SEMA4D修飾鈦表面通過巨噬細胞調控內皮細胞功能的研究

周潔儀,張建蘭,謝玲玲,柳 姚,邱 憬

鈦及鈦合金材料因其良好的化學穩(wěn)定性和生物相容性,被視為“親生物金屬”之一,被廣泛應用于口腔醫(yī)學領域[1-3]。近年來,種植義齒逐漸成為許多缺牙患者的首選修復方案[4-5]。在種植治療中,種植體與周圍骨組織之間形成良好的骨結合是治療成功的關鍵,但種植體周圍軟組織的修復和維持同樣具有不可忽視的關鍵作用。軟組織緊密附著在種植基臺表面,在種植體穿齦處形成良好的軟組織封閉,作為保護下方牙槽骨的生物屏障,防止細菌侵入,為骨改建提供良好的微環(huán)境,是種植體周圍組織保持長期健康和穩(wěn)定的基礎[6-8]。種植手術后,種植體周圍軟組織是在局部軟硬組織發(fā)生創(chuàng)傷后開始愈合。在生物材料存在的條件下,多種細胞協(xié)作產生一系列的炎癥反應、血管生成以及新組織形成[9]。巨噬細胞在適當條件下可以轉化為M1型促進炎癥反應或轉化為M2型引導組織修復[10],而內皮細胞主導的血管生成能夠為組織再生提供必要的氧氣和營養(yǎng)物質[11]。在此過程中,種植體周圍的炎癥反應與血管生成相輔相成,共同構建有利于組織再生修復的生理微環(huán)境。

信號素家族第4組成員SEMA4D,其高親和力受體PlexinB1多表達于非淋巴細胞如神經細胞和內皮細胞,低親和力受體CD72多表達于淋巴細胞如T細胞、B細胞、DC細胞、巨噬細胞等,在上調血管生成和調節(jié)免疫反應中發(fā)揮重要作用[12-13]。在前期研究中,我們已成功采用堿熱處理和自組裝技術制備出SEMA4D修飾鈦表面,并通過構建內皮細胞-巨噬細胞間接共培養(yǎng)模型,證實其直接成血管及間接抗炎作用[14]。考慮到內皮細胞和巨噬細胞表面均表達SEMA4D受體,并且細胞之間存在相互作用,故本研究擬以SEMA4D修飾鈦表面為基礎,構建巨噬細胞-內皮細胞間接共培養(yǎng)模型,探究其直接抗炎和間接成血管作用,更全面地分析SEMA4D修飾鈦表面內皮細胞和巨噬細胞間的交互作用,探索其促進軟組織愈合的潛力,為未來實現(xiàn)臨床轉化或新一代功能化種植體表面的研發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與設備

純鈦片(99.5%,寶雞鈦業(yè),中國),SiC砂紙(鷹牌,中國),氫氧化鈉(國藥,中國),PBS(Gibco,美國),多聚左旋賴氨酸(PLL,上海源葉,中國),牛血清白蛋白(BSA,廣州賽國,中國),SEMA4D(武漢華美生物,中國),小鼠源性巨噬細胞系RAW264.7、小鼠腦血管內皮瘤細胞系bEnd.3(中國科學院細胞庫,上海,中國),胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素溶液、0.25%胰蛋白酶-EDTA(Gibco,美國),CCK-8試劑盒(碧云天,中國),總RNA快速提取試劑盒(北京百泰克,中國),引物(上海生工,中國),PrimeScript RT Master Mix(Takara,日本),SYBR Premix ExTaqⅡ(Takara,日本),恒溫水浴箱(國華電器,中國),場發(fā)射掃描電子顯微鏡(LEO,德國),JC2000D接觸角測量儀(Powereach,中國),細胞恒溫培養(yǎng)箱(Thermo,美國),超凈工作臺(Thermo,美國),多功能酶標儀(MD Spectramax 190,美國),QuantStudioTM7 Flex System(Applied Biosystem,美國),DM4000正置熒光顯微鏡(Leica,德國),DMILLED倒置顯微鏡(Leica,德國)。

1.2 樣品制備及表征

使用碳化硅砂紙將純鈦試件逐級打磨、拋光、洗滌和干燥。以光滑鈦表面為對照組,記為Ti。將光滑鈦浸入2 mol/L氫氧化鈉溶液,80 ℃條件下水浴加熱12 h,記為Ti-OH。將Ti-OH置于2.5 mg/mL多聚左旋賴氨酸(PLL)溶液中,于4 ℃避光過夜孵育,記為Ti-PLL。根據(jù)說明將SEMA4D稀釋成不同濃度(50、100、200 ng/mL),并與相同體積的10 mg/mL BSA溶液混合,于37 ℃孵育至少1 h。最后將Ti-PLL鈦片置入不同濃度的SEMA4D-BSA溶液中(25、50、100 ng/mL),于37 ℃下孵育至少3 h,分別記為Ti-4D25、Ti-4D50和Ti-4D100。每組隨機選擇3個試件,采用場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM)觀察表面微形貌,使用JC2000D接觸角測量儀檢測材料表面能。

