栝樓根腐病鐮孢菌拮抗菌SJ1623發(fā)酵代謝物的抑制活性

余利 孟祥濤 陳甦 潘懷松 段海明

摘要 檢測(cè)了6株拮抗菌發(fā)酵上清液對(duì)栝樓根腐病菌的抑制活性，采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定優(yōu)勢(shì)拮抗菌不同接種量和發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵上清液抑菌活性的影響，測(cè)定了不同稀釋倍數(shù)的發(fā)酵上清液和脂肽粗提物對(duì)栝樓根腐病菌的抑制活性。結(jié)果表明，對(duì)栝樓根腐病菌抑制活性最高的拮抗菌為SJ1623，種子液培養(yǎng)時(shí)間為10 h，0.75%（體積比）的接種量效果較好；發(fā)酵上清液稀釋10倍對(duì)病菌的抑制率為87.6%，脂肽粗提物50倍稀釋液對(duì)病菌的抑制率為83.1%。

關(guān)鍵詞 栝樓根腐??；拮抗菌；發(fā)酵液；抑制活性

中圖分類號(hào) S435.67? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2024）03-0119-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.03.028

Inhibitory Activity of Fermentation Metabolites of Antagonistic Bacteria SJ1623 Against Trichosanthes kirilowii Fusarium Root Rot

Abstract The inhibitory activity of the fermentation supernatant of 6 antagonistic bacteria against Trichosanthes kirilowii Fusarium root rot was detected.The effects of different inoculation amount and fermentation time of the dominant antagonistic bacteria on the antifungal activity of fermentation supernatant were determined by the mycelial growth rate method.The inhibitory activity of fermentation supernatant and crude lipopeptide extract against Fusarium sp.was determined.The results showed that the antagonistic bacteria SJ1623 had the highest inhibitory activity.The seed liquid culture time was 10 h，and the inoculation amount of 0.75% （ volume ratio ） was better.The inhibition rate of the fermentation supernatant diluted 10 times was 87.6%.The inhibition rate of 50 times dilution of crude lipopeptide extract was 83.1%.

Key words Trichosanthes kirilowii root rot；Antagonistic bacteria；Fermentation broth；Inhibitory activity

栝樓（Trichosanthes kirilowii）是葫蘆科栝樓屬多年生纏繞性藤本植物。栝樓的種子、根、莖、葉、瓜皮皆可做優(yōu)良的中藥材，具有解熱止渴、利尿、鎮(zhèn)咳祛痰、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、抗腫瘤、抑制血小板凝集等藥理功能［1-2］。栝樓屬于多年生宿根植物，一旦地下發(fā)生根腐病對(duì)其生長(zhǎng)造成嚴(yán)重的影響，輕則因營(yíng)養(yǎng)不良而造成減產(chǎn)，重則引起整株死亡而導(dǎo)致絕收［3］。

栝樓根腐病的致病因素比較復(fù)雜，主要分為生物因素和非生物因素2個(gè)方面，其中生物因素主要由病原真菌、線蟲和細(xì)菌引起，而非生物因素則由水分脅迫、土壤及其營(yíng)養(yǎng)元素失衡等造成，二者致病因素混合存在導(dǎo)致根腐病發(fā)生更為嚴(yán)重。閆龍民等［4］研究表明，栝樓塊根中鋅和磷的含量越高，根腐病的發(fā)病率越低，可通過(guò)加施上述2種元素的方法減輕損失。栝樓根腐病大多數(shù)是由鐮孢屬真菌（Fusarium sp.）侵染引起，具有明顯的積年流行病害的特征，應(yīng)提早開展防治工作［5］。施用多菌靈、福美雙、苯醚甲環(huán)唑等化學(xué)藥劑不能徹底根除該病害的發(fā)生，而且連年施用對(duì)環(huán)境具有較大破壞作用，不利于中藥材的藥品安全［6］。目前，對(duì)栝樓等中藥材根部病害主要采取生物防治的相關(guān)措施，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、哈茨木霉（Trichoderma harzianum）等微生物菌劑以及功能菌發(fā)酵制備的生物有機(jī)肥已較為廣泛地應(yīng)用于中藥材根腐病的防治，在部分地區(qū)產(chǎn)生了可觀的效果，但應(yīng)用益生菌防治病害受到菌株種類、環(huán)境、施用方法等的影響較大，總體推廣應(yīng)用面積較?。?］。因此，通過(guò)系統(tǒng)研究篩選更加高效廣適的拮抗菌對(duì)于栝樓根腐病的防治具有重要意義。筆者以栝樓根腐病菌（Fusarium sp.）為靶標(biāo)菌，開展拮抗菌株篩選研究，進(jìn)而為栝樓根腐病的可持續(xù)防控提供優(yōu)良的生防菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株。

