泥鰍抗菌肽制備及其抑制致鰻弧菌作用

竇寶杰，丁聞，盧靜 ，郭全友，呂明生 ，王淑軍

（1.江蘇海洋大學(xué) 江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點實驗室，江蘇 連云港 222005；2.江蘇海洋大學(xué) 江蘇省海洋生物技術(shù)重點實驗室，江蘇 連云港 222005；3.中國水產(chǎn)科學(xué)院 東海水產(chǎn)研究所，上海 200090）

泥鰍（Misgurnusanguillicaudatus）屬于鯉形目鰍科，在亞洲廣泛分布[1]。泥鰍富含優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、透明質(zhì)酸、多糖、維生素、礦物質(zhì)和必需氨基酸，具有極高的營養(yǎng)價值和食用價值[2-3]。泥鰍脂肪和膽固醇含量低，屬高蛋白低脂肪食品，是潛在的優(yōu)質(zhì)動物蛋白資源[2]。目前，市場上泥鰍加工產(chǎn)品仍以直接加工為主，如泥鰍干、麻辣泥鰍、泥鰍粉等[4]，其精深加工技術(shù)和應(yīng)用亟需研究。

抗菌肽主要來源于植物和動物的提取以及微生物發(fā)酵，分子量多分布在2~7 kDa[5-7]。與傳統(tǒng)抗生素相比，抗菌肽具有抗菌能力強、抗菌譜廣、不易產(chǎn)生耐藥性等特點[5]。目前的研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽的作用機理主要是破壞細(xì)菌膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致菌體死亡[8]。對于泥鰍源抗菌肽的研究，裴穎等[9]使用Tris-HCl 法對泥鰍中的抗菌肽進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)其對嗜水氣單胞菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌抑菌效果明顯。通過酶法生產(chǎn)的抗菌肽具有安全性高、酶解過程易于控制、生產(chǎn)得率高等優(yōu)點[8]。然而，使用酶解法提取泥鰍抗菌肽的研究相對較少，值得進(jìn)一步研究。

本文以泥鰍為原料，選用5 種蛋白酶對其進(jìn)行酶解，并對酶解產(chǎn)物進(jìn)行初步超濾純化，制備出具有抑制致病菌作用的抗菌肽，初步探索其抗菌機制，以期為泥鰍的精深加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

泥鰍（M.anguillicaudatus）：連云港金水灣食品有限公司；胰蛋白酶（20 萬U/g）、中性蛋白酶（20 萬U/g）、堿性蛋白酶（20 萬U/g）：寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司；酸性蛋白酶（20 萬U/g）、木瓜蛋白酶（20 萬U/g）：南京龐博生物工程有限公司；金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、副溶血性弧菌（Vibrioparahaemolyticus）、哈維氏弧菌（Vibrioharveyi）、鰻弧菌（Vibrioanguillarum）、溫和水氣單胞菌（Aeromonastemperate）、嗜水氣單胞菌（Aeromonashydrophila）：江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點實驗室保藏；2，2-二苯基-1-苦基肼（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）：美國Sigma 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

5804R 高速冷凍離心機：艾本德（中國）有限公司；ALPH4 真空冷凍干燥機：江蘇海企國際股份有限公司；THZ-103B 恒溫培養(yǎng)搖床、DK-8D 恒溫水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Multiskan FC 全波長酶標(biāo)儀：美國Thermo fisher 公司；BPX-52 生化培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司；JSMIT-800 掃描電鏡：日本東京JEOL 公司。

1.3 方法

1.3.1 泥鰍肉糜的酶解與純化

1.3.1.1 泥鰍肉糜的酶解

利用胰蛋白酶、酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶5 種蛋白酶，以泥鰍肉糜為底物，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%（即30 g 肉糜中加入70 mL 水制成勻漿），每克肉糜中添加900 U 蛋白酶，在一定條件下酶解4 h，沸水浴中滅酶15 min，冷卻后4 ℃下4 000 r/min離心20 min，取上清液[10-12]。胰蛋白酶、酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物分別命名為Y、S、M、Z、J。具體酶解條件見表1。

