羊肚菌菌種不同保藏方法保藏效果比較

查 波 王文麗 余文娟 崔文浩*

（1 衢州市農(nóng)業(yè)林業(yè)科學(xué)研究院，浙江衢州 324003；2 江山市長臺(tái)鎮(zhèn)經(jīng)濟(jì)生態(tài)辦公室，浙江衢州 324003；3 開化縣楊林鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)農(nóng)村辦公室，浙江衢州 324003）

截至2022年，浙江省衢州市羊肚菌栽培面積達(dá)113.33 hm2，產(chǎn)業(yè)規(guī)模位居浙江省前列。但當(dāng)?shù)厣a(chǎn)用菌種仍然為從四川省、山東省引進(jìn)的母種或原種，再由本地農(nóng)戶擴(kuò)繁為栽培種。羊肚菌菌種在保藏、流通環(huán)節(jié)極易發(fā)生老化退化現(xiàn)象[1-2]，存在減產(chǎn)或絕收的風(fēng)險(xiǎn)。因此如何保藏羊肚菌菌種以維持其活力成為衢州市羊肚菌產(chǎn)業(yè)升級(jí)的主要目標(biāo)。

研究表明：目前業(yè)界普遍采用的食用菌菌種保藏技術(shù)中，液氮超低溫保藏法、冷凍干燥法保藏真菌有很好的效果[3-4]，但需要專業(yè)設(shè)備，購買和使用成本高，一般菌種廠難以負(fù)擔(dān)。為此試驗(yàn)選擇幾種低溫保藏技術(shù)[5-6]，結(jié)合羊肚菌的特點(diǎn)選擇干子實(shí)體作為菌種保藏試驗(yàn)對(duì)象[7]，研究各保藏方法對(duì)羊肚菌菌種活力、菌絲生長速度及產(chǎn)量等的影響，通過比較分析從中篩選出簡便、經(jīng)濟(jì)、能有效保持菌種質(zhì)量的羊肚菌菌種保藏方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

（1）供試菌株。六妹羊肚菌M.sextelata栽培菌株，由四川菌益儂農(nóng)業(yè)科技有限公司提供。

（2）培養(yǎng)基及試劑。母種培養(yǎng)基為馬鈴薯瓊脂葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g、瓊脂粉20 g、葡萄糖20 g，水1 000 mL。原種、栽培種培養(yǎng)基均為小麥60%、木屑30%、腐殖土7%、石膏1.5%、石灰1.5%。礦物油（bioMerieux，SA生產(chǎn)），用前將礦物油裝入錐形瓶中，放入高壓滅菌鍋滅菌25 min，靜置沉淀3～5 d，60 ℃烘烤12 h，等內(nèi)部水分蒸發(fā)后，冷卻備用。無菌蒸餾水，將去離子水裝入錐形瓶中，放入高壓滅菌鍋滅菌25 min，冷卻備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 母種制備

1.2.1.1 組織分離

采收菌蓋未完全展開的幼嫩羊肚菌，確保子實(shí)體內(nèi)部與外界無接觸。在無菌環(huán)境下，用75%醫(yī)用酒精消毒子實(shí)體表面，切開子實(shí)體，挑取菌蓋和菌柄相連處的內(nèi)部菌肉，接入PDA平板，置于20 ℃培養(yǎng)室避光培養(yǎng)。

1.2.1.2 菌種純化

接種塊菌絲萌發(fā)后，挑取菌落尖端轉(zhuǎn)接到空白PDA平板，12～24 h后觀察菌絲形態(tài)，若菌絲為無色、細(xì)長、根根分明，可確定為羊肚菌母種。

1.2.2 5種羊肚菌菌種保藏方法

方法1：斜面保藏。無菌環(huán)境下將母種接種至斜面培養(yǎng)基上，用硅膠塞封口，置于20 ℃培養(yǎng)室避光培養(yǎng)。菌絲即將長滿斜面時(shí)，及時(shí)轉(zhuǎn)移到4 ℃冰箱內(nèi)保藏。

方法2：蒸餾水保藏。用6 mm打孔器在母種平板上取菌塊3～5塊，置于2 mL無菌凍存管中，加入1 mL無菌蒸餾水淹沒菌塊。蓋緊蓋子，用封口膜封口后，轉(zhuǎn)移到4 ℃冰箱內(nèi)保藏。

