大黃根腐病與土壤營養(yǎng)及微生物群落組成的相關(guān)性研究

林亞，蔡瑜，胡凡，王佳瑜，江虹霖，周雙雙，張慶偉

1.西南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715；2.重慶市南川區(qū)道地中藥材研究院，重慶 南川 408407；3.重慶灝天生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司，重慶 南川 408407

大黃是一種重要的中藥材,來源于掌葉大黃(RheumpalmatumL.)、唐古特大黃(RheumtanguticumMaxim ex Balf)和藥用大黃(RheumofficinaleBaill.)的干燥根及根莖.大黃在西南地區(qū)的種植范圍包括貴州、四川、重慶等地,其中重慶石柱、奉節(jié)、南川等地大黃種植規(guī)模較大,具有重要的產(chǎn)業(yè)價(jià)值.大黃在種植過程中會發(fā)生多種病害,如輪紋病、炭疽病、霜霉病、根腐病,以及黑粉病等[1-2],其中危害較大的是根腐病.該病主要危害根部,一經(jīng)發(fā)生,危害嚴(yán)重,治理困難[3].染病后根部先腐爛,然后葉片漸漸變黃,直至整株枯死.目前已有研究表明鐮刀菌(Fusarium)、絲核菌(Rhizoctonia)、小核菌(Sclerotium)和鏈格孢(Alternaria)等屬微生物會引起植物根腐病,其中半知菌亞門鐮刀屬菌種所占比例最大.它是最早發(fā)現(xiàn)的根腐病病原菌,具有高度的寄生性,引起根腐病發(fā)生的概率較高,并且致病力也較強(qiáng)[4-5].根腐病病原菌存在于土壤中,土壤理化性質(zhì)與其生長及侵染植物有著直接的關(guān)系[6],同時(shí)土壤微生物種類繁多,數(shù)量龐大,不同類型的微生物之間相互促進(jìn)或相互制約,也是根腐病病原菌繁殖與侵染植物的重要條件.針對影響根腐病病原菌生長繁殖的相關(guān)環(huán)境條件,本研究通過分析不同發(fā)病率大黃生長環(huán)境的理化性質(zhì),并結(jié)合微生物群落分析,探究大黃根腐病發(fā)生與土壤理化性質(zhì)之間的關(guān)系,以期為大黃的種植和根腐病的治理提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域

前期已了解到大黃根腐病在重慶石柱地區(qū)發(fā)生較為普遍,因此選擇有近350 hm2種植規(guī)模的石柱土家族自治縣冷水鎮(zhèn)(108.27°E,29.92°N)多個(gè)大黃種植基地作為調(diào)查點(diǎn).該鎮(zhèn)屬亞熱帶季風(fēng)性濕潤氣候,海拔高度約為1 550 m,年降雨量約1 400 mm,年平均氣溫10.4 ℃.當(dāng)?shù)鼐哂杏凭玫拇簏S種植傳統(tǒng),以農(nóng)業(yè)合作社為單位進(jìn)行大黃的種植和加工,種植技術(shù)和管理方式較為一致.

1.2 土壤樣品采集

2021年9月15日,根據(jù)當(dāng)?shù)胤N植戶提供的初步信息(不同地塊發(fā)病率情況),選取30塊樣地,包括平地(坡度小于 15°)和坡地(在15°～30°之間).結(jié)合大黃根腐病的發(fā)病特征(癥狀主要發(fā)生在根的中上部和根莖部,發(fā)病初期根莖形成淡褐色和黑褐色不規(guī)則形病斑,并有局部腐爛,發(fā)病后期根莖組織全部腐爛,產(chǎn)生黑色膠狀物,并伴隨有葉片焦枯癥狀[1]),進(jìn)行根腐病發(fā)病率(樣地發(fā)病株數(shù)/樣地總株數(shù))的統(tǒng)計(jì).對于癥狀不明確的植株,采集根莖組織帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原菌鑒定后確認(rèn).病原菌鑒定方法主要為使用顯微鏡觀察發(fā)病部位是否有大量的鐮刀菌存在,鐮刀菌形態(tài)鑒定參照相關(guān)文獻(xiàn)[7-8]進(jìn)行.初步計(jì)算樣地根腐病的發(fā)病率后,采用五點(diǎn)取樣法進(jìn)行土壤樣品的采集[9],即以樣地對角線的中點(diǎn)為中心采樣點(diǎn),再從對角線上選擇4個(gè)等距中心點(diǎn)作為采樣點(diǎn).在每個(gè)采樣點(diǎn)先用環(huán)刀取土,然后再從土壤表層下5～20 cm取樣.采集獲得的土樣通過除去雜物并充分均勻后分為兩部分:一部分用于理化指標(biāo)分析,另一部分進(jìn)行冷凍保存以用于后續(xù)的DNA提取以及16S和ITS測序.

