高效液相色譜法測定試驗(yàn)雞肉中水飛薊賓含量

侯澤樺，李羨鈺，孫雯可，謝艾伶，劉全瑞，劉鼎闊，于曉雪 ，李留安

（1.天津農(nóng)學(xué)院 動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津市農(nóng)業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300392；2.鼎正新興生物技術(shù)（天津）有限公司 天津市生物飼料添加劑企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300383）

水飛薊賓（silybin，SLB）是菊科植物水飛薊果實(shí)提取物的主要生物活性物質(zhì)，是天然的黃酮木質(zhì)素類化合物[1]，其已有上千年的藥用歷史。研究表明，水飛薊賓具有保肝、抗腫瘤、抗炎、抗代謝功能失調(diào)等多種生物活性功能[2-3]，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域。雞肉具有低脂肪、高蛋白的特點(diǎn)，是國民膳食中肉類的重要組成部分。功能性食品是指具有特定營養(yǎng)保健功能的食品，即具有調(diào)節(jié)機(jī)體功能、不以治療為目的的食品。功能性食品形式多種多樣，如飲料、沖劑、烘焙制品等[4]，雞肉也可作為功能性食品的一種。檢測功能性食品中活性物質(zhì)含量對于保證營養(yǎng)供給和品質(zhì)檢測是非常必要的。目前國內(nèi)外關(guān)于水飛薊賓含量的測定研究多集中在植物提取、醫(yī)藥等方面。石萬銀等[5]利用高效液相色譜法測定得到水飛薊提取物中水飛薊賓的含量不低于20%。周旖璇等[6]通過建立高效液相色譜法測定大鼠血漿中水飛薊賓的含量，測得水飛薊賓在大鼠體內(nèi)的消除半衰期為（9.9±0.9）h。但目前國內(nèi)外關(guān)于動物產(chǎn)品中水飛薊賓含量檢測方法未見報道。本研究通過在雞基礎(chǔ)飼糧中添加水飛薊賓，獲得富含水飛薊賓的雞肉，并建立高效液相色譜法檢測試驗(yàn)雞肉中水飛薊賓含量的方法，以期為后續(xù)開發(fā)含水飛薊賓的功能性雞肉及其有效含量檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)雞肉樣品：天津農(nóng)學(xué)院實(shí)訓(xùn)基地。將135 只雞隨機(jī)分為3 組，每組45 只。第1 組為對照組，飼喂基礎(chǔ)飼料；第2 組在基礎(chǔ)日糧中添加0.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的水飛薊賓；第3 組在基礎(chǔ)日糧中添加1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的水飛薊賓。30 d 后每組隨機(jī)抽取10 只雞進(jìn)行屠宰采集雞肉，置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

水飛薊素（純度≥98%）：陜西云奇生物科技有限公司；水飛薊賓標(biāo)準(zhǔn)品（純度95.7%）：中國食品藥品檢定研究院；甲醇（色譜純）：德國Merck 公司；乙酸乙酯（分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（1260）：安捷倫科技有限公司；超聲波清洗機(jī)（SB-100D）：寧波新芝生物科技股份有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（IKA RV 10）：上海予申儀器有限公司；多用途渦旋混合器（VORTEX-6）：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；電子分析天平（FB223）：上海舜寧恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件的優(yōu)化

參照《中華人民共和國藥典》2020 版一部[7]中水飛薊賓含量測定方法的高效液相色譜條件進(jìn)行優(yōu)化。色譜柱：Agilent-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為水∶甲醇= 43∶57、47∶53、53∶47（體積比）；流速：0.65、0.70 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：288 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取水飛薊賓標(biāo)準(zhǔn)品20 mg 于50 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到400 μg/mL 水飛薊賓溶液，取400 μg/mL 水飛薊賓溶液250 μL 于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻放置備用，所得水飛薊賓標(biāo)準(zhǔn)儲備液濃度為10 μg/mL。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：依次吸取0.1、0.5、1.0、2.5、5.0 mL 水飛薊賓標(biāo)準(zhǔn)儲備液于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，得到系列濃度為0.1、0.5、1.0、2.5、5.0 μg/mL的水飛薊賓標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將配制好的0.1、0.5、1.0、2.5、5.0 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液參照1.3.1 的液相色譜條件進(jìn)行分析，以水飛薊賓的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到水飛薊賓的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程。

1.3.4 精密度測定

用1 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作液，重復(fù)測定6 次，計算精密度。

1.3.5 樣品前處理

稱10 g 雞肉樣品剪碎置于50 mL 離心管中，加入20 mL 乙酸乙酯，渦旋混勻，超聲30 min，以10 000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)濾紙過濾置于圓底燒瓶中，90 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，2 mL 甲醇復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾，待高效液相色譜儀檢測。

1.3.6 回收率測定

精密稱取10 g 空白雞肉樣品9 份，將濃度為0.5、1.0、2.5 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作液分別加入樣品中，每個濃度3 份，每份加1 mL，按1.3.5 方法進(jìn)行處理，測得峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，算出實(shí)際濃度，計算回收率。

1.3.7 雞肉樣品測定

按照1.3.5 方法對試驗(yàn)雞肉樣品進(jìn)行處理，按照1.3.1 色譜條件進(jìn)行測定。樣品中的水飛薊賓含量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程進(jìn)行換算。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，用單因子方差分析（one-way analysis of variance，One-way ANOVA），并采用Duncan法進(jìn)行多重比較，進(jìn)行組間顯著性分析，P<0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