表1 不同蛋白酶的酶解條件Table 1 Enzymatic hydrolysis conditions of different proteases

1.3.1.2 酶解產(chǎn)物的純化

將Y、S、M、Z、J 先使用0.45 μm 濾膜過濾，去除其中大分子雜蛋白。隨后利用超濾裝置對抽濾得到的液體進(jìn)行分離純化。經(jīng)5 kDa 和10 kDa 的超濾膜超濾，每種泥鰍酶解產(chǎn)物獲得3 種組分，即<5 kDa、5~10 k Da、>10 kDa，依次標(biāo)記為Y1、Y2、Y3，S1、S2、S3，M1、M2、M3，Z1、Z2、Z3，J1、J2、J3。對各組分進(jìn)行冷凍干燥用于后續(xù)試驗。

1.3.2 酶解產(chǎn)物的抗菌活性

以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為受試菌，測定菌液的光密度值（OD600nm）以比較產(chǎn)物的抗菌活性。在無菌試管中加入酶解產(chǎn)物與5 mL 液體培養(yǎng)基，接種200 μL 菌懸液（菌濃度1×104CFU/mL），以不加酶解產(chǎn)物作為對照，充分混勻，將試管放入37 ℃恒溫培養(yǎng)搖床中培養(yǎng)20 h 后，測定OD600nm[13-15]。

1.3.3 酶解產(chǎn)物的抗致病菌活性

1.3.3.1 不同組分抗致病菌的活性

方法同1.3.2，分別測定泥鰍木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物M、M1、M2、M3 對常見病原菌哈維氏弧菌、鰻弧菌、溫和水氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、副溶血性弧菌的抑菌作用。抑菌率（X，%）的計算公式如下。

式中：An 為試驗組的吸光度；An0為對照組吸光度；A0為空白組吸光度。

1.3.3.2 不同濃度M1 抑制鰻弧菌的活性

將M1 梯度稀釋，測定其對鰻弧菌的抗菌活性，計算出IC50值。

1.3.4 M1 抗氧化活性的測定

1.3.4.1 DPPH 自由基清除作用

將M1 稀釋成不同濃度梯度，將0.2 mL 酶解產(chǎn)物M1 與0.2 mL 的DPPH（0.1 mmol/L）依次加入，置于暗處，30 min 后測量OD517nm[16-17]。DPPH 自由基清除率計算公式如下。

式中：Y為DPPH 自由基清除率，%；Ax 為DPPH與M1 反應(yīng)的吸光度；Ax0為乙醇與M1 反應(yīng)的吸光度；A0為DPPH 與水的吸光度。

1.3.4.2 羥自由基清除作用

將M1 稀釋成不同濃度梯度，將0.1 mL 酶解產(chǎn)物M1、0.1 mL 9 mmol/L FeSO4、0.1 mL 9 mmol/L 水楊酸（無水乙醇溶液）、0.1 mL H2O2混合，37 ℃水浴15 min，測量OD510nm[16-17]。羥自由基清除率計算公式如下。

式中：W為羥自由基清除率，%；Ax 為樣品的吸光度；Ax0為空白試劑的吸光度；A0為不含樣品的對照的吸光度。

1.3.4.3 超氧陰離子自由基清除活性

將M1 稀釋成不同濃度梯度，將0.2 mL M1 與1 mL Tris-HCl（50 mmol/L）混合，25 ℃溫育10 min，立即加入30 μL 鄰苯三酚（6 mmol/L），室溫放置30 min，測量OD320nm。 超純水和VC分別作空白對照和陽性對照[16-17]。超氧陰離子自由基清除率計算公式如下。

式中：Z為超氧陰離子自由基清除率，%；Ax 為M1+Tris-HCl+鄰苯三酚的吸光度；Ax0為M1+Tris-HCl+HCl 的吸光度；A0為水+Tris-HCl+鄰苯三酚吸光度。

1.3.4.4 還原力測定

將M1 稀釋成不同濃度梯度，將0.2 mL M1、0.2 mL磷酸鹽緩沖溶液（0.2 mol/L，pH6.6）和0.2 mL 的1% 鐵氰化鉀混合，50 ℃孵育20 min，然后加入0.2 mL 10%三氯乙酸，混合后5 000 r/min 離心10 min。將0.5 mL上清液、2.5 mL 蒸餾水與0.1 mL 的氯化鐵混合，測量OD700nm，超純水和VC作參照[16-17]。

