乳酸菌協(xié)同發(fā)酵玉米蛋白水解物工藝條件優(yōu)化及其對抗氧化活性影響

叢珊滋，曹雨佳，張欣欣，李冠龍，劉曉蘭 ，胡楠

（1.齊齊哈爾大學 食品與生物工程學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省玉米深加工理論與技術重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

玉米蛋白水解物（corn protein hydrolysates，CPH）是玉米蛋白經(jīng)蛋白酶酶解后得到的低分子量寡肽混合物，其氨基酸種類多，能夠滿足人體日常所需，促進人體健康。玉米蛋白水解物具有多種生物活性，如抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性、抗氧化、解酒護肝、抗疲勞等[1]。然而，在玉米蛋白水解物的制備過程中，存在生物活性釋放程度低、味苦等問題[1-2]，極大地影響了其發(fā)展。

發(fā)酵可以較好地解決玉米蛋白水解物目前加工中存在問題。玉米蛋白水解物通過發(fā)酵可以進一步分解其中的大分子蛋白，增強其生物活性，而且發(fā)酵過程中產(chǎn)生的風味物質(zhì)可中和玉米蛋白水解物原有的苦味，使產(chǎn)品的口感更柔和，容易被消費者接受。隨著人們健康意識的增強，發(fā)酵產(chǎn)品的市場需求也在逐漸擴大，特別是益生菌發(fā)酵產(chǎn)品備受消費者的青睞。益生菌可以定殖于人體內(nèi)，從多方面改善人體健康狀況，如促進營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收、改善胃腸道菌群微環(huán)境、調(diào)節(jié)免疫力、抗氧化、減輕內(nèi)毒素等[3]。乳酸菌是目前常被應用于食品工業(yè)中的益生菌，乳酸菌發(fā)酵可以提高食品的營養(yǎng)價值、抑制有害菌的繁殖[4]，改善原料的風味，如保加利亞乳桿菌可以去除牛奶的生臭味，并產(chǎn)生微弱的香味[5]，增強保藏性。乳酸菌常用的發(fā)酵形式主要是單一菌種發(fā)酵或混合菌種發(fā)酵[6]。與單一菌種發(fā)酵相比，混合菌種發(fā)酵更具優(yōu)勢，一是益生菌活性更高，發(fā)酵效果更好，這是由于微生物之間可以相互利用代謝產(chǎn)物或交換信號分子，從而相互促進生物轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生更好的發(fā)酵效果；二是復合的微生物菌群對外界環(huán)境更具耐受力[7]。在發(fā)酵乳的生產(chǎn)中常用嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌協(xié)同發(fā)酵，菌株之間可以互利共生，在發(fā)酵過程中，可以利用彼此的代謝產(chǎn)物來促進各自的生長[8]。杭鋒等[9]發(fā)現(xiàn)混合乳酸菌間存在協(xié)同作用，互相促進，使得生長繁殖速度顯著增加，并且混合菌種發(fā)酵的產(chǎn)品酸度是單一菌種發(fā)酵的2 倍，同時還延遲了酸化現(xiàn)象?；谌樗峋诎l(fā)酵食品中的優(yōu)點，科研人員對其發(fā)酵蛋白水解物的能力做了相關研究。Oliveira 等[10]發(fā)現(xiàn)酪蛋白酶解物對酸奶中嗜熱鏈球菌的生長具有明顯的促進作用。張根生等[11]研究發(fā)現(xiàn)含金屬硫的蛋白雞蛋水解物有利于動物雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌生長，且混合菌種發(fā)酵增殖效果優(yōu)于單一菌種發(fā)酵。段旭昌等[12]利用乳酸菌發(fā)酵法改良甲魚蛋白酶解液的風味，發(fā)現(xiàn)大部分的苦味氨基酸被轉(zhuǎn)化，使甲魚酶解液的整體風味得到了明顯改善。方磊等[13]利用嗜酸乳桿菌制備發(fā)酵大豆蛋白肽，發(fā)現(xiàn)其能增強小鼠機體的免疫力和抗疲勞能力。目前，國內(nèi)外關于乳酸菌發(fā)酵玉米蛋白水解物的研究報道較少。

本研究利用課題組前期從野生果實表皮上篩選出的鼠李糖乳桿菌YY-15（LactobacillusrhamnoseYY-15）和發(fā)酵乳桿菌YY-16（LactobacillusfermentumYY-16）為發(fā)酵菌株，以玉米蛋白水解物為發(fā)酵原料，通過單因素試驗和響應面試驗優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)，并對發(fā)酵后產(chǎn)品的氨基酸和抗氧化能力進行分析，旨在為玉米蛋白水解物在食品領域的開發(fā)和利用開辟新的途徑。

