鐵皮石斛多糖與Toll 樣受體4 互作機(jī)制的計(jì)算模擬

崔萌菲，張悅，張志宇，許慧敏，劉翠，成穎，李居行，劉歡歡，4，賀超，郭慶彬 ，劉岯

（1.天津科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；2.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457；3.中國(guó)科學(xué)院 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 低碳制造工程生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室生物設(shè)計(jì)中心，天津 300308；4.天津益膳康生物科技有限公司，天津 300305；5.中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 人工合成淀粉研究中心，天津 300308）

鐵皮石斛（DendrobiumofficinaleKimura & Migo）是一種無(wú)毒無(wú)害的中草藥和新型食品資源。多糖是鐵皮石斛中主要的生物活性成分之一，研究表明鐵皮石斛多糖（Dendrobiumofficinalepolysaccharide，DOP）具有免疫調(diào)節(jié)[1]、抗腫瘤[2]、抗炎[3]、保肝[4]和胃保護(hù)[5]等作用。DOP 還可以與細(xì)胞表面的特定受體結(jié)合以激活各種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[6]，主要通過(guò)抑制絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）、核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NFκB）活化，促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌[7]和巨噬細(xì)胞的吞噬活性[8]，進(jìn)而調(diào)節(jié)人體的免疫功能。多糖是鐵皮石斛中最主要的生物活性物質(zhì)，尤其在增強(qiáng)免疫方面展現(xiàn)了優(yōu)異的活性。因此，DOP 引起越來(lái)越多研究者的關(guān)注[9]。DOP 的組成[10]得到廣泛研究，不同來(lái)源的石斛多糖組分存在一定差異，但主要由不同比例、通過(guò)β-1，4糖苷鍵連接的D-甘露糖和D-葡萄糖組成。其中有些甘露糖單元的O-2 或O-3 上存在乙?；鶈稳〈?，也存在少量O-2 和O-3 位同時(shí)取代的二取代形式[11]。已有研究表明[12]，多糖的乙酰基取代數(shù)量和取代位置與多糖的活性有一定的關(guān)系。當(dāng)所有O 位都被乙?；〈鷷r(shí)，多糖的抗腫瘤活性完全消失。當(dāng)O-3 位被乙?；〈鷷r(shí)，多糖的抗腫瘤活性明顯增強(qiáng)。因此，在適當(dāng)?shù)奈恢帽Ｓ羞m量的乙?；赡苁氰F皮石斛多糖發(fā)揮功效的關(guān)鍵。

Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）是先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，并參與許多疾病的發(fā)生和發(fā)展，可直接使用或作為疫苗中的佐劑，具有潛在的治療癌癥和感染的功能[13]。TLR4 是一種保守的I 型跨膜蛋白，包括胞外域、跨膜區(qū)和胞內(nèi)域3 個(gè)部分，分子量約為96 kDa[14]，其中胞外域由608 個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，具有富含亮氨酸重復(fù)單元（leucine-rich repeats，LRR）N 端，相對(duì)保守，呈現(xiàn)LRR 超家族特有的馬蹄形結(jié)構(gòu)，可用于識(shí)別生物大分子。胞內(nèi)域由187 個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成[15]。髓樣分化因子-2（myeloid differentiation protein-2，MD-2）具有β折疊結(jié)構(gòu)，由160 個(gè)氨基酸組成，具有一個(gè)大的疏水口袋，可與TLR4 形成穩(wěn)定的異二聚體復(fù)合物TLR4-MD-2[16]。TLR4-MD-2 的經(jīng)典底物脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），主要是由3 個(gè)結(jié)構(gòu)域組成：一個(gè)相對(duì)保守的非重復(fù)核心寡糖、O抗原和一個(gè)嵌入在外膜中被稱(chēng)為脂質(zhì)A 或內(nèi)毒素的疏水結(jié)構(gòu)域。其中核心寡糖影響外膜的滲透特性；O抗原有助于分子的抗原性[17]；脂質(zhì)A 結(jié)構(gòu)域與免疫受體相互作用，賦予LPS 分子一系列免疫和潛在的內(nèi)毒素特性。LPS 的結(jié)合能夠引導(dǎo)兩個(gè)TLR4-MD-2-LPS復(fù)合物對(duì)稱(chēng)排列，形成由兩個(gè)拷貝組成的m 形受體多聚體。

