超聲波和堿性蛋白酶處理對克氏原螯蝦脫殼及蝦仁品質(zhì)的影響

張喜才，張新林，黃業(yè)傳，陳清嬋

（1.荊楚理工學院 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所，湖北 荊門 448000；2.荊楚理工學院 生物工程學院，湖北 荊門 448000；3.荊門（中國農(nóng)谷）農(nóng)業(yè)科學研究院，湖北 荊門 448000）

克氏原螯蝦俗稱小龍蝦，其蛋白質(zhì)含量高、營養(yǎng)豐富全面，深受廣大消費者的歡迎，市場價值達千億規(guī)模，而湖北是小龍蝦的重要產(chǎn)地，2021 年全省小龍蝦的養(yǎng)殖面積達597 733.3 公頃，產(chǎn)量約占到了全國的一半[1-2]。小龍蝦的加工品以速凍蝦仁為主，但是小龍蝦蝦殼較為堅硬，蝦肉與蝦殼緊密相連，導(dǎo)致脫殼十分困難，小龍蝦的工廠加工仍然以工人手工操作為主，生產(chǎn)效率低，勞動強度大[3]，國內(nèi)目前采用的工藝是將小龍蝦進行蒸煮熱燙，然后常溫水和冷卻水冷卻處理、脫殼，但是這種方法存在蝦仁營養(yǎng)流失、品質(zhì)不夠新鮮、產(chǎn)品得率較低的問題，超高壓處理可以一定程度上提高脫殼效率和蝦仁品質(zhì)，但是設(shè)備成本和操作費用昂貴[4]，因此小龍蝦如何高效、經(jīng)濟脫殼成為了工廠化加工的技術(shù)瓶頸。

蝦類腹部結(jié)構(gòu)分為三部分，由內(nèi)到外分別為肌肉（蝦仁）、表皮和外殼，表皮與肌肉通過廣泛交叉的連接組織牢固地結(jié)合，有研究表明連接結(jié)構(gòu)的結(jié)締組織主要是由膠原蛋白組成，所以脫殼的關(guān)鍵點在于破壞此結(jié)構(gòu)的膠原蛋白，從而使其連接部位松動[4]。研究表明蝦類體內(nèi)的內(nèi)源酶和來自微生物的外源性蛋白酶可以促進殼肉分離，內(nèi)切蛋白酶能夠顯著促進北極甜蝦的脫殼[5]。堿性蛋白酶是食品行業(yè)應(yīng)用廣泛的內(nèi)切蛋白酶，能夠降解表皮和真皮的連接蛋白[6-7]，對于膠原蛋白具有良好的水解效應(yīng)[5]。超聲波是指頻率高于人類聽覺范圍（>20 kHz）的聲波，應(yīng)用于食品加工可以產(chǎn)生空化效應(yīng)、熱效應(yīng)和機械效應(yīng)，空化是一種氣泡形成、生長和破裂的現(xiàn)象，空化氣泡的破裂會產(chǎn)生沖擊波、微射流、湍流和剪切力等物理效應(yīng)[8]，據(jù)報道超聲波處理可以促進番茄的去皮，改善番茄的去皮效果[9]。相關(guān)研究表明，超聲波可以增強酶對底物的親和力，使酶的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，暴露催化中心和結(jié)合位點，以及使物料結(jié)構(gòu)松動便于酶進入內(nèi)部，從而促進酶促降解效應(yīng)[10]。截止目前，尚未有超聲波和酶處理用于促進克氏原螯蝦脫殼的報道。

相對于熱燙冷卻殼肉分離的加工工藝，本研究在減少熱燙時間的基礎(chǔ)上，采用堿性蛋白酶和超聲波對克氏原螯蝦進行處理，比較分析傳統(tǒng)熱燙加工及不同濃度的酶和不同功率超聲波處理對克氏原螯蝦殼肉分離功、產(chǎn)品得率以及蝦仁品質(zhì)的影響，以期為克氏原螯蝦的加工工藝優(yōu)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活克氏原螯蝦（小龍蝦）[質(zhì)量（40±2）g]：湖北仁尚仁食品有限公司；堿性蛋白酶（200 U/mg）：湖北裕盈生物科技有限公司；2，4-二硝基苯肼（分析純）、KCl-Tris 緩沖液（化學純）、氯化鈉（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