1 材料與方法

1.1 菌種與樣品

鼠李糖乳桿菌（LactobacillusrhamnoseYY-15，保藏號CGMCC NO.26821）、發(fā)酵乳桿菌（LactobacillusfermentumYY-16，保藏號CGMCC NO.26822）：保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心；玉米蛋白水解物干粉：黑龍江省玉米深加工理論與技術重點實驗室自制。

1.2 主要試劑

MRS 肉湯培養(yǎng)基、MRS 固體培養(yǎng)基：北京索萊寶科技有限公司；果葡糖漿F55（55% 果糖，40% 葡萄糖，5% 低聚糖）：湖北千鳳香食品有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1 - diphenyl - 2 - picrylhydrazyl radical，DPPH）、菲啰嗪：生工生物工程（上海）有限公司；硫酸亞鐵、過氧化氫、水楊酸：天津市科密歐化學試劑有限公司。所用試劑均為分析純。

1.3 儀器與設備

恒溫培養(yǎng)搖床（ZWY-211B）：上海智城分析儀器制造有限公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱（GSP-9270MBE）：上海博迅實業(yè)有限公司；噴霧干燥器（B-290）：瑞士BUCHI公司；超凈臺（SW-CJ-2FD）：蘇凈安泰空氣技術有限公司；全自動高壓滅菌器（XS-500）：日本KAGOSHIMA公司；多功能酶標儀（EnSpire）：珀金埃爾默儀器有限公司；全自動氨基酸分析儀（1-8900）：日本日立公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌種的活化

分別挑取1~2 環(huán)保藏的菌株YY-15 與YY-16 轉(zhuǎn)接于MRS 肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h。分別吸取0.1 mL 菌液至20 mL MRS 肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h，連續(xù)活化2~3 次，作為種子培養(yǎng)液，備用。

1.4.2 試驗工藝流程

CPH 干粉→溶解→添加碳源→滅菌→接菌→發(fā)酵→成品。

操作要點如下。

溶解：將CPH 和去離子水按一定料液比（g/L）進行混合。

滅菌：將CPH 溶液在121 ℃、30 min 條件下進行滅菌處理。

接菌：在無菌環(huán)境中，將活化后的菌株YY-15 與YY-16 按照一定體積比接種到玉米蛋白水解物溶液中，體系中初始活菌數(shù)約為106CFU/mL。

1.4.3 抗氧化活性的測定

抗氧化活性參考劉玥等[14]的方法，測定乳酸菌協(xié)同發(fā)酵玉米蛋白水解物發(fā)酵前后對DPPH 自由基、·OH、·O2-的清除能力和Fe2+螯合能力，并計算IC50值。

1.4.4 總酸的測定

根據(jù)Hu 等[15]的方法進行總酸測定，結果以乳酸計。

1.4.5 乳酸菌活菌數(shù)的測定

根據(jù)Hu 等[16]的方法進行乳酸菌活菌計數(shù)。

1.4.6 氨基酸的測定

采用全自動氨基酸分析儀，利用酸水解法測定氨基酸含量。

1.4.7 感官評價

感官評價小組由10 名食品專業(yè)人員組成，乳酸菌發(fā)酵玉米蛋白水解物的感官評價標準見表1。

表1 乳酸菌發(fā)酵玉米蛋白水解物的感官評價標準Table 1 Sensory evaluation standard of CPH fermented by lactic acid bacteria

1.4.8 單因素試驗

基礎發(fā)酵條件：菌株YY-15 與YY-16 體積比3∶1，玉米蛋白水解物濃度20%（質(zhì)量體積比），接種量4%（體積分數(shù)），果葡糖漿添加量4%（體積分數(shù)），發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵時間24 h。

以乳酸菌發(fā)酵玉米蛋白水解物中的活菌數(shù)、總酸含量（以乳酸計）、感官評分以及DPPH 自由基清除能力（蛋白濃度1 mg/mL）為指標，分別對菌種體積比（1∶0、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、0∶1）、接種量（1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%）、果葡糖漿添加量（1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%）、發(fā)酵時間（16、20、24、28、32、36、40、44、48 h）、發(fā)酵溫度（35、37、39、41、43 ℃）和CPH 濃度（10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%）進行單因素試驗。

1.4.9 響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，選取發(fā)酵溫度、接種量、CPH 濃度和果葡糖漿添加量為自變量，以乳酸菌協(xié)同發(fā)酵玉米蛋白水解物對DPPH 自由基清除能力為響應值，設計四因素三水平的響應面試驗。響應面試驗設計因素與水平見表2。