1.3 細胞培養(yǎng)

將RAW264.7細胞和bEnd.3細胞復蘇后,加入DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素),靜置于37 ℃、5% CO2的恒溫加濕培養(yǎng)箱中。每2～3 d更換一次新鮮的培養(yǎng)基。當達到80%的細胞融合時,培養(yǎng)的細胞傳代。RAW264.7每3 d傳代一次,bEnd.3每5 d傳代一次。

1.4 試件表面巨噬細胞的增殖活性檢測

將RAW264.7(2×103個/孔)接種到96孔板中4組試件表面。培養(yǎng)1、2、3 d后,棄培養(yǎng)液,PBS清洗,每孔加入110 μL含有10% CCK-8試劑的完全培養(yǎng)基,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育2 h,多功能酶標儀測定各孔吸光度值(波長=450 nm)。每組隨機檢測3個樣本并計算平均值。

1.5 RT-qPCR檢測巨噬細胞的炎癥基因和VEGF表達水平

將RAW264.7(4×105個/孔)接種到6孔板中4組試件表面,培養(yǎng)48 h后,棄培養(yǎng)液,PBS清洗,采用試劑盒提取巨噬細胞的總RNA,加入PrimeScript RT Master Mix逆轉錄為cDNA,將cDNA與相應的引物和SYBR Premix Ex Taq Ⅱ混合后,以GAPDH為內參,檢測TNF-α、IL-6和IL-1β炎癥基因的表達水平和VEGF表達水平,基因引物序列見表1。通過2-ΔΔCt法計算基因表達的相對量。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.6 巨噬細胞/內皮細胞間接共培養(yǎng)模型的構建

將RAW264.7(4×105個/孔)接種到6孔板中4組試件表面,培養(yǎng)48 h后,取培養(yǎng)液,4 ℃,1 000 r/min,10 min離心至少3次,將部分上清液以1∶1的比例與完全培養(yǎng)基混合,配制成條件培養(yǎng)基,分別記為Ti-CM、4D25-CM、4D50-CM和4D100-CM。將另一部分上清液1∶1與無血清培養(yǎng)基混合配制條件培養(yǎng)基,分別記為Ti-CM0、4D25-CM0、4D50-CM0和4D100-CM0。

1.7 內皮細胞增殖活性檢測

將bEnd.3(3×103個/孔)接種到96孔板。用條件培養(yǎng)基Ti-CM、4D25-CM、4D50-CM和4D100-CM分別培養(yǎng)1、3、5 d后,棄培養(yǎng)液,PBS清洗,每孔加入110 μL含有10% CCK-8試劑的完全培養(yǎng)基,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育2 h,多功能酶標儀測定各孔吸光度值(波長=450 nm)。每組隨機檢測3個樣本并計算平均值。

1.8 內皮細胞黏附觀察

將bEnd.3(1×104個/孔)接種到置于12孔板內的細胞爬片上,條件培養(yǎng)基Ti-CM、4D25-CM、4D50-CM和4D100-CM分別培養(yǎng)8 h后,4%多聚甲醛室溫固定30 min,鬼筆環(huán)肽染色30 min,DAPI染色3 min后,通過倒置熒光顯微鏡觀察各組細胞黏附鋪展情況。

1.9 內皮細胞劃痕實驗

用Marker筆在6孔板背后劃好均勻的橫線作標記,將bEnd.3(4×105個/孔)接種到此6孔板中。保證細胞密度達到90%后用200 μL槍頭盡量垂直于細胞平面沿線劃痕,PBS清洗后,分別加入條件培養(yǎng)基Ti-CM0、4D25-CM0、4D50-CM0和4D100-CM0進行培養(yǎng)。選取0、12、24 h進行顯微鏡觀察細胞遷移并拍照。

1.10 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對各組試件的檢測結果進行方差齊性檢驗,顯示數(shù)據(jù)方差齊,進行單因素方差分析和SNK多重比較,當P<0.05時,認為具有統(tǒng)計學差異。采用GraphPad Prism 5軟件繪制圖表,使用字母標記法進行標注。