研究表明，DOP 可作為激活巨噬細(xì)胞的TLR4 激動(dòng)劑[18]。Zhang 等[19]研究多糖和TLR4 的結(jié)構(gòu)和生物活性之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)葡萄糖、甘露糖和半乳糖是TLR4 相關(guān)活性多糖的藥效團(tuán)。然而，由于結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，包括DOP 在內(nèi)的多糖仍然難以確定哪一部分是免疫活性片段以及如何與TLR4 相互作用[20]。 目前TLR4 與DOP 相互作用的研究也主要側(cè)重于實(shí)驗(yàn)層面[21-22]，仍然缺乏在原子水平上的相互作用機(jī)制研究。分子對(duì)接、分子動(dòng)力學(xué)模擬等計(jì)算模擬方法是一種通過(guò)計(jì)算機(jī)平臺(tái)模擬分子性質(zhì)的技術(shù)手段[23]，能夠在原子水平上準(zhǔn)確直觀地預(yù)測(cè)結(jié)合模式，揭示體外實(shí)驗(yàn)難以捕獲的機(jī)理細(xì)節(jié)[24]，是研究分子間相互作用機(jī)制的有效方法。

本文通過(guò)類(lèi)比經(jīng)典底物脂多糖的結(jié)合模式，通過(guò)對(duì)TLR4-MD-2 底物結(jié)合口袋的親疏水性分析，提出對(duì)DOP 分別進(jìn)行疏水性寡糖片段和親水性寡糖片段的篩選，進(jìn)而組合得到與TLR4-MD-2 作用最佳的多糖結(jié)合片段。基于DOP 的分子組成，構(gòu)建由二糖、三糖、四糖組成的疏水寡糖庫(kù)，借助分子對(duì)接分析，找出最佳疏水結(jié)合片段。進(jìn)一步引入三糖和四糖組成的親水結(jié)合片段，得到與TLR4-MD2 作用最佳的DOP 片段。通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬和結(jié)合自由能計(jì)算（molecular mechanics generalized born surface area、MMGBSA）及殘基分解結(jié)合能計(jì)算，確定最佳DOP 寡糖片段的作用模式及與TLR4-MD2 的作用機(jī)制。本研究所采用的模擬方法，不僅可以用于鐵皮石斛多糖與受體蛋白的相互作用研究，也可為其他多糖-蛋白質(zhì)的相互作用研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 結(jié)構(gòu)處理和數(shù)據(jù)準(zhǔn)備

蛋白質(zhì)處理：使用從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（protein data bank，PDB）下載的晶體結(jié)構(gòu)3FXI 作為初始結(jié)構(gòu)，使用Schrodinger 2018 軟件的Protein Preparation Wizard 模塊進(jìn)行蛋白的預(yù)處理，去除水分子，在pH7.0 條件下加氫，然后用OPLS3e 力場(chǎng)進(jìn)行蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)優(yōu)化，去除不合理的結(jié)構(gòu)沖突。利用ExPASy[25]的ProtScale工具中氨基酸疏水性標(biāo)準(zhǔn)等級(jí)數(shù)值[26]對(duì)TLR4-MD-2蛋白進(jìn)行親疏水性分析。利用Pymol 的APBS 插件計(jì)算TLR4-MD2 的表面靜電分布。

寡糖片段生成：為了進(jìn)行疏水寡糖片段的篩選，對(duì)組成石斛多糖的5 種主要糖殘基（D-甘露糖、D-葡萄糖、O-2 或O-3 乙?；鶈稳「事短?、O-2 和O-3 同時(shí)取代的甘露糖），利用編寫(xiě)的python 腳本生成所有二糖、三糖和四糖片段的可能組合。根據(jù)得到的組合寡糖的序列，利用Schrodinger 2018 的Custom R-Group Enumeration 模塊完成疏水寡糖分子庫(kù)的構(gòu)建。對(duì)于親水寡糖片段庫(kù)的構(gòu)建，考慮到葡萄糖和甘露糖的親水性，選取3~4 個(gè)葡萄糖和3 個(gè)甘露糖，使用同樣的方法構(gòu)建得到所有可能的親水多糖片段組合。初始結(jié)構(gòu)組成及LPS 的結(jié)構(gòu)組成見(jiàn)圖1。

圖1 初始結(jié)構(gòu)組成及LPS 的結(jié)構(gòu)組成Fig.1 Initial structural composition and LPS structural composition