表2 響應面試驗設計因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface test design

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用Design-Expert version 8.0.6 軟件進行Box-Behnken 試驗設計。使用Office 2021 對數(shù)據(jù)及圖片進行處理，SPSS Statistics 20.0 對結果進行單因素方差分析（ANOVA），當P<0.05 時表明數(shù)據(jù)間存在顯著差異。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌協(xié)同發(fā)酵玉米蛋白水解物單因素試驗

2.1.1 菌種體積比對乳酸菌協(xié)同發(fā)酵玉米蛋白水解物的影響

在CPH 濃度20%、果葡糖漿添加量4%、接種量4%、發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時間24 h 的發(fā)酵條件下，研究菌株YY-15 和YY-16 不同體積比對乳酸菌協(xié)同發(fā)酵玉米蛋白水解物影響，結果如圖1 所示。

圖1 菌種體積比對乳酸菌發(fā)酵玉米蛋白水解物的影響Fig.1 Effect of strain ratio on CPH fermented by lactic acid bacteria

鼠李糖乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌是食品發(fā)酵中常用的菌株，也是具有較強益生性和穩(wěn)定遺傳性的益生菌[17]。在發(fā)酵食品中，乳酸菌表現(xiàn)出其重要發(fā)酵特性和生理功能的前提是完成菌體的大量增殖。因此，在乳酸菌協(xié)同發(fā)酵玉米蛋白水解物過程中，需將乳酸菌活菌數(shù)作為重要考察指標。

由圖1 可以看出，各試驗組在發(fā)酵24 h 后乳酸菌活菌數(shù)均能達到108CFU/mL 以上，表明菌株YY-15和YY-16 能夠較快適應玉米蛋白水解物的發(fā)酵環(huán)境，從而快速完成菌體增殖。與單一菌種發(fā)酵相比，混合菌種發(fā)酵中的乳酸菌活菌數(shù)均顯著提高（P<0.05）。當菌株YY-15 與YY-16 體積比為3∶1 時，發(fā)酵后乳酸菌活菌數(shù)達到最大值，為2.4×109CFU/mL，是菌株YY-15、YY-16 單一菌種發(fā)酵的3.73 倍和9.49 倍，可見，菌株YY-15 和YY-16 具有一定的共生性，可以相互促進生長?；旌暇N發(fā)酵可以有效提高發(fā)酵液中水解酶的含量，并且彌補了單一菌種發(fā)酵產(chǎn)生胞外酶系不全面的缺點，對發(fā)酵基質(zhì)營養(yǎng)轉(zhuǎn)化效率更高，提高發(fā)酵效率[18]。

本研究中鼠李糖乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌具有相似的生長條件，其均能利用相似的底物進行發(fā)酵。尹彥洋等[19]研究了鼠李糖乳桿菌和嗜酸乳桿菌的共生關系，發(fā)現(xiàn)兩株菌具有相似的生長條件，均能利用單糖進行發(fā)酵。鼠李糖乳桿菌的終端產(chǎn)物乳酸可以縮短嗜酸乳桿菌的發(fā)酵時間，嗜酸乳桿菌可降解蛋白質(zhì)產(chǎn)生多種氨基酸，為鼠李糖乳桿菌提供氮源，說明二者具有良好的共生發(fā)酵能力。但是目前對于鼠李糖乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌的相互作用機制報道較少。

鼠李糖乳桿菌屬于同型乳酸發(fā)酵菌株，其終產(chǎn)物大部分為L-乳酸，發(fā)酵乳桿菌是專性異型乳酸發(fā)酵菌株，代謝產(chǎn)物較為豐富，除乳酸外，還產(chǎn)生乙醇、乙酸和二氧化碳等其他物質(zhì)[20]。Driehuis 等[21]最早將同型乳酸發(fā)酵和異型乳酸發(fā)酵兩類菌株結合使用，結果發(fā)現(xiàn)混合菌種發(fā)酵相比于布氏乳桿菌單獨發(fā)酵的乳酸含量明顯增加。本研究中，當菌株YY-15 與YY-16 體積比為3∶1 時，發(fā)酵24 h 后乳酸菌活菌數(shù)和總酸含量均達到最大值，顯著高于兩株菌單獨發(fā)酵的總酸含量（P<0.05），與Driehuis 等[21]報道結果一致。使用兩種類型的乳酸菌混合發(fā)酵，可以使其優(yōu)勢結合，同型乳酸發(fā)酵菌可以控制前期發(fā)酵，抑制雜菌生長；專性異型乳酸發(fā)酵菌在發(fā)酵后期會產(chǎn)生更多的風味物質(zhì)，賦予產(chǎn)品獨特的風味[22]，在感官評價結果中也驗證了這一說法，并且當菌株YY-15 與YY-16 體積比為3∶1 時，感官評分最高，為81.00。當菌種體積比為1∶1~1∶3 時，乳酸菌活菌數(shù)和總酸含量隨YY-16 添加量的增加而降低，這可能是由于YY-16 添加量過多，形成了優(yōu)勢菌群，抑制YY-15 的生長，兩株菌的共生平衡被打破。綜合考慮，選擇鼠李糖乳桿菌YY-15 和發(fā)酵乳桿菌YY-16 菌種體積比為3∶1 進行后續(xù)的發(fā)酵試驗。