2 結 果

2.1 表面微形貌

圖1為掃描電子顯微鏡觀察4組試件的表面微形貌。對照組鈦表面相對光滑,高倍鏡下可見在處理過程中產生的機械摩擦痕跡。堿熱處理后鈦表面表現(xiàn)出疏松的多孔結構,經過SEMA4D溶液處理后試件表面形成一層有機薄膜,并且隨著SEMA4D濃度的增加,覆蓋的薄膜越來越致密。

圖1 掃描電子顯微鏡觀察4組試件的表面微形貌( ×40 000)Fig.1 Scanning electron microscope images of surface morphology of four specimens( ×40 000)

2.2 表面親水性

表面親水性檢測包括水接觸角和表面能,結果見圖2。結果顯示,Ti、Ti-4D25、Ti-4D50和Ti-4D100 4組試件的水接觸角逐漸減小,其表面能平均值分別為35.6、54.9、62.3、64.9 mN/m,呈逐漸增大趨勢。由此可見,與光滑鈦相比,改性后的鈦表面具有更好的親水性,并且隨著SEMA4D濃度的增加,表面親水性逐漸不斷增強。

2.3 試件表面巨噬細胞的增殖活性

RAW264.7細胞在4組試件表面增殖活性的CCK-8檢測結果如圖3所示。第1天未見明顯差異,第2天實驗組RAW264.7細胞的增殖活性高于對照組,并具有顯著性差異,尤其是Ti-4D50組和Ti-4D100組,第3天Ti-4D100組RAW264.7細胞的增殖活性最佳。

標注不同字母表示有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

2.4 試件表面巨噬細胞的炎性表達和VEGF表達

RT-qPCR檢測4組試件表面RAW264.7細胞中TNF-α、IL-6和IL-1β的基因表達水平,結果如圖4所示。與光滑鈦對照組相比,SEMA4D處理組RAW264.7細胞中TNF-α、IL-1β、IL-6的表達量均呈下降趨勢,尤其是Ti-4D100組。同時,SEMA4D處理組的VEGF表達均優(yōu)于光滑鈦對照組,且Ti-4D100組的表達量最多。

標注不同字母表示有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

2.5 內皮細胞的增殖活性

Ti-CM、4D25-CM、4D50-CM和4D100-CM培養(yǎng)bEnd.3細胞的CCK-8檢測結果如圖5所示。每組細胞數(shù)量均隨時間變化而增長,第1、3、5天各組間均未見明顯差異。

標注相同字母表示無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

2.6 內皮細胞的黏附能力

4組條件培養(yǎng)基培養(yǎng)8 h后bEnd.3細胞的黏附形態(tài)如圖6所示。鏡下可見SEMA4D處理組試件表面細胞的鋪展面積更大,并且顯示出更清晰的細長肌動蛋白絲。

圖6 條件培養(yǎng)基培養(yǎng) 8 h后的bEnd.3細胞黏附鋪展形態(tài)Fig.6 Adhesion and spreading of bEnd.3 cells after 8 hours of conditional medium culture

2.7 內皮細胞的遷移能力

4組條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的bEnd.3細胞遷移能力檢測結果如圖7所示。12 h時,Ti、Ti-4D25和Ti-4D50三組的愈合率未見明顯差異,但Ti-4D100組具有顯著優(yōu)勢。24 h后,相較于光滑鈦對照組,SEMA4D處理組均表現(xiàn)出優(yōu)勢,且Ti-4D100組的愈合率仍為最高。

標注不同字母表示有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

3 討 論

基于本課題組的前期研究結果[14],本實驗通過堿熱法+自組裝技術將SEMA4D固定在純鈦表面,初步證實其具有一定的促進血管生成和免疫調節(jié)作用。生物材料的表面親水性是蛋白吸附和細胞黏附的決定性因素之一[15-16]。接觸角測量結果表明,與光滑鈦相比,SEMA4D修飾鈦表面具有更好的親水性,這有利于組織愈合初期蛋白質的吸附和細胞反應。隨著SEMA4D濃度的增加,親水性也隨之增強,這可能歸因于表面改性后負載的BSA[17]。掃描電鏡觀察顯示,SEMA4D修飾鈦表面組呈現(xiàn)出多孔結構且表面被有機薄膜覆蓋。隨著更多SEMA4D-BSA復合物組裝至堿化鈦表面,覆蓋的薄膜變得更加致密,表面負載的BSA不斷增加,故而親水性也隨之改善。