1.3.5 M1 抗菌機理研究

1.3.5.1 M1 對鰻弧菌生物膜的作用

將24 孔板每孔添加新鮮的LB 培養(yǎng)基1 mL，40 μL菌液，加入M1 以達(dá)到不同濃度，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。棄掉培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）輕洗3 次，每孔加入0.1% 結(jié)晶紫溶液1 mL，染色20 min。倒出染色液，用去離子水沖洗3 遍。于45 ℃烘箱干燥，加入95% 乙醇脫色3 min，將脫色液移入96孔板，測定OD570nm[18-19]。

電鏡檢測菌體的生物膜：將24 孔板中一孔添加新鮮的LB 培養(yǎng)基2 mL，100 μL 菌液，加入M1 使之濃度達(dá)到IC50值，放入無菌玻璃片，37 ℃培養(yǎng)24 h。以不加入M1 為對照。待生物被膜形成后，棄去培養(yǎng)液，用PBS 沖洗3 次，風(fēng)干，向孔板中加入2 mL 2.5% 戊二醛固定生物膜。再分別用30%、50%、70%、80%、90%、100% 乙醇脫水10 min，噴金后電鏡觀察[20]。

1.3.5.2 M1 抑制致病菌細(xì)胞膜的作用

通過測量細(xì)胞成分的釋放（OD260nm）來測定細(xì)胞膜的完整性。首先將鰻弧菌培養(yǎng)至對數(shù)期，然后5 000 r/min離心5 min。用0.1 mol/L PBS（pH7.4）洗滌沉淀3 次，與不同濃度樣品在37 ℃培養(yǎng)4 h，在260 nm 測定釋放的核酸[21]。

1.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

所有試驗均設(shè)3 個平行樣，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Origin 2018 制圖，SPSS Statistics 26 對數(shù)據(jù)的差異性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白酶對酶解產(chǎn)物抗菌活性的影響

圖1、圖2 為經(jīng)不同蛋白酶酶解后，泥鰍酶解產(chǎn)物對大腸桿菌與金黃色葡萄球菌活性的影響。

圖1 泥鰍酶解產(chǎn)物對大腸桿菌的抑制活性Fig.1 Inhibitory activity of enzymatic hydrolysates of Misgurnus anguillicaudatus on Escherichia coli

圖2 泥鰍酶解產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌抑制活性Fig.2 Inhibitory activity of enzymatic hydrolysates of Misgurnus anguillicaudatus on Staphylococcus aureus

由圖1 可以看出，泥鰍蛋白酶酶解產(chǎn)物各組分對大腸桿菌抑制活性差異明顯。其中，添加木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物組分M1 的OD 值最低，說明M1 抑制大腸桿菌活性作用最強。圖2 顯示添加酸性蛋白酶酶解產(chǎn)物組分S1 和木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物組分M1 的OD 值低于其他組分，說明這2 個組分抑制金黃色葡萄球菌活性高于其他組分。經(jīng)過超濾后分子量小于5 kDa 的酶解產(chǎn)物抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌活性更強，這與王蕾[22]的結(jié)果相似。研究發(fā)現(xiàn)從泥鰍中提取的抗菌肽能夠殺死大部分革蘭陽性菌，部分革蘭陰性菌[23]。研究表明，不同濃度的泥鰍肽可對多種細(xì)菌產(chǎn)生抑制作用[24]。酶解產(chǎn)物抗菌活性的強弱與選用的蛋白酶有關(guān)[25]。吳林澤等[26]發(fā)現(xiàn)，使用堿性蛋白酶酶解的羅非魚下腳料粗肽對金黃色葡萄球菌的抗菌效果好。雖然這5 種蛋白酶都具有制備抗菌肽的潛力，但不同蛋白酶對蛋白的酶切位點不同，其產(chǎn)生的抗菌肽的數(shù)量與質(zhì)量也不同。根據(jù)效果，選用木瓜蛋白酶進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 泥鰍木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物對致病菌的抑制作用