2.1.2 接種量對乳酸菌協(xié)同發(fā)酵玉米蛋白水解物的影響

在菌株YY-15 與YY-16 體積比為3∶1、CPH 濃度20%、果葡糖漿添加量4%、發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時間24 h 的發(fā)酵條件下，研究不同接種量對乳酸菌協(xié)同發(fā)酵玉米蛋白水解物的影響，結果如圖2 所示。

圖2 接種量對乳酸菌發(fā)酵玉米蛋白水解物的影響Fig.2 Effect of inoculation amount on CPH fermented by lactic acid bacteria

由圖2 可知，隨著接種量的增加，乳酸菌活菌數(shù)和DPPH 自由基清除能力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。原因可能是接種量過低，乳酸菌產(chǎn)生胞外酶分解底物的速率不能滿足乳酸菌大量增殖的需求；或是接種量過高，鼠李糖乳酸菌生長代謝旺盛，產(chǎn)生大量的乳酸，使發(fā)酵液pH 值迅速降低，抑制發(fā)酵乳酸菌的生長，延長發(fā)酵時間，最終導致乳酸菌活菌數(shù)和DPPH 自由基清除能力降低。當接種量為4% 時，乳酸菌發(fā)酵玉米蛋白水解物的乳酸菌活菌數(shù)達到最大值，為1.15×109CFU/mL，同時，DPPH 自由基清除能力和感官評分也達到最大，與陳瑩艷[23]的研究結果相似?？偹岷侩S接種量的增加呈先持續(xù)升高后趨于平緩的趨勢，當接種量大于5%后總酸含量略有下降，各組間無顯著性差異（P>0.05）。結合感官評分結果可知，總酸積累不足，發(fā)酵產(chǎn)品的口感寡淡，風味不明顯，難以掩蓋CPH 的苦味；總酸含量過高，亦會使發(fā)酵酸味過濃，影響其他風味，導致感官品質(zhì)下降。綜合判斷，選取接種量3%、4%、5% 進行后續(xù)響應面優(yōu)化試驗。

2.1.3 果葡糖漿添加量對乳酸菌協(xié)同發(fā)酵玉米蛋白水解物的影響

在菌株YY-15 與YY-16 體積比3∶1、CPH 濃度20%、接種量4%、發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時間24 h 的發(fā)酵條件下，研究不同果葡糖漿添加量對乳酸菌協(xié)同發(fā)酵玉米蛋白水解物的影響，結果如圖3 所示。

圖3 果葡糖漿添加量對乳酸菌發(fā)酵玉米蛋白水解物的影響Fig.3 Effect of fructose syrup addition on CPH fermented by lactic acid bacteria

微生物生長過程中，既需碳源作為活動能量，又要氮源構成自己的細胞結構。玉米蛋白水解物中可溶性肽含量高，可以滿足發(fā)酵氮源的需要。本研究中玉米蛋白水解物由于進行了去淀粉的處理，因此碳源含量較低，為保證發(fā)酵順利進行，需要補充碳源。果葡糖漿是一種發(fā)酵行業(yè)常用的碳源補充劑，由于其中含有不同比例的果糖、葡萄糖和低聚糖，將其應用于發(fā)酵食品中不僅可以補充碳源，還可以改善產(chǎn)品的口感和功能性。