1.2 分子對(duì)接

利用Schrodinger 2018 軟件中的LigPrep 模塊，選用OPLS 分子力場(chǎng)，對(duì)構(gòu)建好的疏水寡糖片段庫(kù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化處理。與準(zhǔn)備好的TLR4-MD-2 蛋白結(jié)構(gòu)一起載入Ligand Docking 模塊進(jìn)行分子對(duì)接分析?；诰w結(jié)構(gòu)3FXI 中的天然配體脂多糖分子，使用Receptor Grid Generation 模塊設(shè)置對(duì)接盒子位置，根據(jù)對(duì)接打分挑選最佳疏水性片段。在最佳疏水性片段的基礎(chǔ)上引入親水性片段組合后，同樣參照脂多糖的位置進(jìn)行DOP 片段的分子對(duì)接。

1.3 分子動(dòng)力學(xué)模擬

使用分子動(dòng)力學(xué)模擬軟件Amber 20[27]對(duì)最后得到的DOP 片段與TLR4-MD-2 蛋白的復(fù)合體系進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬。在模擬中，使用了ff19SB 力場(chǎng)，采用SHAKE 方法約束鍵長(zhǎng)振動(dòng)，將所有的模擬體系放入水層厚度為15 ? 的矩形TIP3P 水盒子中，采用周期性邊界條件，使用Na+作為抗衡離子使整體電荷保持中性。所有的體系首先經(jīng)過(guò)2 輪4 000 步的能量最小化，其中2 000 步為最陡下降法，2 000 步為共軛梯度法。第一輪優(yōu)化，給體系施加2 kcal/（mol·A）的限制力常數(shù)，第二輪優(yōu)化無(wú)限制。之后進(jìn)行了500 ps 的加熱模擬，目標(biāo)溫度為300 K。緊接著使用20 輪密度平衡模擬，每輪20 ps，使體系密度達(dá)到均衡。之后是500 ps 的平衡模擬，使體系達(dá)到300 K 下的平衡狀態(tài)。最后進(jìn)行3 條平行的1 000 ns 的長(zhǎng)時(shí)生產(chǎn)模擬。使用average linkage聚類(lèi)方法對(duì)力學(xué)軌跡中非氫原子進(jìn)行疊合，基于底物的距離進(jìn)行聚類(lèi)分析，得到體系的代表性結(jié)合構(gòu)象。對(duì)優(yōu)勢(shì)結(jié)合模式進(jìn)行結(jié)合能和殘基分解結(jié)合能計(jì)算分析，找到有重要貢獻(xiàn)的結(jié)合殘基和作用機(jī)制。

1.4 數(shù)據(jù)處理和可視化

軌跡分析使用Amber 20 的Cpptraj 模塊進(jìn)行，所得數(shù)據(jù)使用Excel 進(jìn)行歸納處理與分析，用Origin 2021、PowerPoint 2021 對(duì)所得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖。通過(guò)將復(fù)合物的PDB 文件上傳至蛋白質(zhì)配體相互作用分析器（protein-ligand interaction profiler，PLIP）[28]進(jìn)行寡糖-蛋白相互作用分析。使用三維結(jié)構(gòu)顯示軟件Pymol[29]對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化展示。

2 結(jié)果與討論

2.1 TLR4-MD-2 蛋白性質(zhì)

TLR4-MD-2 蛋白的親疏水性分布如圖2 所示。

圖2 TLR4-MD-2 親疏水性分布Fig.2 Hydrophilic and hydrophobic distribution of TLR4-MD-2

圖2 中紅色代表疏水性區(qū)域，顏色越深代表疏水性越強(qiáng)。由圖2 可知，TLR4 結(jié)合口袋呈現(xiàn)親水性特征（位置1 附近），為經(jīng)典底物L(fēng)PS 的多糖結(jié)合區(qū)。MD-2結(jié)合口袋（位置2 附近）形成大的疏水性結(jié)合腔，LPS的疏水性脂質(zhì)A 結(jié)構(gòu)域插入該結(jié)合腔中形成疏水性相互作用。因此，TLR4-MD-2 的底物結(jié)合口袋可以認(rèn)為由親水性區(qū)域和疏水性區(qū)域兩部分組成。TLR4-MD-2的表面靜電勢(shì)分布如圖3 所示，藍(lán)色、紅色和白色分別表示電正性、電負(fù)性和電中性，顏色越深，則表示電勢(shì)越強(qiáng)。

圖3 TLR4-MD-2 表面靜電勢(shì)分布Fig.3 Electrostatic potential distribution on the surface of TLR4-MD-2