栝樓根腐病菌（Fusarium sp.）、細(xì)菌菌株SJ1510、SJ1519、SJ1623、GFJ-3、D-1和F-1由安徽科技學(xué)院植物土傳病害生物防治研究室分離純化并保存。

1.1.2 供試培養(yǎng)基。

PDA培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基和NB培養(yǎng)基參照方中達(dá)［8］的方法配制。

1.2 方法

1.2.1 6株拮抗菌對(duì)栝樓根腐病菌的抑制活性及優(yōu)勢(shì)菌的生長(zhǎng)曲線。

無(wú)菌條件下將6株細(xì)菌劃線培養(yǎng)至NA培養(yǎng)基平板上，置于26 ℃恒溫箱中培養(yǎng)72 h，待菌苔長(zhǎng)出后接種到裝有15 mL NB培養(yǎng)基的試管中，以140 r/min搖培10 h，然后用分光光度計(jì)以無(wú)菌NB培養(yǎng)基為對(duì)照調(diào)整OD600=1.0，然后再以0.2%（體積比）的接種量接種到裝有50 mL NB培養(yǎng)基的150 mL三角瓶中，140 r/min搖培72 h，得到菌株的發(fā)酵液置于4 ℃、10 000 r/min的離心機(jī)中離心10 min得到上清液。吸取5 mL發(fā)酵上清液和2.5 mL 1 000 mg/L硫酸鏈霉素水溶液同時(shí)加入42.5 mL冷卻到 40～60 ℃的PDA培養(yǎng)基中，迅速充分混勻后倒3個(gè)平板，對(duì)照加入等量和上述濃度相同的硫酸鏈霉素溶液和5 mL滅菌水，重復(fù)3次。待平板凝固，接種培養(yǎng)144 h菌落邊緣的菌餅（直徑為7 mm），然后置于26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)144 h后測(cè)量菌落直徑，求出不同菌株發(fā)酵上清液對(duì)病菌的抑制率，優(yōu)選出抑制效果較好的拮抗菌株用于以下試驗(yàn)。

1.2.2 不同接種量對(duì)病菌的抑制活性影響測(cè)定。

按照“1.2.1”制備的種子液按照0.062 5%、0.125 0%、0.250 0%、0.750 0%、1.000 0%、1.500 0%（體積比）的接種量接種到裝有50 mL NB培養(yǎng)基的150 mL三角瓶中搖培，同樣按照“1.2.1”的方法制備發(fā)酵上清液，檢測(cè)不同接種量制備的發(fā)酵上清液對(duì)病菌抑制活性的影響。

1.2.3 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)病菌的抑制活性影響測(cè)定。

按“1.2.1”和“1.2.2”優(yōu)化試驗(yàn)條件開展不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)病菌抑制活性的影響。接種完畢后，發(fā)酵搖培時(shí)間分別為24、48、60、72、84、96和120 h，檢測(cè)不同發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間制備的發(fā)酵上清液對(duì)病菌抑制活性的影響。