1.3 土壤理化性質(zhì)分析

理化性質(zhì)指標(biāo)包括土壤pH值,有機(jī)碳,堿解N,速效K,有效K,緩效K,全N,全K,全P,Cu,Zn,Fe,Mn等元素的質(zhì)量分?jǐn)?shù),具體測定方法參考《土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法》[10]進(jìn)行.取用于測定理化性質(zhì)的土樣,在室內(nèi)自然干燥后進(jìn)行研磨,之后分兩步篩土,第一步將這些土樣通過2 mm土壤篩,過篩后的土樣一部分用于土壤pH值,堿解N,速效K,有效K,緩效K質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定,另一部分將過2 mm土壤篩的土樣再通過0.25 mm土壤篩用于有機(jī)碳,全N,全K,全P,Cu,Zn,Fe,Mn質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定.各指標(biāo)具體測定方法如表1.

表1 土壤理化指標(biāo)的具體測定方法

1.4 土壤生物學(xué)性質(zhì)分析

由北京諾禾致源科技股份有限公司完成對大黃根際土壤DNA的提取、擴(kuò)增和測序.

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

利用 Excel 2019對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理,采用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,具體采用單因素(One-way ANOVA)和Duncan法進(jìn)行方差分析和多重比較(α=0.05),并利用皮爾遜(Pearson)方法對大黃根腐病發(fā)病率與土壤理化性質(zhì)、微生物多樣性之間的相關(guān)性進(jìn)行研究.

2 結(jié)果與分析

2.1 樣地大黃根腐病發(fā)病率

通過實(shí)地調(diào)查統(tǒng)計(jì)結(jié)合采集樣品進(jìn)行病原菌的鑒定,最終計(jì)算出每個(gè)樣地根腐病的發(fā)病率,并根據(jù)發(fā)病率的范圍將樣地分為4種類型,即輕微、輕度、中度和嚴(yán)重(表2).實(shí)際調(diào)查中發(fā)現(xiàn)大黃根腐病發(fā)病率普遍較高,這與種植環(huán)境有直接的關(guān)系.一般坡地發(fā)病率相對較低,低洼地塊發(fā)病率偏高,而重茬地的發(fā)病率最高,部分地塊接近100%.由于是根據(jù)發(fā)病率進(jìn)行樣地選擇,調(diào)查樣地?cái)?shù)量有限,本研究并未分析不同地塊的地形和耕作方式與根腐病發(fā)生之間的關(guān)系.

表2 采樣地概況及發(fā)病率

2.2 不同發(fā)病程度地塊土壤的理化性質(zhì)

2.2.1 土壤pH值與有機(jī)碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異

通過分析發(fā)現(xiàn)所取樣地的大黃種植地塊土壤pH值大都接近中性,不同發(fā)病程度(病害等級)地塊的土壤pH值之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1a).在土壤有機(jī)碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)方面,不同發(fā)病程度地塊之間存在差異,中度發(fā)病程度的地塊土壤有機(jī)碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于其他發(fā)病程度的地塊,且差異達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1b).