泥鰍木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物各組分對致病菌的抑制作用見表2。

表2 泥鰍木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物各組分對致病菌的抑制作用Table 2 Inhibitory effects of various components of enzymatic hydrolysates of papain of Misgurnus anguillicaudatus on pathogenic bacteria

由表2 可知，在泥鰍木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物中，分子量越小其抗菌效果越強。其中M1 對常見水產(chǎn)動物致病菌嗜水氣單胞菌、鰻弧菌、哈維氏弧菌、溫和水氣單胞菌、副溶血性弧菌均具有一定的抑制作用。M1 對不同致病菌的抗菌效果不同，對鰻弧菌的抑菌活性更強，具體結(jié)果見圖3。

圖3 泥鰍多肽M1 抑制鰻弧菌活性Fig.3 Inhibitory activity of polypeptide M1 from Misgurnus anguillicaudatus on Vibrio anguillarum

由圖3 可知，隨著M1 濃度的增加，對鰻弧菌抑制活性增加。通過計算，其IC50值為15.76 mg/mL。楊富敏[27]利用堿性蛋白酶酶解扇貝裙邊，其產(chǎn)物分子量集中在1~3 kDa，可以抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長?？档ささ萚28]通過木瓜蛋白酶制備多肽，其對金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌和化膿性鏈球菌的最低抑制濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）分別為5、10、2.5 mg/mL。王碧超[29]以金槍魚骨頭制備的膠原基抗菌肽，其抑制大腸桿菌MIC 和最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）值分別為4 mg/mL 和8 mg/mL。結(jié)果表明，泥鰍酶解多肽M1 具有一定抗菌作用。

2.3 泥鰍多肽M1 的抗氧化活性

泥鰍多肽M1 的抗氧化活性見圖4~圖7。

圖4 泥鰍多肽M1 的DPPH 自由基清除活性Fig.4 DPPH scavenging activity of polypeptide M1 from Misgurnus anguillicaudatus

圖5 泥鰍多肽M1 的羥自由基清除活性Fig.5 Hydroxyl radical scavenging activity of polypeptide M1 from Misgurnus anguillicaudatus

圖6 泥鰍多肽M1 的超氧陰離子自由基清除活性Fig.6 Superoxide radical scavenging activity of polypeptide M1 from Misgurnus anguillicaudatus

圖7 泥鰍多肽M1 的還原力Fig.7 Reducing activity of polypeptide M1 from Misgurnus anguillicaudatus

由圖4 可知，當(dāng)M1 濃度達(dá)到20 mg/mL，其DPPH自由基清除率超過50%。DPPH 自由基是一種相對穩(wěn)定的脂質(zhì)自由基，加入抗氧化劑后能夠抑制自由基的氧化[30]。常雷[31]利用蛋白酶酶解蟾蜍皮獲得抗氧化肽和抗菌肽，其DPPH 自由基清除活性IC50值分別為2.24 mg/mL 和1.004 mg/mL。由圖5 可知，M1 羥自由基清除活性較好，通過計算其IC50值為5.43 mg/mL。一般認(rèn)為某種物質(zhì)的IC50低于10.0 mg/mL 時，說明其具有良好的抗氧化性[30-31]。由圖6 可知，當(dāng)M1 濃度為2 mg/mL 時，其超氧陰離子自由基活性達(dá)到43.58%，其IC50值7.33 mg/mL，說明其具有良好的超氧陰離子自由基清除活性。由圖7 可知，隨著M1 濃度的提升，其吸光度不斷提升。當(dāng)M1 濃度為2 mg/mL，其吸光度為0.18，說明M1 具有良好的還原力。研究表明，分子量較小的肽，具有更強的抗氧化活性，并且多肽中疏水性氨基酸的比例越高其抗氧化活性越強[32]。Zhi 等[33]研究發(fā)現(xiàn)扇貝蛋白質(zhì)酶解物中低分子量的組分具有更強的氧自由基吸收能力。綜上，泥鰍蛋白經(jīng)過蛋白酶酶解后形成的小分子多肽具有較好的抗氧化性。