1.2.4 不同稀釋倍數(shù)的發(fā)酵上清液對(duì)栝樓根腐病菌的抑制活性測(cè)定。

參照“1.2.1”的方法檢測(cè)最優(yōu)條件下制備的發(fā)酵上清液原液和原液的1.5、3.0、4.0和8.0倍稀釋液的抑菌活性，然后求出不同濃度的發(fā)酵上清液對(duì)病菌的抑制率。

1.2.5 不同脂肽粗提物對(duì)栝樓根腐病菌的抑制活性測(cè)定。

采用鄧建良等［9］方法略有改進(jìn)制備脂肽粗提物。將脂肽粗提物分別稀釋5、7、10、15、20和40倍，脂肽粗提物的抑菌活性檢測(cè)方法同“1.2.4”發(fā)酵上清液的檢測(cè)方法。

1.3 抑制率計(jì)算公式以及數(shù)據(jù)分析

抑菌率=（對(duì)照菌餅直徑-處理菌餅直徑）/（對(duì)照菌餅直徑-菌餅直徑）×100%；所得數(shù)據(jù)采用Excel 2007和IBM SPSS statistics 25.0 進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 6株拮抗菌發(fā)酵上清液對(duì)栝樓根腐病菌的抑制效果

從表1可以看出，6株拮抗細(xì)菌對(duì)栝樓根腐病菌的抑制率從高到低的順序?yàn)镾J1623、SJ1519、D-1、GFJ-3、F-1和GFJ1510。其中SJ1623的抑制效果最好，抑制率達(dá)82.1%，GFJ1510的抑制效果最差為44.6%。篩選出菌株SJ1623作為下一步的研究對(duì)象。

2.2 拮抗菌SJ1623的生長(zhǎng)曲線

由圖1可知，0～6 h為菌株生長(zhǎng)的延滯期，6～14 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后進(jìn)入穩(wěn)定期。因此，選定菌株對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的中期10 h作為種子液的培養(yǎng)時(shí)間。

2.3 拮抗菌SJ1623不同接種量的發(fā)酵上清液對(duì)病菌的抑制活性

由圖2可知，隨著接種量的不斷增加，拮抗菌產(chǎn)發(fā)酵上清液的抑制率呈逐漸上升后下降的趨勢(shì)。接種量為0.750 0%（體積比）抑制率達(dá)最高為85.74%，接種量為0.062 5%抑制率最小為62.85%。由此可知，初始接種量對(duì)發(fā)酵上清液抑制活性的影響較大，當(dāng)接種量較小時(shí)菌體增殖較慢，產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)較少；然而接種量過(guò)大對(duì)抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生同樣不利，推測(cè)接種量過(guò)大導(dǎo)致發(fā)酵培養(yǎng)基中的基質(zhì)營(yíng)養(yǎng)物消耗過(guò)快，導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)物缺乏或溶氧不足，從而使抑菌效果下降。

2.4 拮抗菌SJ1623不同發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間的發(fā)酵上清液對(duì)病菌的抑制活性

由圖3可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，拮抗菌產(chǎn)發(fā)酵上清液的抑制率逐漸上升后緩慢下降。培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)為84 h時(shí)抑制率最高為87.13%，培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)為24 h抑制率最小為39.58%。說(shuō)明培養(yǎng)時(shí)間過(guò)短，菌量少抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)生少，但隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，菌量進(jìn)一步增大，可能由于大量菌體的存在致使抑菌活性物質(zhì)被菌體吸附而抑菌效果下降，也有可能是抑菌物質(zhì)被進(jìn)一步分解轉(zhuǎn)化為其他抑菌活性下降的物質(zhì)。

2.5 拮抗菌SJ1623發(fā)酵上清液對(duì)栝樓根腐病菌的抑制活性

由表2可知，SJ1623發(fā)酵上清液的濃度從12.5 mL/L增至100.0 mL/L時(shí)，發(fā)酵上清液對(duì)栝樓根腐病菌的抑菌率從40.2%增至87.6%，說(shuō)明發(fā)酵上清液對(duì)栝樓根腐病菌具有較高的活性，稀釋倍數(shù)小于15倍所達(dá)到的抑菌效果較好。