方法3：礦物油保藏。用6 mm打孔器在母種平板上取菌塊3～5塊，置于2 mL無菌凍存管中，加入1 mL礦物油淹沒菌塊。蓋緊蓋子，用封口膜封口后，轉(zhuǎn)移到4 ℃冰箱內(nèi)保藏。

方法4：烘干子實(shí)體保藏。選擇商品性好的羊肚菌子實(shí)體，采取熱風(fēng)烘干。初期溫度設(shè)定為35 ℃，烘3～4 h；中期按每小時(shí)升溫2～3 ℃達(dá)50 ℃，烘4～5 h；最后溫度上升至53～55 ℃，烘3～4 h。待子實(shí)體含水量下降至10%，完成烘烤。用密封袋將羊肚菌干菇密封，保藏于陰涼、干燥的環(huán)境中。

方法5：風(fēng)干子實(shí)體保藏。陰涼干燥環(huán)境下，選擇商品性狀好的羊肚菌子實(shí)體放在竹篩上，用吹風(fēng)機(jī)吹5～7 d，等子實(shí)體收縮固定，含水量下降至10%后完成風(fēng)干。用密封袋將干菇密封保藏。

1.2.3 菌種活化

1.2.3.1 方法1、2、3保藏的羊肚菌菌種的活化

無菌條件下接種至PDA平板中，于20 ℃避光培養(yǎng)。接種塊菌絲萌發(fā)后，挑取菌落尖端轉(zhuǎn)接到空白PDA平板培養(yǎng)基，觀察菌絲形態(tài)。

1.2.3.2 方法4、5羊肚菌干子實(shí)體的活化

用無菌風(fēng)吹30 min，放入無菌水中浸泡1 h。取出后用無菌吸水紙吸干表面水分，放入75%酒精中浸泡1 min后取出，蒸餾水漂洗2遍，吸干表面水分。用解剖刀切取0.5 cm×0.5 cm的菌塊，接種至空白平板上，于20 ℃避光培養(yǎng)。接種塊菌絲萌發(fā)后，挑取菌落尖端轉(zhuǎn)接到空白PDA平板培養(yǎng)基培養(yǎng)，觀察菌絲形態(tài)。

1.2.4 菌種菌絲生長速度測(cè)定

將活化后的羊肚菌菌種轉(zhuǎn)接至空白PDA平板后，觀察并記錄其萌發(fā)率，測(cè)定計(jì)算菌絲長速。菌絲長速以平板中羊肚菌菌絲直徑增長量除2再除以菌絲生長用時(shí)。每個(gè)處理重復(fù)3次。

待羊肚菌菌絲長滿平板后，用12 mm打孔器取菌塊5塊，接種至原種培養(yǎng)袋內(nèi)，待菌絲長至培養(yǎng)袋約三分之一時(shí)，劃線測(cè)定菌絲生長量。菌絲長速以栽培袋菌絲生長量除以菌絲生長用時(shí)。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.5 出菇試驗(yàn)

于衢州市農(nóng)業(yè)林業(yè)科學(xué)研究院東湖基地進(jìn)行栽培試驗(yàn)。

11月初，翻耕基地單體大棚內(nèi)土壤，耙平做畦。畦寬1 m，畦間溝寬50 cm，以畦面長度6 m為一個(gè)小區(qū)。2022年11月18日，待羊肚菌菌絲長滿栽培種栽培袋后，每個(gè)處理隨機(jī)播種3個(gè)小區(qū)，共播種15個(gè)小區(qū)。按照大田栽培模式進(jìn)行出菇管理。統(tǒng)計(jì)每小區(qū)的羊肚菌產(chǎn)量、單菇質(zhì)量、折干率等。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用WPS進(jìn)行記錄和差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同保藏方法保藏菌種轉(zhuǎn)接培養(yǎng)結(jié)果