2.4 泥鰍多肽M1 的抗菌機理

2.4.1 M1 對鰻弧菌生物膜的抑制作用

M1 對鰻弧菌生物膜的抑制作用見圖8，鰻弧菌生物被膜電鏡圖見圖9。

圖8 M1 對鰻弧菌生物膜的抑制作用Fig.8 Inhibitory effect of M1 on biofilm of Vibrio anguillarum

圖9 鰻弧菌生物被膜電鏡圖Fig.9 Scanning electron micrograph of biofilm of Vibrio anguillarum

由圖8 可知，隨著M1 濃度的提升，染色液的OD值顯著降低，M1 對鰻弧菌生物膜的形成具有抑制作用。生物被膜是微生物黏附于介質(zhì)的表面，通過分泌的胞外基質(zhì)包裹而形成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，是微生物在環(huán)境中定植的物質(zhì)基礎(chǔ)[34]。抑制生物膜的形成可以減少細(xì)菌的黏附和聚集，從而抑制鰻弧菌的感染。

如圖9 所示，未經(jīng)M1 處理的玻片中，鰻弧菌菌體密集集中的黏附在玻片的表面，相互堆疊，結(jié)構(gòu)緊密，互相連結(jié)，顯示了菌株良好的生物膜形成能力。相反，經(jīng)過M1 處理后（圖9c、圖9d）鰻弧菌之間稀疏和松散，形成孔隙，表明生物被膜的形成受到了影響。這與趙洋等[20]獲得的結(jié)果相似。結(jié)果表明，泥鰍多肽M1使鰻弧菌的生長受到抑制，可以明顯減少鰻弧菌生物膜的形成。

2.4.2 M1 對鰻弧菌細(xì)胞膜完整性的作用

M1 對鰻弧菌細(xì)胞膜完整性的作用見圖10。

圖10 M1 對鰻弧菌細(xì)胞膜完整性的作用Fig.10 Effect of M1 on cell membrane integrity of Vibrio anguillarum

由圖10 可知，當(dāng)M1 濃度高于IC50的50% 時，檢測到細(xì)胞內(nèi)容物的釋放量（OD260nm）顯著增加，說明泥鰍多肽M1 對鰻弧菌的細(xì)胞膜具有損傷作用。此外，經(jīng)過M1 處理后（圖9c、圖9d），鰻弧菌表面更加粗糙，并且部分鰻弧菌表面發(fā)生皺縮，形態(tài)發(fā)生改變，這說明鰻弧菌細(xì)胞膜出現(xiàn)了損傷。相反，未經(jīng)M1 處理的鰻弧菌（圖9a、圖9b）生長狀態(tài)良好，未出現(xiàn)明顯的形態(tài)變化。研究表明，抗菌肽會與菌體細(xì)胞的膜蛋白結(jié)合，抑制菌體的新陳代謝，導(dǎo)致菌體死亡裂解[35]。抗菌肽會提高膜的滲透性并破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，從而使核酸、蛋白質(zhì)和其他細(xì)胞成分滲漏[36]。胡平等[37]研究發(fā)現(xiàn)蠐螬多肽Probrelin 會影響白色念珠菌細(xì)胞膜的完整性，從而抑制白色念珠菌的生長。推測M1 通過與鰻弧菌細(xì)胞膜的相互作用，使細(xì)菌的細(xì)胞膜產(chǎn)生缺陷，導(dǎo)致細(xì)菌控制物質(zhì)進(jìn)出困難，進(jìn)而使得細(xì)菌破裂，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物溢出。

3 結(jié)論

以連云港泥鰍為原料，每克肉糜中添加900 U 木瓜蛋白酶，在55 ℃條件下酶解4 h。經(jīng)過超濾分離，分子量小于5 kDa 酶解產(chǎn)物M1 對多種病原菌的生長具有抑制作用，其對鰻弧菌的抗菌效果最好，抑制鰻弧菌的IC50值為15.76 mg/mL。泥鰍多肽M1 具有清除DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基的作用，抗氧化活性較好。M1 可以明顯抑制鰻弧菌的生物膜的形成，破壞鰻弧菌的細(xì)胞膜，引起鰻弧菌形態(tài)的改變，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物的流出。本研究為進(jìn)一步開發(fā)泥鰍多肽、發(fā)現(xiàn)更多天然抗菌物質(zhì)、提高泥鰍的經(jīng)濟(jì)價值提供參考。