小寫字母不同表示p<0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2.2.2 土壤大量元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異

通過分析發(fā)現(xiàn)不同發(fā)病程度地塊土壤樣品中N,P和K相關(guān)指標(biāo)存在差異(圖2).具體表現(xiàn)為:1) 發(fā)病程度為中度的地塊土壤全N和堿解N質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于其他發(fā)病程度地塊土壤,且顯著高于嚴(yán)重發(fā)病地塊土壤; 2) 除中度外,不同發(fā)病程度地塊土壤全P質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但有效P質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異較大,中度發(fā)病程度地塊土壤有效P質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于輕微發(fā)病和輕度發(fā)病地塊土壤,三者都低于嚴(yán)重發(fā)病地塊土壤,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義; 3) 在土壤全K質(zhì)量分?jǐn)?shù)上,輕度和嚴(yán)重發(fā)病地塊土壤低于輕微和中度發(fā)病地塊土壤,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而在速效K和有效K質(zhì)量分?jǐn)?shù)方面,隨著發(fā)病程度的加深,其質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)下降趨勢,且輕微發(fā)病地塊土壤高于嚴(yán)重發(fā)病地塊土壤,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

小寫字母不同表示p<0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2.2.3 土壤微量元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異

為探索土壤微量元素與大黃根腐病發(fā)生的關(guān)系,本研究分析了常見微量元素Fe,Mn,Cu和Zn質(zhì)量分?jǐn)?shù),結(jié)果表明不同發(fā)病程度地塊之間土壤微量元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在一定的差異(圖3).隨著病害程度的加深,土壤Fe質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)下降趨勢,但不同病害程度地塊之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.與之相反,土壤Mn質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)上升趨勢,而且嚴(yán)重發(fā)病地塊高于其余發(fā)病地塊且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.在土壤Cu質(zhì)量分?jǐn)?shù)方面,不同發(fā)病程度地塊之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.此外,不同發(fā)病程度地塊土壤Zn質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間存在差異,中度和嚴(yán)重發(fā)病地塊低于輕微和輕度發(fā)病地塊,其中輕度發(fā)病地塊高于中度發(fā)病地塊,中度發(fā)病地塊高于嚴(yán)重發(fā)病地塊,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

小寫字母不同表示p<0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2.3 發(fā)病程度與土壤營養(yǎng)元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間的相關(guān)性

為從眾多土壤理化指標(biāo)中篩選與大黃根腐病發(fā)生率關(guān)系更為密切的指標(biāo),本研究進(jìn)行了相關(guān)性分析,結(jié)果如表3.由于嚴(yán)重發(fā)病地塊多數(shù)為連作(重茬)地塊,具有特殊性,本研究排除連作地塊后對獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)分析,結(jié)果表明發(fā)病率與土壤速效K,有效K,Fe,Mn和Zn質(zhì)量分?jǐn)?shù)有顯著的相關(guān)性,其中土壤Mn質(zhì)量分?jǐn)?shù)與發(fā)病率呈正相關(guān),其余與發(fā)病率呈負(fù)相關(guān).從相關(guān)系數(shù)和顯著性上來看,土壤速效K,有效K及Zn質(zhì)量分?jǐn)?shù)與發(fā)病率之間相關(guān)系數(shù)較高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明三者與根腐病的發(fā)生更為相關(guān).