2.6 拮抗菌SJ1623脂肽粗提物對(duì)栝樓根腐病菌的抑制活性

由表3可知，從發(fā)酵上清液中提取的脂肽粗提物對(duì)栝樓根腐病菌的抑制效果明顯高于發(fā)酵上清液對(duì)病菌的抑制效果， 50倍稀釋液的抑菌率可達(dá)83.1%。然后隨著稀釋倍數(shù)的增加抑菌率開始降低，因而對(duì)病菌要有較高的抑制效果，其稀釋倍數(shù)應(yīng)小于70倍。

3 結(jié)論與討論

近年來(lái)，栝樓種植效益較高，種植面積擴(kuò)大較快，但由于栝樓為多年生宿根植物，為根部病害的發(fā)生創(chuàng)造了良好條件［10］。栝樓根腐病的發(fā)生受到多重因素的影響，應(yīng)全方位考慮。如不合理灌溉施肥導(dǎo)致土壤酸化，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)失調(diào)導(dǎo)致土壤微生物多樣性降低、種群結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，有益微生物的生長(zhǎng)受到抑制，有益菌逐漸受到有害菌的排斥，從而使土壤從細(xì)菌主導(dǎo)型向真菌主導(dǎo)型轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致以根腐病為代表的土傳病害愈演愈烈［11］。

生物防治措施作為延緩?fù)羵鞑『Πl(fā)生的治本措施，已形成諸多重要成果，也為營(yíng)造綠色可持續(xù)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)環(huán)境提供了重要實(shí)踐路徑［12］。栝樓根腐病的生物防治措施報(bào)道較少，但其主要致病菌——鐮孢菌（Fusarium sp.）為代表的葫蘆科植物根腐病相關(guān)生物防治研究較多。曹云娥等［13］采用平板對(duì)峙法結(jié)合抑制菌絲生長(zhǎng)速率法，從蚯蚓堆肥中篩選到 1 株對(duì) 4 種瓜類枯萎病菌均有顯著抑制效果的拮抗細(xì)菌 WQ-6，經(jīng)鑒定為暹羅芽孢桿菌（Bacillus siamensis），其對(duì)瓜類枯萎病菌具有廣譜性防效，發(fā)酵液10倍稀釋液的抑菌率為34.96%～46.75%；張涵等［14］從河南南陽(yáng)桐柏山景區(qū)土壤中分離篩選到一株對(duì)苦瓜枯萎病菌具有抑制效果的短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis TB17），發(fā)酵液10倍無(wú)菌濾液對(duì)病菌的抑制率為54.95%，盆栽防效達(dá)76.92%。該研究所得的菌株SJ1623的發(fā)酵上清液10倍稀釋液的室內(nèi)菌絲生長(zhǎng)抑制率達(dá)80%以上，說(shuō)明其應(yīng)用價(jià)值更大，活體試驗(yàn)需要進(jìn)一步探究。脂肽類物質(zhì)為拮抗細(xì)菌發(fā)酵液中提取的重要抑菌活性物質(zhì)［15］。向亞萍等［16］報(bào)道芽孢桿菌產(chǎn)脂肽類抗生素是抑制植物病原真菌的主要成分，其中伊枯草菌素（iturins）的結(jié)構(gòu)變化及其分泌量與抑菌活性具有相關(guān)性。該研究所提取的脂肽類物質(zhì)對(duì)栝樓根腐病菌的抑制活性明顯高于發(fā)酵上清液，同樣也說(shuō)明脂肽類物質(zhì)在抑菌方面發(fā)揮重要作用，下一步應(yīng)研究脂肽類物質(zhì)中起主要抑菌作用的活性成分，從而為菌株的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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