在TLR4 的底物結(jié)合區(qū)（位置1）附近，TLR4 亞基作用界面呈現(xiàn)強(qiáng)的正電性（位置3 附近），TLR4 與MD-2的作用界面呈現(xiàn)強(qiáng)的電負(fù)性（位置4 附近）。TLR4 底物結(jié)合區(qū)本身主要呈正電性，LPS 帶有兩個(gè)磷酸基團(tuán)，具有一定的電負(fù)性，能夠和該正電區(qū)域進(jìn)行結(jié)合，其末端糖基向TLR4 與MD-2 作用界面的電負(fù)性區(qū)域延伸。MD-2 的疏水性口袋主要表現(xiàn)為電中性（位置2 附近）。此外，C 端TLR4 亞基作用界面也呈現(xiàn)比較強(qiáng)的電負(fù)性。

2.2 DOP 疏水性片段篩選結(jié)果

2.2.1 疏水寡糖片段分子庫(kù)

基于TLR4-MD-2 蛋白體系具有親水和疏水結(jié)合腔的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，對(duì)鐵皮石斛多糖片段的篩選分為疏水性寡糖片段的篩選和親水性寡糖片段的篩選。對(duì)于疏水性片段的篩選，使用組成石斛多糖的5 種主要糖殘基，組合構(gòu)建25 個(gè)二糖、125 個(gè)三糖以及625 個(gè)四糖共775 個(gè)疏水寡糖片段，具體如圖4 所示。

圖4 疏水寡糖片段分子庫(kù)示意圖Fig.4 Schematic diagram of the molecular library of hydrophobic oligosaccharide fragments

2.2.2 疏水片段分子對(duì)接

將處理好的775 個(gè)DOP 寡糖分別對(duì)接到TLR4-MD-2 的活性口袋中，對(duì)接盒子的中心坐標(biāo)為-7.334、-12.03、-23.18 ?，外部盒子的長(zhǎng)寬高分別為30、42、33 ?，內(nèi)部盒子的長(zhǎng)寬高分別為10、22、13 ?。表1 展示了二糖、三糖和四糖中對(duì)接排名前十的結(jié)果。對(duì)接打分是對(duì)對(duì)接的寡糖片段與蛋白匹配程度的評(píng)價(jià)指標(biāo)，以判斷兩者的結(jié)合強(qiáng)弱。

表1 疏水片段庫(kù)對(duì)接結(jié)果Table 1 Docking results of hydrophobic fragment library

由表1 可知，隨著糖殘基的增加，結(jié)合強(qiáng)度逐漸增大，說(shuō)明分子量對(duì)結(jié)合強(qiáng)度有一定的影響。其中結(jié)合最強(qiáng)片段為一個(gè)四糖片段，結(jié)合能為-8.06 kcal/mol，由M-2，3、M-2、3、M-2、G 組成，含有3 個(gè)乙酰基取代的甘露糖片段。

2.2.3 最佳疏水片段與TLR4-MD-2 的相互作用

最佳四糖片段與TLR4- MD-2 的相互作用見(jiàn)圖5。

圖5 最佳四糖片段與TLR4- MD-2 的相互作用Fig.5 Interaction between the optimal tetrasaccharide fragment and TLR4-MD-2

由圖5 可知，DOP 寡糖已插入TLR4-MD-2 的活性位點(diǎn)，結(jié)合在MD-2 的疏水性口袋內(nèi)。與氨基酸殘基Leu 61、Leu 78、Ile 80、Tyr 102、Ser 118、Ser 120、Val 135和Arg 264 形成相互作用。其中，與氨基酸殘基Tyr 102、Ser 118、Ser 120 和Arg 264 之間存在氫鍵相互作用，與氨基酸殘基Leu 61、Leu 78、Ile 80、Tyr 102 和Val 135 之間通過(guò)疏水形成相互作用。

2.3 DOP 親水性片段篩選結(jié)果

考慮到葡萄糖和甘露糖的親水性，在得到的最佳疏水性四糖片段的基礎(chǔ)上引入3~4 個(gè)葡萄糖和3 個(gè)甘露糖，組合得到8 個(gè)七糖和16 個(gè)八糖多糖片段。同樣參照經(jīng)典底物L(fēng)PS 的結(jié)合模式設(shè)置對(duì)接盒子進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 最佳七糖和八糖片段分子對(duì)接結(jié)果Table 2 Molecular docking results of the optimal heptasaccharide and octasaccharide fragments

