珍稀瀕危樹種金錢槭的基因組DNA提取方法研究

吳晟昊 楊麗 向松竹 胡茜茜 周志翔 鄭波 施雪萍 劉梅

摘要 ［目的］明確高效提取金錢槭基因組DNA的方法。［方法］以金錢槭幼嫩葉片為材料，采用4種不同方法提取金錢槭基因組DNA，并通過紫外分光光度計(jì)法、瓊脂糖凝膠電泳檢測、限制性內(nèi)切酶酶切和擴(kuò)增保守基因片段等方法比較不同DNA的提取效率。［結(jié)果］高鹽低pH法因操作時(shí)間較長導(dǎo)致DNA損失較多，提取到的DNA雖然雜質(zhì)含量較低，但濃度也較低。SDS法提取效果不佳，提取到的DNA含量少且完整性差。尿素法提取的DNA質(zhì)量最差，降解嚴(yán)重，難以用于后續(xù)分子生物學(xué)研究。改良CTAB法可以大量提取能夠用于酶切及PCR擴(kuò)增的DNA。［結(jié)論］金錢槭DNA高效提取方法的確定可以為相關(guān)的分子生物學(xué)研究提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)參考。

關(guān)鍵詞 金錢槭；DNA提?。籆TAB法

中圖分類號(hào) S792.35? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2024）03-0091-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.03.021

Study on Genomic DNA Extraction Methods for the Rare and Endangered Tree Species Dipteronia sinensis Oliv.

Abstract ［Objective］To determine efficient method for extracting genomic DNA from D. sinensis.［Method］Four methods were used to extract genomic DNA from young leaves of D.sinensis.The efficiency of genomic DNA extraction was assessed by ultraviolet spectrophotometer， agarose gel electrophoresis， restriction enzyme digestion， and amplification of conserved gene fragments.［Result］The results showed that the high-salt， low-pH method led to more DNA loss due to the extended operation time， resulting in low concentration of DNA with low impurity content. The SDS method had a poor extraction efficiency， yielding DNA with low content and poor integrity. The urea method produced the worst DNA extraction， with severe degradation that renders it unsuitable for molecular biology research. The improved CTAB method successfully extracted a large amount of DNA suitable for enzyme digestion and PCR amplification. ［Conclusion］The determination of an efficient DNA extraction method will provide scientific basis and technical references for related molecular biology research of D. sinensis.

Key words Dipteronia sinensis Oliv.;DNA extraction;CTAB method

金錢槭（Dipteronia sinensis Oliv.）是無患子科（Sapindaceae Juss.）金錢槭屬（Diteronia Oliv.）落葉小喬木，高5～10 m，是我國特有的瀕危樹種，主要分布在我國西南地區(qū)。金錢槭樹形優(yōu)美，樹干挺直，紋理清晰，材質(zhì)細(xì)密，兼具觀賞價(jià)值與經(jīng)濟(jì)價(jià)值［1］。目前，對(duì)金錢槭的研究主要集中在保護(hù)策略［2］、種群分布［3］和保護(hù)基因組學(xué)［4］上，但缺乏針對(duì)金錢槭基因組DNA提取方法的比較研究，目前有關(guān)高效提取金錢槭基因組DNA的方法鮮見報(bào)道。由于DNA的質(zhì)量對(duì)其下游的分子生物學(xué)研究至關(guān)重要，因此找到高效提取金錢槭DNA的方法具有重要意義。筆者以金錢槭新鮮葉片為材料，采用改良CTAB法、SDS法、高鹽低pH法和尿素法4種常用的提取方法，通過比較分析，找到最適合提取高品質(zhì)金錢槭DNA的方法，旨在為后續(xù)有關(guān)金錢槭的分子生物學(xué)研究提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2022年3月下旬將采于湖北省神農(nóng)架林區(qū)的金錢槭新鮮枝條修剪為10 cm長的插穗，每根插穗保留2～3個(gè)嫩芽，將基部浸泡于含有0.01%（W/V）NAA的基質(zhì)中處理20 h［5］后，扦插于蛭石與泥炭土等體積混合的土壤基質(zhì)中。扦插材料放置于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物生長室培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為16 h光照，8 h黑暗，溫度為23? ℃。在生長室培養(yǎng)30 d后，用剪刀剪下萌發(fā)的新鮮葉片，迅速用液氮冷凍，并放置于-80? ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 DNA提取方法