色譜基本條件的優(yōu)化見表1。

由表1 可知，有機(jī)相比例越大，保留時間越短，在水飛薊賓A、B 兩峰分離完全的前提下，當(dāng)水與甲醇體積比為47∶53 時，保留時間最短。當(dāng)流速提高到0.70 mL/min，由于柱壓過大，檢測程序終止。為使兩峰完全分離，準(zhǔn)確定量檢測水飛薊賓，最終選用色譜條件為水∶甲醇=47∶53（體積比），流速0.65 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長288 nm，進(jìn)樣量20 μL。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

水飛薊賓標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 水飛薊賓標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of silybin

由圖1 可知，水飛薊賓標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=95.16x-0.875 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6，表明水飛薊賓標(biāo)準(zhǔn)品濃度在0.1~5.0 μg/mL 時與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3 檢出限和定量限

以峰高為3 倍平均信噪比時的濃度為檢出限（limit of detection，LOD），以峰高為10 倍平均信噪比時的濃度為定量限（limit of quantitation，LOQ），計算得本方法的LOD 和LOQ 分別為0.022 μg/g 和0.073 μg/g。

2.4 精密度測定

精密度試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Precision test results

由表2 可知，此方法相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為2.89%，表明精密度良好。

2.5 回收率測定

樣品加標(biāo)回收率如表3 所示。

表3 樣品加標(biāo)回收率Table 3 Recovery rate of samples with added standard substance

由表3 可知，水飛薊賓的平均回收率在88.45%~104.34% 之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差最大為2.94%。該結(jié)果表明，本檢測方法具有良好的回收率。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)品和雞肉樣品色譜圖

水飛薊賓標(biāo)準(zhǔn)品和試驗(yàn)樣品色譜圖見圖2。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品色譜圖Fig.2 Chromatogram of standard substance and sample

由圖2 可知，試驗(yàn)雞肉中水飛薊賓色譜峰的分離情況和峰形良好，對照雞肉樣品中無目的峰。水飛薊賓由水飛薊賓a 和水飛薊賓b 兩個非對映異構(gòu)體等比例組成，為雙峰。

2.7 試驗(yàn)雞肉樣品水飛薊賓含量測定結(jié)果

按照1.3.5 和1.3.1 的方法對試驗(yàn)雞肉進(jìn)行前處理和測定，試驗(yàn)雞肉樣品水飛薊賓含量測定結(jié)果如圖3所示。

圖3 高效液相色譜法檢測試驗(yàn)雞肉中水飛薊賓含量Fig.3 Determination of silybin in experimental chicken by HPLC

由圖3 可知，對照組雞肉中未檢測出水飛薊賓，0.5% 試驗(yàn)組雞肉中水飛薊賓平均含量為（0.167±0.010）μg/g，1.0% 試驗(yàn)組雞肉中水飛薊賓平均含量為（0.302±0.033）μg/g，結(jié)果表明，在日糧中添加的水飛薊賓能夠在雞肉中富集，且富集效果與添加比例有關(guān)，1.0% 試驗(yàn)組含量顯著高于0.5% 試驗(yàn)組（P<0.05）。

3 討論與結(jié)論

水飛薊素的護(hù)肝、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性功能，使其在保健品、醫(yī)藥行業(yè)中被廣泛應(yīng)用。自我國養(yǎng)殖業(yè)全面禁抗后，水飛薊素在畜牧業(yè)中展現(xiàn)出較好的應(yīng)用前景。有研究表明，在飼糧中添加水飛薊素可有效促進(jìn)畜禽生長，維護(hù)機(jī)體健康，有利于抵抗各種不良應(yīng)激反應(yīng)[8-9]。Bendowski 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在肉雞的飲用水中添加水飛薊提取物可促進(jìn)機(jī)體健康，提高生產(chǎn)性能，血清抗氧化能力更強(qiáng)，試驗(yàn)組傳染性法氏囊炎發(fā)生率顯著低于對照組。上述研究均為開發(fā)水飛薊賓作為畜禽飼料添加劑提供了理論基礎(chǔ)。此前有在雞肉中成功富集硒元素的試驗(yàn)，朱梅芳等[11]在靈山土雞日糧中使用自主配制的紅棗富硒飼料，獲得了富硒雞肉和雞蛋，且改善了雞肉和雞蛋的風(fēng)味。也有關(guān)于水飛薊賓在動物內(nèi)臟中分布的研究，李秋紅等[12]通過給大鼠靜脈注射水飛薊賓葡甲胺鹽注射液后，以叔丁基甲醚為提取劑從大鼠心、肝、脾、肺、腎組織勻漿中均檢測到了水飛薊賓，且在體內(nèi)分布的濃度大小順序依次為肺、肝、心、腎、脾。但由于水飛薊賓具有高度疏水性和非電離性的化學(xué)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致水飛薊賓水溶性差，口服生物利用率低[13]，推測其導(dǎo)致水飛薊賓在機(jī)體內(nèi)富集效率較低。通過將水飛薊賓制成納米晶體，有效改善了藥物在體內(nèi)的吸收，提高了生物利用度[14]。

本試驗(yàn)通過在雞基礎(chǔ)飼糧中添加0.5%、1.0% 的水飛薊賓來獲得試驗(yàn)雞肉樣品，結(jié)合水飛薊賓易溶于有機(jī)溶劑的特性，以乙酸乙酯作為提取試劑對試驗(yàn)雞肉進(jìn)行預(yù)處理，建立了一種高效液相色譜測定試驗(yàn)雞肉中水飛薊賓含量的方法，在色譜條件為流動相（水∶甲醇=47∶53，體積比）、流速0.65 mL/min、柱溫30 ℃時，可在飼糧添加水飛薊賓后獲得的試驗(yàn)雞肉中檢測出水飛薊賓，此方法操作簡便、定量準(zhǔn)確、所出色譜峰峰型良好，精密度和回收率較高，為水飛薊賓在雞肉中的含量測定提供了方法參考。