質(zhì)構(gòu)儀（TA.XT Plus） ：英國stable micro system 公司；色差儀（CR-400）：日本柯尼卡美能達公司；離心機（H-2050R-1）：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；嫩度儀（C-LM3B）：北京天翔飛域科技有限公司；紫外可見分光光度計（WFZ UV-2100）：尤尼柯（上海）儀器有限公司；Bradford 蛋白濃度試劑盒：南京建成生物工程研究所；超聲波清洗儀（GT1222）：深圳冠博科技有限公司；電子鼻（PEN3）：德國Airsense 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的處理

將小龍蝦清洗干凈后，隨機分為9 組，每組30 只，分別處理如下。對照組：沸水熱燙4 min 常溫水及冷水依次冷卻。組2：沸水熱燙1 min，室溫下0.5% 堿性蛋白酶酶液浸泡2 h，冷水漂洗，標記為0.5%。

組3：沸水熱燙1 min，室溫下1.0% 堿性蛋白酶酶液浸泡2 h，冷水漂洗，標記為1.0%。

組4：沸水熱燙1 min，室溫下300 W 超聲波處理2 h，冷水漂洗，標記為300 W。

組5：沸水熱燙1 min，室溫下600 W 超聲波處理2 h，冷水漂洗，標記為600 W。

組6：沸水熱燙1 min，室溫下0.5% 堿性蛋白酶酶液、300 W 超聲處理2 h，冷水漂洗，標記為0.5%+300。

組7：沸水熱燙1 min，室溫下0.5% 堿性蛋白酶酶液、600 W 超聲波處理2 h，冷水漂洗，標記為0.5%+600。

組8：沸水熱燙1 min，室溫下1.0% 堿性蛋白酶酶液、300 W 超聲波處理2 h，冷水漂洗，標記為1.0%+300。

組9：沸水熱燙1 min，室溫下1.0% 堿性蛋白酶酶液、600 W 超聲波處理2 h，冷水漂洗，標記為1.0%+600。

1.3.2 殼分離功

參考楊肖杰[11]的方法并略作改動，將經(jīng)過預(yù)處理的小龍蝦去除頭部并稱重，背部劃線，然后將蝦仁其中一端用探針穿過并固定在質(zhì)構(gòu)儀的底板上，夾具固定尾部與質(zhì)構(gòu)儀探頭連接，在張力模式下測試，觸發(fā)力5.0 g，以1 mm/s 的速度將殼拉離60 mm 的距離。根據(jù)Load-距離曲線計算殼肉分離所需要的總功，然后除以脫殼后所稱質(zhì)量得到殼分離功。

1.3.3 蝦仁得率

稱量鮮活小龍蝦的質(zhì)量及所得蝦仁的質(zhì)量，蝦仁得率為蝦仁質(zhì)量與鮮活小龍蝦質(zhì)量的比值，以百分數(shù)表示。

1.3.4 蝦仁完整率

脫殼后對蝦仁進行觀察，以蝦仁的肌肉是否完整和尾部是否斷裂作為判斷依據(jù)，蝦仁完整率為完整蝦仁數(shù)與蝦仁總數(shù)的比值，以百分數(shù)表示。

1.3.5 離心損失

參考汪蘭等[12]的方法，將取得的蝦仁稱重，然后在4 500 r/min 下離心10 min 后稱重。離心損失為離心后蝦仁質(zhì)量損失與新鮮蝦仁質(zhì)量的比值，以百分數(shù)表示。

1.3.6 嫩度

以剪切力作為嫩度指標，根據(jù)陳佳奇等[13]的方法測定，每組6 個重復(fù)。

1.3.7 蝦仁質(zhì)構(gòu)

選擇P/36R 探頭，取蝦仁中間部位進行質(zhì)地多面剖析法（texture profile analysis，TPA）模式測定，速度設(shè)置為測前2 mm/s，測后2 mm/s，來回循環(huán)兩次，每組6個重復(fù)，得到不同試驗組小龍蝦蝦仁的硬度、彈性、咀嚼性、內(nèi)聚性。

1.3.8 蝦仁色澤

利用色差儀對蝦仁的背部和腹部在Lab 模式下進行測定，考察不同處理組亮度L* 值、紅綠a*值及黃藍b*值的變化。

1.3.9 蝦仁氣味

參照沙小梅等[14]的方法，采用電子鼻檢測無任何處理的新鮮蝦仁、對照組、超聲300 W 處理組、0.5%+300 處理組、1.0%+600 處理組，對5 個組的所有傳感器響應(yīng)值進行主成分分析（principal component analysis，PCA）。

1.3.10 肌原纖維蛋白含量、酶活

依據(jù)張喜才[15]的方法，分別測定不同處理組的肌原纖維蛋白含量、蛋白酶活性。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