共采用改良CTAB法、SDS法、高鹽低pH法和尿素法4種常用方法，用于提取金錢槭嫩葉的基因組DNA。每種方法3次重復(fù)。

1.2.1 改良CTAB提取方法。試驗(yàn)步驟根據(jù)傳統(tǒng)CTAB法并稍作修改，在原CTAB提取液中加入2% β-巰基乙醇和4%聚乙烯吡咯烷酮K40，具體為：①取-80 ℃超低溫冰箱保存的葉片在液氮中充分研磨，稱取約50 mg粉末并迅速轉(zhuǎn)移到用液氮預(yù)冷的2 mL離心管中；②加入400 μL于65 ℃預(yù)熱的CTAB提取液，在恒溫混勻儀（Eppendorf，ThermoMixer C）中65 ℃搖晃混勻30? min；③加入等體積氯仿∶異戊醇溶液 （24∶1）， 顛倒混勻后11 000 r/min離心10 min，吸取上清液；④加入等體積異丙醇，11 000 r/min離心10 min，棄掉上清液，并用75%（V/V）乙醇洗滌沉淀3次；⑤11 000 r/min離心2 min，將殘留的乙醇吸凈并吹干；⑥加入200 μL含0.1 mg RNase的TE緩沖液充分溶解DNA，在恒溫混勻儀中37 ℃孵育30 min，然后將DNA樣品保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.2.2 SDS提取方法。參考王書珍等［6］使用的方法并稍作修改，具體為：①取-80 ℃超低溫冰箱保存的葉片在液氮中充分研磨，稱取約50 mg粉末并迅速轉(zhuǎn)移到用液氮預(yù)冷的2 mL離心管中；②加入400 μL于65 ℃預(yù)熱的SDS提取液，在恒溫混勻儀中65 ℃搖晃混勻30 min；③加入200 μL 5 mol/L KAc，充分混勻后冰浴20 min，然后11 000 r/min離心10 min，吸取上清液，轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL離心管中；④加入等體積氯仿∶異戊醇溶液（24∶1），顛倒混勻后11 000 r/min離心10 min，吸取上清液；⑤加入2倍體積的無水乙醇，-20 ℃沉淀2 h；⑥11 000 r/min離心10 min，棄掉上清液，并用70%（V/V）乙醇洗滌沉淀3次；⑦11 000 r/min離心2 min，將殘留的乙醇吸凈并吹干；⑧加入200 μL含0.1 mg RNase的TE緩沖液充分溶解DNA，在恒溫混勻儀中37 ℃孵育30 min，然后將DNA樣品保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.2.3 高鹽低pH提取方法。參考邵亞林等［7］使用的方法并稍作修改，具體為：①取-80 ℃超低溫冰箱保存的葉片在液氮中充分研磨，稱取約50 mg粉末并迅速轉(zhuǎn)移到用液氮預(yù)冷的2 mL離心管中；②加入400 μL于65 ℃預(yù)熱的DNA提取液，在恒溫混勻儀中65 ℃搖晃混勻30 min；③11 000 r/min離心10 min，吸取上清液；④加入2/3體積的2.5 mol/L KAc（pH=4.8），充分混勻后冰浴30 min，然后11 000 r/min離心10 min，吸取上清液，轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL離心管中；⑤加入等體積異丙醇，-20 ℃沉淀30 min；⑥11 000 r/min離心10 min，棄掉上清液，并用70%（V/V）乙醇洗滌沉淀3次；⑦11 000 r/min離心2 min，將殘留的乙醇吸凈并吹干；⑧加入200 μL含0.1 mg RNase的TE緩沖液充分溶解DNA，在恒溫混勻儀中37 ℃孵育30 min，然后將DNA樣品保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.2.4 尿素提取方法。參考韓玉杰等［8］使用的方法并稍作修改，具體為：①取-80 ℃超低溫冰箱保存的葉片在液氮中充分研磨，稱取約50 mg粉末并迅速轉(zhuǎn)移到用液氮預(yù)冷的2 mL離心管中；②加入400 μL于65 ℃預(yù)熱的尿素提取液，在恒溫混勻儀中65 ℃搖晃混勻30 min；③加入等體積氯仿∶異戊醇溶液（24∶1），顛倒混勻后11 000 r/min離心10 min，吸取上清液；④加入等體積異丙醇，11 000 r/min離心10 min，棄掉上清液，并用70%（V/V）乙醇洗滌沉淀3次；⑤11 000 r/min離心2 min，將殘留的乙醇吸凈并吹干；⑥加入200 μL含0.1 mg RNase的TE緩沖液充分溶解DNA，在恒溫混勻儀中37 ℃孵育30 min，然后將DNA樣品保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.3 紫外分光光度計(jì)檢測