由圖3 可以看出，隨著果葡糖漿添加量的增加，總酸含量和乳酸菌活菌數(shù)呈先上升后下降趨勢，均在果葡糖漿添加量為5% 時達到最高值。果葡糖漿添加量過少，乳酸菌生長所需能量不足，致使增殖能力下降，產(chǎn)酸過少，風味不足；果葡糖漿的滲透壓高于雙糖，添加過多則會導致細菌的細胞壁破裂，同時也會使酸甜比失調(diào)，口感過于甜膩。當果葡糖漿添加量為4%~6%時，乳酸菌發(fā)酵玉米蛋白水解物的酸甜適中，質(zhì)地均勻，無分層和沉淀，感官評分較高。DPPH 自由基清除能力的變化規(guī)律與乳酸菌活菌數(shù)呈正相關，原因可能是由于乳酸菌自身具有一定的抗氧化能力，乳酸菌的數(shù)量增加，從而增強了發(fā)酵液的抗氧化能力；或是由于乳酸菌數(shù)量增加，發(fā)酵液中的蛋白酶含量增加，使發(fā)酵底物水解速度加快，更多的寡肽游離出來，增強了發(fā)酵液的抗氧化能力。由圖3 可知，果葡糖漿添加量對DPPH 自由基清除能力的影響較小，但具有顯著性差異。綜合考慮，選取果葡糖漿添加量為4%、5%、6% 進行后續(xù)優(yōu)化試驗。

2.1.4 發(fā)酵溫度對乳酸菌協(xié)同發(fā)酵玉米蛋白水解物的影響

在菌株YY-15 與YY-16 體積比為3∶1、CPH 濃度20%、接種量4%、果葡糖漿添加量5%、發(fā)酵時間24 h的發(fā)酵條件下，研究不同發(fā)酵溫度對乳酸菌協(xié)同發(fā)酵玉米蛋白水解物的影響，結果如圖4 所示。

圖4 發(fā)酵溫度對乳酸菌發(fā)酵玉米蛋白水解物的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on CPH fermented by lactic acid bacteria

發(fā)酵溫度偏高或偏低都會導致細胞生長代謝速率下降，影響發(fā)酵速度和產(chǎn)酸能力，不利于乳酸菌的生長[24]。由圖4 可以看出，發(fā)酵溫度對乳酸菌活菌數(shù)的影響較大，當發(fā)酵溫度為35~39 ℃時，隨著發(fā)酵溫度的升高，乳酸菌活菌數(shù)顯著上升，并在發(fā)酵溫度為39 ℃時乳酸菌活菌數(shù)達到最大值，為9.8×108CFU/mL，繼續(xù)升高發(fā)酵溫度時，乳酸菌活菌數(shù)開始下降；總酸含量、DPPH 自由基清除能力與乳酸菌活菌數(shù)的變化規(guī)律相似。感官評分方面，除35 ℃和43 ℃時的感官評分較低外，發(fā)酵溫度在37~41℃范圍內(nèi)的感官評分差異不顯著（P>0.05）。發(fā)酵乳桿菌可在45 ℃以內(nèi)的發(fā)酵溫度下生長，其最適生長溫度為41~42 ℃，而鼠李糖乳桿菌的最適生長溫度為37 ℃，發(fā)酵溫度過高時細胞內(nèi)酶的催化能力會大大降低，甚至會導致其喪失催化活性，從而影響菌株的正常生長[25]。綜合考慮，選取發(fā)酵溫度為37、39、41 ℃進行后續(xù)響應面優(yōu)化試驗。

2.1.5 CPH 濃度對乳酸菌協(xié)同發(fā)酵玉米蛋白水解物的影響

在菌株YY-15 與YY-16 體積比為3∶1、接種量4%、果葡糖漿添加量5%、發(fā)酵溫度39 ℃、發(fā)酵時間24 h 的發(fā)酵條件下，研究不同CPH 濃度對乳酸菌協(xié)同發(fā)酵玉米蛋白水解物的影響，結果如圖5 所示。

圖5 CPH 濃度對乳酸菌發(fā)酵玉米蛋白水解物的影響Fig.5 Effect of CPH concentration on CPH fermented by lactic acid bacteria