所有樣品取樣隨機重復(fù)3 次，試驗除注明外均重復(fù)3 次，采用SPSS 軟件對所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，p<0.05 被認為具有顯著差異，采用Origin 2018 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理方式對小龍蝦殼分離功的影響

小龍蝦的外殼與蝦仁之間通過結(jié)締組織緊密連接，殼分離功的大小取決于剝離過程中外殼肌肉連接的松緊程度，殼分離功越小，意味著脫殼越容易。不同處理組的殼分離功如圖1 所示。

圖1 不同處理方式對小龍蝦殼分離功的影響Fig.1 Effects of different treatment methods on separation work of Procambarus clarkii shells

由圖1 可知，對照組的殼分離功低于單獨的堿性蛋白酶處理組，而單獨采用超聲波處理的殼分離功最大，顯著高于對照組。對照組由于采用了4 min 的熱燙工藝，顯著降低了殼分離功，李高尚等[16]的研究結(jié)果也表明熱燙可以提高脫殼效率，這也是目前工廠采用熱燙法脫殼的主要原因。堿性蛋白酶雖然可以高效水解連接部位的膠原蛋白，但是試驗結(jié)果表明無論是0.5% 或者0.1% 的濃度，效果都不理想，主要原因可能是因為小龍蝦外殼堅硬致密，蛋白酶溶液不能充分與連接部位接觸。0.5%+300 處理組相對于對照組，殼分離功降低了約21.8%，說明堿性蛋白酶和超聲波聯(lián)合使用，具有良好的殼肉松動的效果。超聲具有空化效應(yīng)，產(chǎn)生大量的氣泡沖擊[17]，削弱了肌肉-殼的連接緊密程度，有利于堿性蛋白酶溶液發(fā)揮水解作用。但是0.5%+600、1.0%+300、1.0%+600 處理組的殼分離功相對于0.5%+300 處理組，并沒有顯著差異，說明0.5%+300處理組對于小龍蝦殼肉連接部位的水解已接近上限。

2.2 不同處理方式對小龍蝦蝦仁完整率和蝦仁得率的影響

不同處理方式對小龍蝦蝦仁完整率和蝦仁得率的影響如圖2 所示。

圖2 不同處理方式對小龍蝦蝦仁完整率和蝦仁得率的影響Fig.2 Effects of different treatment methods on shrimp completeness rate and yield of Procambarus clarkii

由圖2 可知，單獨堿性蛋白酶處理組和超聲波處理組的蝦仁完整率低于對照組，說明延長熱燙時間有利于蝦仁與蝦殼的脫離，但是對照組的蝦仁完整率只有89%，有部分蝦仁的肌肉與外殼黏連、蝦尾局部斷裂，而堿性蛋白酶-超聲波聯(lián)合處理組蝦仁完整率均達到了100%，說明堿性蛋白酶-超聲波協(xié)同作用有利于提高蝦仁的完整率。對照組的蝦仁得率高于單獨酶處理組和超聲處理組，0.5%+300 處理組相對于對照組則有顯著提升，提高了約31%。0.5%+300 處理組與其他3 組聯(lián)合處理組差異不顯著，但是1.0%+300、1.0%+600處理組蝦仁得率呈現(xiàn)出下降趨勢，有可能是堿性蛋白酶的水解作用過度，破壞力肌原纖維的結(jié)構(gòu)，溶解了部分肌原纖維蛋白，導(dǎo)致蝦仁得率降低[18]。

2.3 不同處理方式對小龍蝦質(zhì)構(gòu)的影響

質(zhì)構(gòu)是評價蝦仁品質(zhì)的重要指標，不同處理方式的小龍蝦蝦仁質(zhì)構(gòu)如圖3 所示。

由圖3 可知，對照組相比其他處理組硬度、彈性、咀嚼性更大，因為對照組熱燙時間較長，而熱燙可以導(dǎo)致肌原纖維蛋白變性，進而導(dǎo)致蝦仁硬度增大，同時彈性也有一定的增強，這與汪蘭等[12]的研究結(jié)果一致，傳統(tǒng)意義上認為硬度較高是蝦仁的良好指標，但是在實際的感官評定中，加熱過程中過高的硬度會導(dǎo)致口感粗糙[19]。0.5% 與1.0% 的堿性蛋白酶處理，導(dǎo)致硬度和彈性下降，原因是堿性蛋白酶降解部分結(jié)締組織和肌原纖維蛋白，導(dǎo)致蝦仁的結(jié)構(gòu)變得松弛。高功率的超聲波（600 W）也可以導(dǎo)致部分蛋白變性，結(jié)締組織結(jié)構(gòu)變得松散，一定程度上降低硬度和彈性。熱處理同樣可以提高咀嚼性和內(nèi)聚性，主要原因是肌原纖維三、四級結(jié)構(gòu)的破壞，空間結(jié)構(gòu)的改變導(dǎo)致肌纖維密度改變[20]。0.5%+300 處理組相對于對照組在硬度、彈性、咀嚼性上略有降低，但是差異并不顯著，而0.5%+600、1.0%+300、1.0%+600 3 個處理組在質(zhì)構(gòu)上相對于對照組有明顯變化。