表3 大黃根腐病發(fā)病率與土壤理化指標(biāo)之間的相關(guān)性分析結(jié)果

2.4 不同病害等級地塊土壤微生物群落差異

2.4.1 不同病害等級地塊土壤細(xì)菌群落組成

16S和ITS擴(kuò)增子測序結(jié)果表明不同發(fā)病程度地塊土壤細(xì)菌和真菌的群落組成具有一定的差異.圖4顯示,盡管從不同發(fā)病程度地塊土壤樣品中獲得的細(xì)菌和真菌OTU數(shù)量之間沒有明顯差異,但在土壤微生群落組成上,不同發(fā)病程度地塊土壤中細(xì)菌和真菌的群落組成差別較大(圖5).對細(xì)菌而言,在門的分類水平上,不同發(fā)病程度地塊土壤之間存在差異的細(xì)菌群落主要分布在厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和浮霉菌門(Planctomycetes); 而在目的分類水平上,不同發(fā)病程度地塊土壤之間存在差異的細(xì)菌群落主要分布在黃單胞菌目(Xanthomonadales),γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)下的某些種類和噬幾丁質(zhì)菌目(Chitinophagales)等.對于真菌而言,在門的分類水平上,出現(xiàn)差異的真菌主要分布在子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)和被孢霉門(Mortierellomycota); 在目的分類水平上,不同發(fā)病程度地塊土壤之間存在差異的真菌群落主要涉及糞殼菌目(Sordariales),囊絲擔(dān)子菌目(Cystofilobasidiales)、尾囊黑粉菌目(Urocystidales)、格孢腔菌目(Pleosporales)、被孢霉目(Mortierellales)和雞油菌目(Cantharellales).

圖4 不同病害等級地塊土壤細(xì)菌和真菌OTU數(shù)量

uf表示未能具體鑒定到目.

2.4.2 不同病害等級地塊土壤微生物群落豐富度和多樣性指數(shù)

根據(jù)16S和ITS擴(kuò)增子測序結(jié)果,對不同發(fā)病程度地塊土壤樣品中細(xì)菌和真菌群落進(jìn)行豐富度和多樣性分析,結(jié)果表明不同病害等級的大黃根周圍土壤細(xì)菌群落的豐富度指數(shù)(Chao1,ACE)、均勻度指數(shù)(Simpson)以及多樣性指數(shù)(Shannon)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表4).從土壤細(xì)菌群落豐富度來看,病害嚴(yán)重土樣(中度、重度)的細(xì)菌群落最豐富; 從土壤細(xì)菌群落均勻度來看,隨著病害嚴(yán)重性的增加,細(xì)菌群落的均勻度也隨之增加; 從土壤細(xì)菌群落多樣性來看,隨著病害嚴(yán)重性的增加,細(xì)菌群落的多樣性也隨之增加(表4).對于不同發(fā)病地塊土壤的真菌群落而言,除輕微發(fā)病地塊土壤外,其余土壤樣品中,隨著病害程度的增加,真菌群落的豐富度、均勻度以及多樣性都表現(xiàn)出一定的增高趨勢,但不同發(fā)病程度地塊多個(gè)指標(biāo)之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表5).

表4 不同病害等級地塊土壤細(xì)菌群落豐富度、均勻度和多樣性指數(shù)

表5 不同病害等級地塊土壤真菌群落豐富度、均勻度和多樣性指數(shù)

為探究細(xì)菌和真菌群落豐富度及多樣性指數(shù)是否與病害的發(fā)生有關(guān),本研究進(jìn)行了相關(guān)性分析(表6).結(jié)果發(fā)現(xiàn):1) 對于細(xì)菌群落,發(fā)病率與Chao1,ACE以及Simpson之間沒有明顯的相關(guān)性,而與Shannon呈現(xiàn)出顯著正相關(guān); 2) 對于真菌群落,發(fā)病率與Chao1,ACE,Simpson以及Shannon之間都沒有明顯的相關(guān)性.這些結(jié)果表明大黃根腐病的發(fā)生與細(xì)菌群落有一定的相關(guān)性,且隨著大黃根腐病發(fā)病率的增加,細(xì)菌群落的多樣性也隨之增加.