在發(fā)酵體系中，底物的濃度直接影響乳酸菌的發(fā)酵能力。與大分子蛋白相比，CPH 是經(jīng)酶解后得到的小分子肽類和氨基酸的混合物，可以直接被乳酸菌利用，提高發(fā)酵效率。由圖5 可以看出，當CPH 濃度為20% 時，乳酸菌活菌數(shù)、感官評分、DPPH 自由基清除能力及總酸含量均達到最大值。且隨著CPH 濃度逐漸增大，各指標均呈現(xiàn)下降趨勢，這可能是由于過量的CPH 使菌體細胞內(nèi)外滲透壓升高，致使菌體破裂，從而使乳酸菌活菌數(shù)減少。同時，反應體系的黏度增大，整體流動性降低，CPH 與乳酸菌的接觸面積變小，物質(zhì)傳遞速率下降，降低代謝速率，也會導致DPPH 自由基清除能力、乳酸菌活菌數(shù)和總酸含量的下降?？梢?，適當濃度的CPH 具有促進乳酸菌生長的作用。目前，關于蛋白水解物促進乳酸菌生長可能的機制主要有：1）蛋白水解物作為氮源為益生菌的生長提供必需的氨基酸[26]。2）蛋白水解物可作為益生菌多肽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的促進劑，即蛋白質(zhì)分子進入益生菌細胞前，先由胞外蛋白酶將其水解成短的多肽片段，才能被發(fā)酵菌株吸收利用[27]。3）蛋白水解物可以提高發(fā)酵菌株在酸性環(huán)境中的耐受力，保持菌體數(shù)量[28]。但不同的蛋白水解物對菌株生長的促進作用不同，潘芬等[18]研究發(fā)現(xiàn)，豌豆蛋白水解物對鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌未表現(xiàn)出促生長作用，而對保加利亞乳桿菌和雙歧桿菌等有明顯的促生長作用。玉米蛋白水解物不僅對發(fā)酵菌株有一定影響，對發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)影響也較大。在較高的CPH 濃度下，發(fā)酵液顏色較深，極大地影響了產(chǎn)品的感官品質(zhì)。綜合考慮，選取CPH 濃度為10%、20%、30% 進行后續(xù)響應面優(yōu)化試驗。

2.1.6 發(fā)酵時間對乳酸菌協(xié)同發(fā)酵玉米蛋白水解物的影響

在菌株YY-15 與YY-16 體積比為3∶1、CPH 濃度20%、接種量4%、果葡糖漿添加量5%、發(fā)酵溫度39 ℃的發(fā)酵條件下，研究發(fā)酵時間對乳酸菌發(fā)酵玉米蛋白水解物的影響，結果如圖6 所示。

圖6 發(fā)酵時間對乳酸菌發(fā)酵玉米蛋白水解物的影響Fig.6 Effect of fermentation time on CPH fermented by lactic acid bacteria

發(fā)酵時間可以反映乳酸菌發(fā)酵的完全程度。發(fā)酵時間過短，導致發(fā)酵不充分，產(chǎn)品的風味不足；發(fā)酵時間過長，乳酸菌大量死亡，乳酸不斷累積，使產(chǎn)品口感刺激、品質(zhì)下降[27]。由圖6 可以看出，在發(fā)酵過程中，乳酸菌在CPH 中長勢良好。乳酸菌活菌數(shù)在發(fā)酵48 h內(nèi)，呈不斷上升的趨勢，總酸含量與乳酸菌活菌數(shù)表現(xiàn)出一致的變化趨勢。而DPPH 自由基清除能力則在發(fā)酵24 h 時達到最大值，為75.73%，之后一直呈下降趨勢。結合感官評分結果綜合考慮，選擇發(fā)酵時間24 h進行后續(xù)試驗。

2.2 乳酸菌協(xié)同發(fā)酵玉米蛋白水解物響應面優(yōu)化試驗結果

在單因素試驗結果的基礎上，以DPPH 自由基清除能力（Y）為響應值，進行四因素三水平的響應面試驗，結果見表3，方差分析見表4。

表3 乳酸菌發(fā)酵玉米蛋白水解物的響應面試驗結果Table 3 Response surface test results of CPH fermented by lactic acid bacteria

表4 回歸響應面模型方差分析Table 4 Variance analysis for regression response surface model

應用Design-Expert version 8.0.6 軟件對表3 數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到的二次多項回歸方程為Y=79.64+0.25X1+0.23X2+0.22X3+0.31X4-0.13X1X2+0.098X1X3+0.83X1X4-0.32X2X3-2.5×105X2X4-0.089X3X4-1.13X12-2.16X22-2.26X32-1.34X42。

由表4 可以看出，該方程的相關系數(shù)R2為0.905 5，說明模型擬合程度良好，可用于分析和預測。模型的F值為9.58，P<0.01，極顯著；失擬項P=0.151 0>0.05，不顯著；調(diào)整復相關系數(shù)R2Adj=0.810 9，說明該模型的回歸方程能夠反映實際情況，可以用回歸方程對試驗結果進行分析和預測。一次項X1（發(fā)酵溫度）、X2（接種量）、X3（CPH 濃度）和X4（果葡糖漿添加量）影響不顯著；二次項X12、X22、X32、X42均處于極顯著水平，說明其對響應值的影響較大；交互項X1X4處于顯著水平，說明發(fā)酵溫度和果葡糖漿添加量之間存在交互作用，且對DPPH 自由基清除能力的影響較大。