2.4 不同處理方式對小龍蝦蝦仁色澤的影響

色澤是影響蝦仁感官評定的重要指標，不同處理方式的小龍蝦蝦仁色澤變化如表1 所示。

表1 超聲波和酶處理對小龍蝦蝦仁色澤的影響Table 1 Effect of ultrasound wave and enzyme treatment on color of Procambarus clarkii shrimp

由表1 可知，熱燙對于蝦仁的亮度L*值有一定的提升，其原因是熱燙使肌原纖維蛋白與肌漿蛋白變性聚集，蝦仁表面發(fā)生光散射，導(dǎo)致亮度增加[21]，而其他處理組L*值、a*值、b*值低于對照組。有研究表明加熱使蝦仁表面色澤變紅，推測原因主要有兩方面，一是蝦仁肌肉中的血紅素不穩(wěn)定，與其結(jié)合的蛋白質(zhì)受熱變性解離，導(dǎo)致血紅素的游離；二是蛋白質(zhì)變性使蝦仁中的蝦青素游離，蝦仁表面變紅[22]，除對照組外，其他處理組蝦仁亮度略低，但是保持了較低的紅度和黃度。表1 的結(jié)果表明單獨超聲波處理對蝦仁色澤影響很小，研究表明超聲對蝦青素的提取有一定的促進效果[23]。超聲-蛋白酶聯(lián)合處理則對蝦仁的亮度L*值影響較大，0.5%+300 處理組雖然亮度低于對照組，差異并不顯著，a*值則顯著低于對照組，因此0.5%+300 處理組蝦仁表面色澤綜合評價優(yōu)于對照組。

2.5 不同處理方式對小龍蝦蝦仁離心損失和嫩度的影響

離心損失和嫩度直接影響到蝦仁的口感，是鮮度評價的重要指標，不同處理組的小龍蝦蝦仁持水力和嫩度如圖4 所示。

圖4 不同處理方式對小龍蝦蝦仁離心損失和嫩度的影響Fig.4 Effects of different treatment methods on centrifugal loss and tenderness of Procambarus clarkii shrimp

水產(chǎn)品的離心損失象征肌肉的持水力，與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)密切相關(guān)[15]；嫩度則與蝦仁組織的含水量密切相關(guān)，可以用剪切力來表示[24]。由圖4 可以看出，對照組的離心損失顯著高于其他處理組，單獨的酶處理和超聲處理組之間的差異不大，超聲處理組略高于酶處理組，說明蝦仁受熱之后蛋白變性，持水能力下降，品質(zhì)劣化。堿性蛋白酶-超聲波聯(lián)合處理0.5%+300 處理組離心損失最低，而1.0%+600 處理組離心損失較0.5%+300 處理組有顯著的增加。不同處理組的剪切力變化與離心損失的變化趨勢相近，說明持水能力與嫩度密切相關(guān)，0.5%+300 處理組與其他幾組相比具有最高的嫩度，適度的蛋白水解和超聲處理可以提高蝦仁的持水力和嫩度，但是過度的水解和過高功率的超聲處理則可能帶來相反的作用。高功率超聲處理引起蝦仁嫩度下降及口感粗糙，其原因可能與肌原纖維蛋白的機械結(jié)構(gòu)遭到破壞有關(guān)，這與唐福元等[25]的研究結(jié)果相一致。

2.6 不同處理方式對小龍蝦蝦仁氣味的影響

電子鼻的10 個傳感器分別對應(yīng)不同的揮發(fā)性化合物，而這些代表性的化合物組成了蝦仁的獨特氣味，經(jīng)過對不同處理組的傳感器數(shù)據(jù)進行PCA 分析，結(jié)果如圖5 所示。

圖5 不同處理方式對小龍蝦蝦仁氣味的影響Fig.5 Effects of different treatment methods on smell of Procambarus clarkii shrimp