表2 表明，最佳八糖片段對(duì)接打分為-7.89 kcal/mol，最佳七糖片段對(duì)接打分為-8.2 kcal/mol。八糖與TLR4-MD-2 的結(jié)合能力較弱且不能對(duì)接至親水區(qū)域，通過(guò)對(duì)比七糖片段發(fā)現(xiàn)，在可對(duì)接區(qū)域內(nèi)，增加的糖環(huán)并未再進(jìn)一步增強(qiáng)與親水性結(jié)合區(qū)域的結(jié)合強(qiáng)度，反而由于去溶劑化等不利因素，造成結(jié)合能下降。因此，使用七糖來(lái)進(jìn)一步研究鐵皮石斛多糖與TLR4-MD-2 的可能作用機(jī)制。

2.4 分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果

為進(jìn)一步研究七糖片段與TLR4-MD-2 的可能作用機(jī)制，對(duì)七糖與TLR4-MD-2 的復(fù)合物進(jìn)行3 條平行的1 000 ns 長(zhǎng)時(shí)分子動(dòng)力學(xué)模擬。對(duì)3 條軌跡后900 ns共225 000×3 幀結(jié)構(gòu)的分簇分析，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 七糖兩種結(jié)合模式對(duì)比Fig.6 Comparison of two binding modes of heptasaccharides

由圖6 可知，在得到的代表性構(gòu)象中，七糖有兩種結(jié)合模式：在第一種結(jié)合模式中（圖6 黃色底物），最佳四糖片段結(jié)合在MD-2 的疏水口袋中，親水性的3 個(gè)葡萄糖結(jié)合在TLR4 正電性底物結(jié)合區(qū)，末端糖基像經(jīng)典底物L(fēng)PS 一樣向TLR4 與MD-2 作用界面的電負(fù)性區(qū)域延伸（圖3 位置4 附近）。第二種結(jié)合模式中（圖6 青色底物），四糖片段同樣位于MD-2 的疏水口袋中，3 個(gè)葡萄糖片段經(jīng)TLR4 電正性底物結(jié)合區(qū)向電正性的TLR4 亞基作用界面延伸（圖3 位置3 附近）。其中，第一種結(jié)合模式為優(yōu)勢(shì)結(jié)合模式，在整個(gè)動(dòng)力學(xué)過(guò)程中占到70.8%，與經(jīng)典底物L(fēng)PS 結(jié)合模式類(lèi)似。

為了進(jìn)一步研究?jī)?yōu)勢(shì)結(jié)合模式中DOP 寡糖片段與TLR4-MD-2 的作用機(jī)制，進(jìn)行結(jié)合自由能和分解殘基結(jié)合能的計(jì)算分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 對(duì)七糖片段結(jié)合有重要貢獻(xiàn)的氨基酸殘基Table 3 Amino acid residues that contribute significantly to the binding of the heptasaccharide fragment

表3 顯示，找到的DOP 七糖片段與TLR4-MD-2有較強(qiáng)的相互作用，結(jié)合能達(dá)到-67.528 9 kcal/mol。對(duì)該模式的分解殘基結(jié)合能計(jì)算找到了對(duì)七糖結(jié)合有重要貢獻(xiàn)的氨基酸殘基，其相互作用見(jiàn)圖7。

圖7 最佳七糖片段與TLR4-MD-2 的相互作用Fig.7 Interaction of the optimal heptasaccharide fragment with TLR4-MD-2

由圖7 可知，氨基酸殘基R90、S120、F121、S118、R264、K122、E439 及M414 主骨架與七糖底物形成氫鍵作用（圖7 洋紅色虛線表示）。殘基F121、L78、I80、F119、I124、K58、F151、L61、C133、F440、I52、F126、L60和V135 與底物形成疏水相互作用（圖7 灰色虛線表示）。由此可知，鐵皮石斛多糖主要通過(guò)氫鍵和疏水作用與TLR4-MD-2 進(jìn)行相互作用，發(fā)揮免疫活性。

3 結(jié)論

在本研究中，根據(jù)對(duì)TLR4-MD-2 結(jié)合腔的親疏水性分析，將DOP 寡糖的研究分為疏水片段篩選和親水片段篩選兩個(gè)部分。通過(guò)分子對(duì)接和動(dòng)力學(xué)模擬找到了與TLR4-MD-2 有較強(qiáng)結(jié)合能力的七糖DOP 片段，具有與經(jīng)典底物脂多糖相似的結(jié)合模式。其中的疏水性四糖片段結(jié)合在MD-2 的疏水結(jié)合腔，親水性三糖片段結(jié)合在電正性區(qū)域。作用機(jī)制分析表明，DOP 和TLR4-MD-2 主要通過(guò)氫鍵和疏水作用力進(jìn)行相互作用，其中疏水四糖片段帶有的4 個(gè)乙酰基，可能是DOP具有潛在免疫活性的關(guān)鍵。