?xiàng)l件下土壤中的脫氫酶、脂酶活性變化情況。從圖4-1 可以看出，在PS 氧化階段，殘留在土壤中的SO42-、Fe3+、Na+會(huì)干擾細(xì)胞的滲透平衡，導(dǎo)致脫氫酶活性降低。經(jīng)過24 d 的修復(fù)，脫氫酶活性觀測到顯著的峰值，CB 實(shí)驗(yàn)方案的土壤中脫氫酶活性為2.66 μg/g，CMB 實(shí)驗(yàn)方案的土壤中脫氫酶活性為2.94 μg/g。

修復(fù)時(shí)間延長，土壤中可供微生物利用的碳源逐步消耗，與此同時(shí)脫氫酶活性也出現(xiàn)下降趨勢。在土壤中，脂肪酶的活力也呈現(xiàn)出類似于脫氫酶的變化趨勢（如圖4-2 所示）。在48d 的修復(fù)過程中，CB 和CMB實(shí)驗(yàn)方案中的脂肪酶活性最高，分別為195.4 μg/g，218.5 μg/g。結(jié)果表明，在中等或較低的氧化劑濃度下，酶活性被激活，當(dāng)其活性達(dá)到最大值時(shí)，TPHs 降解效率提高。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用過硫酸鹽氧化（PS 氧化）和過硫酸鹽氧化-微生物（PS 微生物）修復(fù)兩種方案，對(duì)土壤理化性質(zhì)和酶活性的分析。

1）CB 和CMB 實(shí)驗(yàn)方案中，TPHs 含量呈現(xiàn)快速下降趨勢；在60d 后，C10～C17 的脫除率達(dá)到了45.1%，OX2 中C10～C17 的脫除率達(dá)到了71.2%。另外，GZ6 功能菌可以增強(qiáng)其對(duì)TPHs 的降解效果。

2）CMB 處理后24 d 及48 d，脫氫酶及脂肪酶的活性達(dá)2.94、218.5 μg/g，與CB 處理后的脫氫酶及脂肪酶的活性2.69、196.5 μg/g 相比，分別增加了0.25、22.8 μg/g。通過預(yù)氧化作用，激活菌株中的脂類及脫氫酶，加速THPs 胞外酯基團(tuán)的裂解，可以增強(qiáng)其溶解性，進(jìn)而加快TPHs 的生物降解。