表6 土壤細(xì)菌與真菌群落豐富度和多樣性指數(shù)與發(fā)病率之間的相關(guān)性

2.4.3 不同病害等級地塊土壤微生物優(yōu)勢物種差異

對土壤微生物優(yōu)勢物種(相對豐度排名前20的屬)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)不同病害等級地塊土壤細(xì)菌和真菌的優(yōu)勢物種差異較大(圖6).在細(xì)菌群落方面,發(fā)病程度較輕(輕微、輕度)的地塊土壤中羅河桿菌屬(Rhodanobacter)、伯克霍爾德氏菌科(uf_Burkholderiaceae)某些屬和代爾夫特菌屬(Delftia)豐度較高; 而發(fā)病程度較高(中度、嚴(yán)重)的地塊土壤中γ-變形桿菌綱(uf_Gammaproteobacteria)某些屬、酸桿菌門(uf_Acidobacteria)某些屬、亞硝化單胞菌科(uf_Nitrosomonadaceae)某些屬和溶桿菌屬(Lysobacter)細(xì)菌豐度較高.對于土壤中真菌優(yōu)勢種群,盡管發(fā)病程度不同,但所有樣品都檢測到了潛在能引起根莖腐爛的病原菌屬,即黑粉病菌屬(Thecaphora)、亞隔孢殼屬(Didymella)和鐮刀菌屬(Fusarium),而且它們在發(fā)病程度較高的地塊土壤中豐度相對較高.此外,通過比較可以發(fā)現(xiàn)發(fā)病程度較輕的地塊土壤中腐質(zhì)霉屬(Humicola)、被孢霉屬(Mortierella)等豐度較高,而發(fā)病程度較高的地塊土壤中枝頂孢屬(Acremonium)、四枝孢屬(Tetracladium)和枝鼻菌屬(Cladorrhinum)等屬真菌豐度變化較大.

圖中數(shù)字表示細(xì)菌或真菌的相對豐度(%); uf表示未能具體鑒定到屬.

3 討論

根腐病是一種土傳病害,由生活在土壤中的病原菌引起,在合適的條件下,病原菌侵入根系,造成根腐病的發(fā)生[11].病原菌的生長繁殖與土壤性質(zhì)和土壤微生物組成關(guān)系密切,本研究也發(fā)現(xiàn)根腐病發(fā)病率較高的地塊在多種營養(yǎng)元素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)上與低發(fā)病率地塊有所不同,發(fā)病率較高的土壤樣品pH值相對較低.眾多研究表明土傳病害的發(fā)生與土壤酸堿度有一定關(guān)系,如高鑫媛等[12]發(fā)現(xiàn)患根腐病北蒼術(shù)植株根際土壤的pH值顯著低于健康北蒼術(shù)植株根際土壤.另外,本研究還發(fā)現(xiàn)中度發(fā)病地塊土壤有機(jī)碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于輕微發(fā)病和輕度發(fā)病地塊以及嚴(yán)重發(fā)病地塊,盡管這個(gè)結(jié)果不能說明土壤有機(jī)碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響了大黃根腐病的發(fā)病率,但類似的研究表明土壤有機(jī)碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)與多種根莖類植物根腐病的發(fā)生有著緊密的聯(lián)系,如唐濤等[13]通過對比健康和染病黃連根際土壤養(yǎng)分時(shí)發(fā)現(xiàn)染病植株根際土壤有機(jī)碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于健康植株.

K元素對于植物生長發(fā)育至關(guān)重要,有助于增強(qiáng)植物對于多種病原菌的抗性[14],其中就包括引起根腐病的鐮刀菌[15].本研究發(fā)現(xiàn),發(fā)病率較高的土壤樣品在速效K、有效K等指標(biāo)上顯著低于發(fā)病率較低的土壤樣品,這暗示土壤K元素被植物吸收后在應(yīng)對根腐病相關(guān)病原菌的過程中發(fā)揮了作用.該結(jié)果與趙林艷等[16]針對白及根腐病的相關(guān)研究結(jié)果相一致,即與健康植株相比,白及根腐病患病植株根際土壤有效K質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低.

除此之外,本研究還發(fā)現(xiàn)根腐病發(fā)病率較高的地塊土壤Mn質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于發(fā)病率較低的地塊土壤,與之相反,發(fā)病率較高的地塊土壤Zn質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著低于發(fā)病率較低的地塊土壤.雖然Mn和Zn等微量元素對于植物生長發(fā)育具有重要的作用,但關(guān)于土壤微量元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)與根腐病等植物病害發(fā)生之間的關(guān)系,目前還沒有確切的證據(jù).曾有人提出“Zn,Ni等元素在植物中的超量積累能夠提高植物對于病害的抗性”的假說[17],而且還有一些證據(jù)支持這種假說[18].本研究中發(fā)病率較低地塊土壤中Zn質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對較高,但不等同于植物中的超量積累,所以無法用上述假說去解釋這一現(xiàn)象.