生物材料表面的理化特性可參與調控細胞中基因表達的級聯(lián)激活,進而影響細胞的生物學行為[18-19]。大量研究證實,中度親水性的生物材料表面可促進細胞生長,表現(xiàn)出優(yōu)良的生物相容性[15,20]。CD72作為SEMA4D的低親和力受體,多表達于巨噬細胞等免疫細胞[21-22]。本研究在SEMA4D修飾鈦表面直接接種巨噬細胞,力圖探索此改性鈦表面的理化特性對巨噬細胞生物學行為的影響。根據(jù)CCK-8結果,SEMA4D修飾鈦表面可以顯著提高RAW264.7巨噬細胞的增殖能力,并且以Ti-4D100組為最佳。通過PCR檢測各組試件表面巨噬細胞的炎性表達顯示,與光滑鈦相比,SEMA4D修飾鈦表面巨噬細胞的促炎因子基因表達降低,但降低程度并未呈現(xiàn)出嚴格的SEMA4D劑量依賴性。據(jù)研究報道,SEMA4D能夠抑制單核細胞遷移,也可促進外周血單核細胞極化為M2表型[23-25]。SEMA4D通過與受體CD72相互作用參與免疫調節(jié),且SEMA4D的免疫調節(jié)作用依賴于生物學環(huán)境[26]。本實驗中,SEMA4D與BSA自組裝后傾向于發(fā)揮積極的免疫調節(jié)作用,SEMA4D濃度為100 ng/mL時最佳。PCR檢測巨噬細胞的VEGF表達結果顯示,SEMA4D組對其分泌具有促進作用。SEMA4D與受體CD72結合后通過其尾部的ITIM基序募集蛋白酪氨酸磷酸酶SHP1,通過誘導酪氨酸去磷酸化和信號蛋白失活來抑制免疫細胞活化[27]。同時,酪氨酸磷酸酶SHP1在缺氧條件下可以調控HIF-1α的表達,進而影響VEGF的生成[28]。巨噬細胞分泌的血管內皮生長因子可以作用于內皮細胞表面的VEGF受體,促進內皮細胞存活、遷移和血管形成等,以發(fā)揮免疫調節(jié)和組織修復的重要作用。

本課題組在前期通過構建內皮/巨噬細胞間接共培養(yǎng)模型,驗證了SEMA4D修飾鈦表面可以通過內皮細胞間接促進巨噬細胞的抗炎表達。由于生理環(huán)境下生物材料與細胞、細胞與細胞之間都是相互作用的[29],間接共培養(yǎng)模型可以更好地模擬體內情況?；谶@一點,前述研究結果已表明SEMA4D修飾鈦表面具有直接的正向免疫調控作用和間接促進巨噬細胞分泌VEGF的效應,本實驗則進一步構建巨噬/內皮細胞間接共培養(yǎng)模型,以完善SEMA4D修飾鈦表面促血管-抗炎雙重作用的表型研究。CCK-8結果顯示,各組條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的內皮細胞隨時間推移均呈現(xiàn)出細胞數(shù)量的顯著增長,表明無細胞毒性作用。文獻證據(jù)表明,當巨噬細胞炎癥表達降低并分泌內皮血管生長因子時,可以促進內皮細胞的遷移、黏附,從而改善受損血管的再內皮化[30]。鬼筆環(huán)肽染色實驗顯示,條件培養(yǎng)基培養(yǎng)8 h后SEMA4D處理組的內皮細胞鋪展更充分,而劃痕實驗結果顯示,24 h后SEMA4D處理組較對照組呈現(xiàn)顯著優(yōu)勢,且SEMA4D濃度為100 ng/mL時內皮細胞的遷移黏附能力最佳,該現(xiàn)象與文獻證據(jù)保持一致。

本研究通過體外實驗證實,SEMA4D修飾鈦表面不僅可直接改善巨噬細胞的炎性表達,還可通過巨噬細胞間接促進內皮細胞的運動能力。與本課題組的前期研究結果相結合,能初步解析SEMA4D修飾鈦表面內皮細胞和巨噬細胞間的交互作用表型,但其內在分子機制仍有待進一步探究。此外,關于種植體基臺的另一重要考量為細菌黏附。堿熱處理后鈦表面的粗糙化不可避免,但大量研究表明,材料表面的理化特征均會影響細菌的黏附及成膜行為,這些特征包括:形貌模式、粗糙度、親水性和表面功能性化學基團修飾等[31]。Singh等[32]研究認為,粗糙度的增大并非一定導致細菌黏附的增加,通常會存在一個臨界值。Whitehead等[33]則研究發(fā)現(xiàn),細菌形態(tài)也會影響其在不同粗糙度表面的黏附。因此,關于SEMA4D修飾鈦表面的細菌黏附及成膜行為亦有待后續(xù)的進一步探索。