試驗(yàn)分別在6月28日（保藏 3個(gè)月）、9月28日（保藏6個(gè)月）取出菌種，活化后轉(zhuǎn)接至空白母種培養(yǎng)基中觀察菌絲生長速度。由圖1可見，5種保藏方法的菌種萌發(fā)率均為100%，但保藏6個(gè)月菌種間菌絲生長速度有差異。由表1可知，保藏3個(gè)月后，方法4的菌絲生長速度顯著快于方法1，其他處理菌絲生長速度無顯著性差異；保藏6個(gè)月后，方法1、2、3的菌絲生長速度均顯著慢于3個(gè)月前，方法5的菌絲生長速度沒有顯著變化，方法4的菌絲生長速度最快（圖1），與方法1、2、3、5有顯著差異，且顯著快于保藏3個(gè)月的菌種。

圖1 5種保藏方法保藏羊肚菌菌種6個(gè)月后轉(zhuǎn)接PDA平板后萌發(fā)狀態(tài)

表1 不同保藏方法保藏菌種轉(zhuǎn)接培養(yǎng)結(jié)果

2.2 不同保藏方法保藏菌種轉(zhuǎn)接原種培養(yǎng)效果

觀察結(jié)果，5種保藏方法保藏菌種轉(zhuǎn)接原種培養(yǎng)基后均能萌發(fā)。菌絲生長速度的測(cè)定結(jié)果由表2可知，菌種保藏3個(gè)月轉(zhuǎn)接原種培養(yǎng)基后，原種菌絲生長速度5種方法間無顯著差異；菌種保藏6個(gè)月，方法1、2、3、5的原種菌絲生長速度均顯著慢于保藏3個(gè)月，方法4無顯著變化。5種保藏方法中，方法4的菌絲生長速度最快，且與方法1、2、3、5有顯著差異。方法3的菌絲生長速度最慢，且與方法4、5有顯著差異。

表2 不同保藏方法保藏菌種轉(zhuǎn)接原種培養(yǎng)基后培養(yǎng)結(jié)果

2.3 不同保藏方法保藏的羊肚菌菌種出菇試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，應(yīng)用方法4保藏的菌種現(xiàn)原基最早，方法1保藏的菌種原基形成最晚（圖2）；應(yīng)用方法1保藏的菌種產(chǎn)量最低，為138 g（/6 m2）。由圖2可見，應(yīng)用方法2、3保藏的菌種畦面能形成大量的原基，但大部分原基枯萎死亡，不形成子實(shí)體，產(chǎn)量低。應(yīng)用方法4保藏的菌種產(chǎn)量最高，為2 711 g（/6 m2），顯著高于其他保藏方法的菌種。應(yīng)用方法3保藏的菌種單菇質(zhì)量最大，但主要是畸形菇，經(jīng)濟(jì)性狀差。應(yīng)用方法4、5保藏的菌種鮮菇折干率較高，均為15.77%。

圖2 5種保藏方法保藏的羊肚菌菌種播種65 d后原基形成情況

表3 不同保藏方法菌種出菇試驗(yàn)結(jié)果

3 小結(jié)與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，PDA斜面保藏菌種方法方便簡單，但當(dāng)該方法保藏菌種超過6個(gè)月時(shí)，轉(zhuǎn)接后菌絲生長速度出現(xiàn)明顯下降，鮮菇產(chǎn)量、單菇質(zhì)量和折干率最低。說明此時(shí)羊肚菌菌種失去活力，不宜用于生產(chǎn)。推測(cè)原因是羊肚菌菌絲在4 ℃條件下仍然能緩慢生長，超過3個(gè)月后易發(fā)生老化退化現(xiàn)象。

方法2、方法3利用蒸餾水和礦物油隔離菌種和空氣接觸，創(chuàng)造缺氧環(huán)境，降低菌種代謝活動(dòng)。礦物油保藏的菌種活化培養(yǎng)菌絲生長速度最低，可能是礦物油對(duì)菌種萌發(fā)有影響。兩種方法保藏的羊肚菌菌種出菇試驗(yàn)中均表現(xiàn)羊肚菌子實(shí)體經(jīng)濟(jì)性狀差，說明蒸餾水、礦物油不宜用于長期保藏羊肚菌菌種。

烘干后羊肚菌子實(shí)體保藏6個(gè)月后，組織分離活化培養(yǎng)，菌絲生長速度較保藏3個(gè)月有所加快。從出菇試驗(yàn)看，現(xiàn)原基早，小區(qū)產(chǎn)量、折干率最高。可見，烘干法能有效保持羊肚菌活力，可用于羊肚菌菌種的較長期保藏。