將多種土壤營養(yǎng)指標(biāo)進(jìn)行綜合分析,根腐病發(fā)病程度較高土樣和根腐病發(fā)病程度較低土樣之間在有機(jī)碳、有效K、速效K以及微量元素Mn和Zn質(zhì)量分?jǐn)?shù)上存在差異,而且這些差異的規(guī)律并不一致.這說明大黃根腐病的發(fā)生與多種土壤營養(yǎng)元素之間關(guān)系復(fù)雜,單一的土壤營養(yǎng)指標(biāo)只能在一定程度上影響根腐病的發(fā)生.

土壤微生物在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有舉足輕重的地位,當(dāng)土壤病害發(fā)生時(shí),健株和病株根際土壤中的微生物多樣性和種群之間的動(dòng)態(tài)平衡往往存在較大的差異[19].本研究對不同病害程度地塊土壤微生物的多樣性和豐富度構(gòu)成進(jìn)行對比分析,結(jié)果表明,大黃根際土壤細(xì)菌和真菌群落的Chao1,ACE,Shannon和Simpson在不同病害等級上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明不同病害等級的大黃植株根際土壤細(xì)菌和真菌群落的豐富度、多樣性和均勻度差異不大.利用皮爾遜法對發(fā)病率與細(xì)菌群落多樣性進(jìn)行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)發(fā)病率與細(xì)菌群落多樣性指數(shù)Shannon顯著正相關(guān),表明根際土壤中細(xì)菌群落的多樣性與大黃根腐病的發(fā)生密切相關(guān).這與閆歡等[20]發(fā)現(xiàn)黃芪根腐病的發(fā)病率與土壤細(xì)菌群落呈正相關(guān)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致.關(guān)于根腐病的發(fā)生對于土壤微生物多樣性的影響,目前眾多研究仍沒有形成明確的結(jié)論,例如健康枸杞和北蒼術(shù)根際土壤的真菌群落豐富度、多樣性及均勻度指數(shù)均高于患病株[12,21],而在黃連和黃精相關(guān)的研究中則發(fā)現(xiàn)患病株根際土壤細(xì)菌和真菌豐富度及多樣性都要高于健康植株[13,22].這些都說明雖然普遍認(rèn)為根腐病主要由鐮刀菌屬等真菌引起,但其對于土壤微生物多樣性的影響仍然會因植物種類的不同而有所差別.