取2 μL DNA提取液，以含0.1 mg RNase的TE緩溶液為對(duì)照，使用紫外分光光度計(jì)（Thermo，NanoDrop 2 000）檢測DNA的純度和濃度，用A260/A280表示DNA的相對(duì)純度，用DNA產(chǎn)量（μg）與葉片鮮重FW（g）的比值表示DNA得率（μg/g）。

1.4 瓊脂糖凝膠電泳檢測

取5 μL DNA樣品，以DL 15 000 DNA Marker（Takara）為對(duì)照，經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠（Coolaber）電泳后用凝膠成像系統(tǒng)（NEWBIO INDUSTRY，Molecular Imager Gel Doc EX System）觀察拍照。

1.5 PCR擴(kuò)增檢測

選用葉綠體DNA（cpDNA）片段trnT-psbc［9］和內(nèi)參基因β-ACTIN［10］設(shè)計(jì)通用引物（表1），引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。以4種方法提取到的DNA為模板，使用PCR 儀（Eppendorf，Master-cycler nexus eco）進(jìn)行產(chǎn)物擴(kuò)增。cpDNA片段trnT-psbc的PCR反應(yīng)條件： 95? ℃ 5 min，95? ℃ 15 s，60? ℃ 20 s， 72? ℃ 3 min，20個(gè)循環(huán)，72? ℃ 10 min；內(nèi)參基因β-actin的PCR反應(yīng)條件：95? ℃ 5 min，95? ℃ 15 s，60? ℃ 20 s，72? ℃ 15 s，30個(gè)循環(huán)，72? ℃ 10 min。PCR反應(yīng)體系（10 μL）為：5 μL 2× Taq Plus Master Mix Ⅱ（Vazyme），上、下游引物（各10 μmol/L），20 ng模板DNA，超純水補(bǔ)足剩余體系。

取2個(gè)片段的擴(kuò)增產(chǎn)物，分別以DL 5 000、DL 500 DNA Marker（Takara）為對(duì)照，經(jīng)1.5%和3.0%瓊脂糖凝膠（Coolaber）電泳后用凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照。

1.6 EcoRI酶切檢測

酶切反應(yīng)體系（20 μL）：2 μL 10 × Buffer EcoRI（Thermo），1 μL EcoRI（Thermo），3 μg DNA，使用超純水補(bǔ)足剩余體系。37 ℃水浴過夜后，終產(chǎn)物以DL 5 000 DNA Marker（Takara）為對(duì)照，進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠（Coolaber）電泳，電泳結(jié)束后用凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外分光結(jié)果

紫外分光光度計(jì)可對(duì)4種方法獲得的金錢槭DNA純度和濃度進(jìn)行檢測：A260/A280在1.8～2.0時(shí)，一般可以認(rèn)為DNA純度較高；A260/A280在1.8以下時(shí)，認(rèn)為DNA純度較低，可能含有蛋白質(zhì)或酚類物質(zhì)等雜質(zhì)；當(dāng)A260/A280為2.0以上時(shí)，認(rèn)為RNA是DNA中主要的污染物質(zhì)。檢測結(jié)果見表2，4種方法提取的DNA，A260/A280為1.8～2.0，表明DNA純度較高，4種方法都能去除大部分雜質(zhì)污染。濃度和得率的計(jì)算結(jié)果表明，改良CTAB法提取到的DNA量最多，其次是高鹽低pH法，SDS法第3，尿素法提取到的DNA量最少。

2.2 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

取4種方法提取的基因組DNA進(jìn)行凝膠電泳，結(jié)果如圖1a所示。從圖1a可以看出，除尿素法外，其余3種方法提取的DNA都能觀察到單一電泳條帶，其中改良CTAB法的電泳條帶最為明亮，高鹽低pH法的電泳條帶亮度相對(duì)較暗，SDS法的電泳條帶最弱。并且SDS法提取獲得的DNA片段長度相比于改良CTAB法和高鹽低pH法有所減小，表明DNA的完整性較差，推測存在降解。尿素法未見條帶，與NanoDrop測定的濃度結(jié)果不一致，推測可能是由于DNA降解嚴(yán)重，使樣品A260值上升，因此檢測到的濃度偏高。4種方法綜合比較，改良CTAB法的提取效果最好。