經(jīng)Design-Expert version 8.0.6 軟件工藝優(yōu)化，最優(yōu)發(fā)酵工藝參數(shù)為發(fā)酵溫度39.34 ℃、接種量4.04%、CPH濃度20.45%、果葡糖漿添加量5.16%，模型預測此條件下的DPPH 自由基清除能力可達79.69%。結合實際情況，將優(yōu)化后的方案適當調(diào)整為發(fā)酵溫度39.5 ℃、接種量4%、CPH 濃度20.50%、果葡糖漿添加量5%，在此條件下進行驗證試驗，3 次驗證試驗得到的DPPH自由基清除能力為80.89%，總酸含量為55.65 g/L，乳酸菌活菌數(shù)為2.66×109CFU/mL，感官評分為89.5，與預測值較為接近，說明模型預測準確度較高，利用響應面分析優(yōu)化乳酸菌發(fā)酵工藝是可行的。

2.3 乳酸菌協(xié)同發(fā)酵玉米蛋白水解物對氨基酸種類及其含量的影響

氨基酸種類及其含量與成品的風味、營養(yǎng)和感官品質(zhì)相關。乳酸菌協(xié)同發(fā)酵玉米蛋白水解物發(fā)酵前后的氨基酸含量結果如表5 所示。

表5 乳酸菌發(fā)酵玉米蛋白水解物的氨基酸含量Table 5 Amino acid content of CPH fermented by lactic acid bacteria

由表5 可以看出，乳酸菌協(xié)同發(fā)酵玉米蛋白水解物發(fā)酵前后均檢測到16 種氨基酸，其中發(fā)酵前的總氨基酸含量為76.48 g/100 g，發(fā)酵后的總氨基酸含量為58.00 g/100 g，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后總氨基酸含量下降了24.16%。大部分乳酸菌具有多種氨基酸營養(yǎng)缺陷性，在發(fā)酵過程中，乳酸菌分泌的胞外蛋白酶會水解原料中的蛋白質(zhì)和多肽，產(chǎn)生氨基酸，滿足乳酸菌的生長代謝，保障發(fā)酵的順利進行[28]。蘇能能等[29]利用植物乳桿菌發(fā)酵桑葚漿，其游離氨基酸總量下降了78.30%。但雙歧桿菌發(fā)酵的果汁中，與發(fā)酵前相比，各游離氨基酸含量均有提升[30]，可見游離氨基酸的代謝規(guī)律與菌種有著密切的關系。總氨基酸含量的減少還與揮發(fā)性成分有關。氨基酸可進一步通過轉(zhuǎn)氨、脫羧、裂解等轉(zhuǎn)化為醛類、醇類等風味物質(zhì)[31]。根據(jù)乳酸菌的代謝作用，氨基酸可以形成發(fā)酵產(chǎn)品的風味前體物質(zhì)，從而賦予發(fā)酵液特殊的發(fā)酵香味。李汴生等[32]研究發(fā)現(xiàn)，5 種果蔬汁經(jīng)發(fā)酵后游離氨基酸總量減少，揮發(fā)性風味物質(zhì)種類及醇酯類物質(zhì)含量增加，說明在發(fā)酵過程中發(fā)生了氨基酸降解，這也是產(chǎn)生風味物質(zhì)的重要途徑。

2.4 體外抗氧化能力結果分析

氧化作用是自然界普遍發(fā)生的化學反應，在生物體中起著重要作用。生命活動的氧化代謝過程伴隨著自由基的產(chǎn)生，如羥自由基、超氧陰離子自由基等。雖然人體有抗氧化防御系統(tǒng)，但這些系統(tǒng)并不能完全有效地抵御或修復氧化損傷，如果不及時清除自由基，則會對機體造成傷害，引發(fā)疾病[33]。因此，具有高抗氧化活性的食品受到人們的高度重視，體外抗氧化能力的測定已成為評價功能食品的重要指標之一。乳酸菌發(fā)酵玉米蛋白水解物的體外抗氧化活性見表6。

表6 乳酸菌發(fā)酵玉米蛋白水解物的體外抗氧化活性Table 6 Antioxidant activity of CPH fermented by lactic acid bacteria in vitro