通過分析不同發(fā)病程度地塊土壤樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)4種土壤樣品的優(yōu)勢細(xì)菌群落在門水平上相對一致,優(yōu)勢門主要有變形菌門、擬桿菌門,酸桿菌門等,不同發(fā)病程度地塊土壤之間存在差異的細(xì)菌群落主要分布在厚壁菌門、擬桿菌門和浮霉菌門; 而在目的分類水平上,不同發(fā)病程度地塊土壤之間存在差異的細(xì)菌群落主要分布在黃單胞菌目,γ-變形菌綱下的某些種類和噬幾丁質(zhì)菌目等.現(xiàn)有研究表明以黃單胞菌為代表的黃單胞菌目細(xì)菌是一類能夠侵染水稻、小麥、番茄以及十字花科等多種植物的病原細(xì)菌[23],其是否與大黃根腐病的發(fā)生有關(guān),有待深入研究.在屬的水平上,土壤細(xì)菌中相對豐度較高的前5個(gè)屬是羅河桿菌屬、伯克霍爾德氏菌科某些屬、γ-變形桿菌綱下某個(gè)屬、酸桿菌門某些屬和代爾夫特菌屬.染病和重病植株根際土壤中γ-變形桿菌綱下某些屬、酸桿菌門某些屬豐度更高,尤其是γ-變形桿菌綱下某個(gè)屬在染病樣品中普遍富集,說明γ-變形桿菌綱細(xì)菌的大量存在可能是導(dǎo)致大黃根腐病發(fā)生的原因之一.羅河桿菌屬顯著富集于輕微發(fā)病程度地塊土壤樣品中,在中度和嚴(yán)重病害的土壤樣品中豐度較低,表明羅河桿菌屬細(xì)菌可能有抑制根腐病相關(guān)病原菌發(fā)生的作用.Shi等[24]發(fā)現(xiàn)通過施用生物有機(jī)肥使三七根際羅河桿菌屬和其他屬細(xì)菌豐度提高,進(jìn)而提高三七的產(chǎn)量和抗病性.另外,在Zhang等[25]的研究中也發(fā)現(xiàn),施用某些生物試劑可以提高羅河桿菌屬細(xì)菌的豐度,從而抑制導(dǎo)致辣椒根腐病的鐮刀菌的豐度.在發(fā)病程度較輕的地塊土壤中存在豐度較高的某些伯克霍爾德氏菌科的細(xì)菌,其可能也是大黃根腐病發(fā)病率較低的原因之一,因?yàn)橄嚓P(guān)證據(jù)表明在根際環(huán)境中伯克霍爾德氏菌是一類重要的植物促生菌,其群落結(jié)構(gòu)變化能夠影響植物的生長和發(fā)育[26].

對土壤樣品的真菌群落組成進(jìn)行分析可以發(fā)現(xiàn),不同發(fā)病程度地塊土壤中的優(yōu)勢真菌群落差異主要分布在糞殼菌目(Sordariales)、囊絲擔(dān)子菌目(Cystofilobasidiales)、尾囊黑粉菌目(Urocystidales)、格孢腔菌目(Pleosporales)、被孢霉目(Mortierellales)和雞油菌目(Cantharellales)中,而具體到屬,可以發(fā)現(xiàn)黑粉病菌屬、亞隔孢殼屬、鐮刀菌屬和枝頂孢屬等.這些與根腐病關(guān)系更為密切的真菌存在于不同發(fā)病程度的地塊土壤中,而且隨著根腐病發(fā)病程度增加,大多屬豐度也有升高的趨勢.這一現(xiàn)象與本研究進(jìn)行取樣的地區(qū)有關(guān),該地區(qū)存在較長時(shí)間的大黃種植歷史,根腐病相關(guān)的病原菌在土壤中廣泛存在.此外,發(fā)病較輕的地塊土壤中腐質(zhì)霉屬、被孢霉屬豐度較高,而發(fā)病程度較高的地塊土壤中四枝孢屬、枝鼻菌屬等屬真菌豐度較高.相關(guān)研究表明腐質(zhì)霉屬、被孢霉屬真菌是土壤碳及養(yǎng)分轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵微生物成員[27],其是否能夠抑制根腐病相關(guān)病原菌的發(fā)展,目前尚未有清楚的答案.在關(guān)于人參的研究中發(fā)現(xiàn),連作會導(dǎo)致土壤中有益真菌被孢霉屬的豐度降低,而潛在的致病真菌四枝孢屬的豐度上升[28].另外,如上所述多種病原菌都隨著發(fā)病程度的加深而豐度增加,在一定程度上也暗示引起根腐病的病原菌不是一種或者一類微生物.