PCA 可以將多重數(shù)據(jù)降維，對樣本的多個指標簡化為二維數(shù)據(jù)進行分析，一般PC1 與PC2 的和不低于85%，即認為可以代表樣品指標的主要信息[14]。由圖5可知，PC1 與PC2 的總貢獻率為92.8%，說明該分析結(jié)果具有代表性，能夠表征新鮮蝦仁、對照組、300 W、0.5%+300、1.0%+600 5 組樣品的氣味。圖中每個處理組所處的位置以及不同組之間的距離可以代表其差異性。從圖5 可以看到，對照組與新鮮蝦仁氣味明顯，主要是長時間的加熱，揮發(fā)性物質(zhì)損失較多，脂肪與蛋白氧化嚴重[26]，而300 W 和0.5%+300 處理組則與新鮮蝦仁的氣味較為接近，不過1.0%+600 處理組與新鮮蝦仁的差異相對明顯，推測是肌肉蛋白質(zhì)的過度降解，產(chǎn)生了游離氨基酸等風味物質(zhì)，對蝦仁的氣味造成了影響。

2.7 不同處理方式對小龍蝦蝦仁肌原纖維蛋白含量及蛋白酶酶活力的影響

肌原纖維蛋白是小龍蝦蝦仁的重要營養(yǎng)成分，加熱、超聲波以及蛋白酶都可能會影響肌原纖維的結(jié)構(gòu)，引起肌原纖維蛋白的變性和降解。不同處理方式對小龍蝦蝦仁肌原纖維蛋白含量及蛋白酶酶活力的影響如圖6 所示。

圖6 不同處理方式對小龍蝦蝦仁肌原纖維蛋白含量及蛋白酶酶活力的影響Fig.6 Effects of different treatment methods on myofibrillar content and protease enzyme activity of Procambarus clarkii shrimp

由圖6 可知，對照組的肌原纖維蛋白含量顯著低于其他處理組，說明4 min 的熱處理對肌原纖維蛋白造成了嚴重破壞，蝦仁的營養(yǎng)品質(zhì)下降嚴重。單獨的堿性蛋白酶處理或者超聲波處理，則對肌原纖維蛋白含量影響不大，但是由于堿性蛋白酶-超聲波聯(lián)合處理能夠促進肌原纖維蛋白的降解，肌原纖維蛋白含量低于單獨的堿性蛋白酶或者超聲波處理組，不過0.5%+300 組與單獨超聲波和堿性蛋白酶處理組差異不顯著，而1.0%+600 處理組的肌原纖維蛋白含量則顯著降低，原因是蛋白質(zhì)的過度水解，綜上所述，采用1 min熱燙能夠有效保留蝦仁的肌原纖維蛋白。高濃度的蛋白酶結(jié)合高強度的超聲波處理對肌原纖維、線粒體等造成破壞[27]，有可能造成肌原纖維蛋白的進一步降解而造成營養(yǎng)損失。

為了探索堿性蛋白酶-超聲波聯(lián)合處理促進脫殼的機理，對所有處理組的蛋白酶活力進行檢測。超聲對蛋白酶存在兩種效應(yīng)：促進酶活或者導(dǎo)致酶結(jié)構(gòu)改變而失活。由圖6 可知，超聲沒有提高堿性蛋白酶的活力，反而使酶活性有了一定程度的下降，特別是1.0%+600 處理組相對于1.0%+300 處理組，酶活力下降了約12%。另外，對照組和單獨超聲處理未發(fā)現(xiàn)蛋白酶活性，說明超聲和加熱均不會誘導(dǎo)內(nèi)源性蛋白酶的活性。因此，超聲-蛋白酶促進小龍蝦的殼肉分離，其主要原因應(yīng)該是超聲首先導(dǎo)致外殼與肌肉產(chǎn)生縫隙，使堿性蛋白酶與殼肉連接組織充分接觸，促進了連接組織蛋白質(zhì)的降解。

3 結(jié)論

相對于現(xiàn)行傳統(tǒng)處理方式，在減少熱燙時間的同時，采用堿性蛋白酶和超聲波聯(lián)合處理，能有效降低殼分離功，提高蝦仁的完整率和得率，保留較高的肌原纖維蛋白含量，并改善蝦仁的嫩度和表面色澤，而過高的酶濃度和超聲功率則會造成營養(yǎng)流失和質(zhì)構(gòu)劣變。因此，克氏原螯蝦熱燙1 min 后采用0.5% 堿性蛋白酶和300 W 超聲波聯(lián)合處理，可提高蝦仁品質(zhì)，降低殼肉分離的難度，為克氏原螯蝦的加工工藝優(yōu)化提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。