2.3 酶切結(jié)果

使用限制性內(nèi)切酶EcoRI對(duì)4種方法提取的DNA進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物的電泳結(jié)果如圖1b所示。結(jié)果顯示，除了尿素法提取的DNA可能由于降解嚴(yán)重，觀察不到DNA條帶，其他3種方法提取得到的DNA都能被EcoRI酶切，電泳條帶呈抹帶狀，說明沒有蛋白質(zhì)等雜質(zhì)干擾限制性內(nèi)切酶工作，EcoRI能夠以正常效率酶切，表明提取得到的DNA雜質(zhì)少，符合進(jìn)行下游分子生物學(xué)研究要求。

2.4 擴(kuò)增結(jié)果

為了檢測4種方法所提取的基因組DNA是否適用于PCR擴(kuò)增，分別設(shè)計(jì)內(nèi)參基因β-ACTIN和cpDNA片段trnT-psbc的通用引物，并對(duì)4種方法提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果分別如圖1c、圖1d所示。結(jié)果顯示，2次PCR反應(yīng)得到的結(jié)果一致，4種方法提取的基因組DNA均可擴(kuò)增出目的條帶，其中尿素法提取得到的DNA擴(kuò)增效率最差，條帶最暗，表明DNA質(zhì)量較差；SDS法對(duì)應(yīng)的條帶亮度較暗，僅優(yōu)于尿素法，可能是由于DNA完整性不好導(dǎo)致擴(kuò)增效率變低。改良CTAB法與高鹽低pH法對(duì)應(yīng)的條帶清晰明亮，表明DNA質(zhì)量好，可用于后續(xù)分子生物學(xué)研究。

3 討論

對(duì)于不同植物，提取其基因組DNA的最佳方法通常也不同。SDS法被證明能高效提取醉馬草［11］和川貝母［12］等植物的DNA，尿素法可從大蒜［13］中提取獲得高濃度、高純度的DNA，高鹽低pH法成本低，能從白草種子［14］中獲得高質(zhì)量DNA。但SDS和尿素對(duì)多糖多酚類雜質(zhì)的去除效果差，因此在槭屬樹種［15］和杜鵑［6］等富含多糖、色素、單寧以及多種酚類物質(zhì)的植物DNA提取中，往往提取效果不佳。高鹽低pH法操作流程時(shí)間較長，提取過程中DNA易出現(xiàn)損耗。在該試驗(yàn)中，尿素法提取的金錢槭DNA使用NanoDrop能夠測出濃度，但凝膠電泳時(shí)未見條帶，推測是DNA降解嚴(yán)重，難以進(jìn)行下游分子生物學(xué)研究。SDS法提取效果不佳，凝膠電泳條帶較暗，說明DNA濃度較低；PCR擴(kuò)增效率較低，說明DNA可能純度較差或完整性較差。高鹽低pH法提取到的金錢槭DNA雖然品質(zhì)較好，但耗時(shí)較長，且得率相對(duì)較低。上述3種方法均不是提取金錢槭DNA的最佳選擇。

CTAB法被廣泛用于各種植物基因組DNA的提取，利用CTAB去污劑的特性，能有效去除包括多糖多酚在內(nèi)的多種雜質(zhì)［16］，從而得到高質(zhì)量、高濃度的DNA。該研究采用的改良CTAB法是在曲士松等［17］總結(jié)的CTAB法的基礎(chǔ)上增加使用了聚乙烯吡咯烷酮K40及β-巰基乙醇。聚乙烯吡咯烷酮K40和β-巰基乙醇能夠結(jié)合酚類物質(zhì)，抑制酚被氧化，有利于DNA的提取。在該試驗(yàn)中，使用改良CTAB法提取到的金錢槭基因組DNA兼具高濃度與高純度，且DNA完整性好，能夠用于下游分子生物學(xué)研究。說明改良CTAB法是4種方法中最適合提取金錢槭基因組DNA的方法。劉亭等［18］為了更有效地去除雜質(zhì)，在提取過程中使用氯仿/異戊醇進(jìn)行了二次抽提。該研究在前期進(jìn)行二次抽提時(shí)發(fā)現(xiàn)，DNA的純度沒有明顯提高，但是濃度顯著下降，因此在后續(xù)試驗(yàn)中放棄使用二次抽提的改進(jìn)方法。

綜上所述，該研究通過對(duì)4種常用DNA提取方法的比較，確定了改良CTAB法是最適合提取金錢槭基因組DNA的方法，為后續(xù)金錢槭相關(guān)的分子生物學(xué)研究提供了參考。

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