調(diào)查中發(fā)現(xiàn)多數(shù)發(fā)病嚴(yán)重的地塊屬于連作地塊.連作土壤中往往存在極為嚴(yán)重的土傳病害,且伴隨著植物正常生理活動(dòng)受抑、化感自毒物質(zhì)積累、土壤酸化、養(yǎng)分失衡、微生物群落結(jié)構(gòu)失衡等現(xiàn)象,最終造成植物生長發(fā)育不良[29].連作土壤的pH值變化明顯,如連作后的西洋參土壤pH值顯著降低,致使植株無法存活[30].土壤pH值下降影響土壤的電導(dǎo)率與氧化還原狀態(tài),同時(shí)影響土壤有機(jī)質(zhì)的轉(zhuǎn)化速率,進(jìn)而影響土壤有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)[28].在不同連作土壤中N,P,K養(yǎng)分質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在不同的變化趨勢,例如Liu等[31]研究表明,土壤總N,P,K質(zhì)量分?jǐn)?shù)與有效態(tài)N,P,K質(zhì)量分?jǐn)?shù)均隨連作時(shí)間的延長呈上升趨勢,而部分有效態(tài)養(yǎng)分如有效P,速效K質(zhì)量分?jǐn)?shù)卻隨連作時(shí)間的延長呈現(xiàn)下降的趨勢[32].另外,連作會導(dǎo)致原有根際土壤微生物群落動(dòng)態(tài)平衡受到破壞.如連作3年的西洋參(PanaxquinquefoliusL.)土壤中細(xì)菌群落的多樣性指數(shù)降低,而真菌群落的多樣性指數(shù)則顯著增加[32]; 但在白術(shù)的連作土壤中,真菌群落多樣性表現(xiàn)出相反的變化趨勢[33].在本研究中也發(fā)現(xiàn)連作后根腐病發(fā)病較高的地塊土壤中細(xì)菌和真菌群落豐富度和多樣性指數(shù)偏高.因此連作對于微生物群落多樣性的影響機(jī)制還有待更深入的研究.

4 結(jié)論與展望

4.1 結(jié)論

通過對重慶石柱地區(qū)大黃根腐病的發(fā)生與土壤營養(yǎng)元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)和微生物群落組成之間關(guān)系的研究,綜合分析得出以下結(jié)論:

1) 土壤營養(yǎng)元素中,速效K、有效K質(zhì)量分?jǐn)?shù)與根腐病發(fā)病率之間存在極顯著的相關(guān)性,應(yīng)該是影響根腐病發(fā)生的重要因素; 土壤Mn,Zn,Fe元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)與大黃根腐病的發(fā)生也有一定的相關(guān)性.

2) 通過對比不同病害等級地塊土壤的細(xì)菌組成,發(fā)現(xiàn)在屬水平上,差異細(xì)菌群落主要分布在羅河桿菌屬、伯克霍爾德氏菌科下某些屬等; 其中,較低發(fā)病率土壤樣品中羅河桿菌屬、伯克霍爾德氏菌科下某些屬豐度較高,暗示其有助于抑制根腐病相關(guān)病原菌的發(fā)生.

3) 通過對于土壤真菌群落組成進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)多種致病病原菌(黑粉病菌屬、亞隔孢殼屬、鐮刀菌屬和枝頂孢屬)在不同病害程度地塊土壤中普遍存在,隨著發(fā)病程度增加其豐度變化較大.此外,不同發(fā)病程度地塊土壤中差異細(xì)菌群落主要分布在腐質(zhì)霉屬、被孢霉屬、四枝孢屬和枝鼻菌屬等中,前二者有益于植物的生長發(fā)育,在發(fā)病較輕地塊土壤中豐度較高,而后二者可能與根腐病的發(fā)生關(guān)系密切,在發(fā)病程度較高的地塊土壤中豐度較高.

4) 不同病害程度地塊土壤細(xì)菌和真菌在多樣性和豐富度上存在一定的差異,但差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),大黃根腐病的發(fā)生與反映細(xì)菌群落多樣性指數(shù)的Shannon顯著相關(guān),說明隨著大黃根腐病發(fā)病率增加,細(xì)菌群落的多樣性也隨之增加.

4.2 展望

本研究初步分析了重慶石柱地區(qū)大黃根腐病與土壤理化性質(zhì)和微生物群落的關(guān)系.未來研究可以從以下3方面深入:1) 通過精確實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證土壤理化性質(zhì)與根腐病的關(guān)系; 2) 利用宏基因測序等技術(shù)更詳盡地分析根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu); 3) 關(guān)注病原菌侵害植物和植物抗性的變化,為抗病品種選育提供依據(jù).