如表6 所示，乳酸菌發(fā)酵玉米蛋白水解物發(fā)酵前后均能夠有效清除DPPH 自由基、·OH、·O2-和提高Fe2+螯合能力。發(fā)酵前玉米蛋白水解物的DPPH 自由基清除能力、·OH 清除能力、·O2-清除能力、Fe2+螯合能力的IC50值分別為0.460、0.306、13.728、3.165 mg/mL；發(fā)酵后的DPPH 自由基清除能力、·OH 清除能力、·O2-清除能力、Fe2+螯合能力的IC50值分別為0.227、0.200、12.851、1.856 mg/mL。 與發(fā)酵前相比，分別提高了50.65%、34.64%、6.41%、41.36%，說明玉米蛋白水解物經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵相較于發(fā)酵前具有更好的抗氧化活性。

崔寧等[34]研究表明，玉米蛋白水解物是良好的供氫體，也是Fe2+螯合劑，能通過抑制芬頓（Fenton）反應而減少羥基的生成，提高對自由基的清除能力，從而消除自由基對機體造成的氧化損傷。乳酸菌在細胞呼吸過程和生存環(huán)境中會產(chǎn)生過多的活性氧，而乳酸菌抵抗氧脅迫的能力較弱。過量的活性氧和自由基會攻擊蛋白質(zhì)、脂肪和核酸，從而加速微生物的衰老和死亡[35]。玉米蛋白水解物具有較強的抗氧化能力和自由基清除能力，可以幫助乳酸菌在發(fā)酵過程中抵抗氧脅迫，為其提供良好的生長環(huán)境，結果表明，玉米蛋白水解物有利于乳酸菌的生長代謝。

乳酸菌通過螯合Fe2+來阻止脂質(zhì)過氧化生成·OH，從而降低脂質(zhì)化合物氧化的速度。Li 等[36]對瑞士乳桿菌的胞外多糖探究，發(fā)現(xiàn)其表現(xiàn)出較強的Fe2+螯合能力，IC50值可達1.45 mg/mL。乳酸菌發(fā)酵玉米蛋白水解物具有良好的金屬螯合能力，可以減少·OH 的產(chǎn)生，抑制過氧化物的產(chǎn)生。同時，乳酸菌發(fā)酵玉米蛋白水解物經(jīng)過發(fā)酵后暴露出能提供電子的氨基酸和小肽，這些小分子化合物更容易與自由基結合，隨著具有抗氧化活性的小分子肽濃度的增加，與自由基結合的機會變大，因此乳酸菌發(fā)酵玉米蛋白水解物對自由基的清除能力逐漸提高。乳酸菌在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）來清除·OH 和H2O2，而SOD 能直接降低活性氧自由基的毒性，并阻止活性氧自由基向·OH轉(zhuǎn)變[37]。劉洋等[38]對發(fā)酵乳桿菌、乳酸乳球菌、嗜酸乳桿菌和瑞士乳桿菌4 株乳酸菌的體外抗氧化能力測定發(fā)現(xiàn)，乳酸菌清除·OH 的活性物質(zhì)主要存在于菌體細胞表面以及代謝產(chǎn)物中而非胞內(nèi)。除此之外，乳酸菌可以分泌阿魏酸酯酶（ferulic acid esterase，F(xiàn)AE），它能夠促進植物細胞壁中阿魏酸（ferulic acid，F(xiàn)A）的生成，F(xiàn)A 是一種強抗氧化劑[39]。總之，乳酸菌發(fā)酵玉米蛋白水解物抗氧化能力提升的原因是多種抗氧化物質(zhì)的綜合作用。

3 結論

本研究利用鼠李糖乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌協(xié)同發(fā)酵玉米蛋白水解物，通過單因素和響應面試驗優(yōu)化其發(fā)酵工藝，得到最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為YY-15∶YY-16=3∶1（體積比），CPH 濃度20.50%，接種量4%，果葡糖漿添加量5%，發(fā)酵溫度39.5 ℃，發(fā)酵時間24 h，在此條件下，乳酸菌發(fā)酵玉米蛋白水解物的DPPH 自由基清除能力為80.89%，總酸含量為55.65 g/L，乳酸菌活菌數(shù)為2.66×109CFU/mL，感官評分為89.5。在發(fā)酵過程中，玉米蛋白水解物能為乳酸菌提供低氧脅迫環(huán)境，有利于乳酸菌的生長。并且鼠李糖乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌混合發(fā)酵可以相互促進，菌體增殖效果優(yōu)于單一菌株發(fā)酵。乳酸菌發(fā)酵可明顯提升玉米蛋白水解物的抗氧化能力，并可以促進氨基酸的轉(zhuǎn)化，降低苦味氨基酸的含量，增強了產(chǎn)品的功能性和品質(zhì)。