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    超聲協(xié)同蒸汽處理對殼雞蛋表面大腸桿菌的殺菌機(jī)理及動力學(xué)分析

    2024-03-10 11:24:38張雅琪遲玉杰
    食品科學(xué) 2024年4期
    關(guān)鍵詞:模型

    張雅琪,遲玉杰,,遲 媛

    (1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150030;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)工程學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150030)

    作為一種具有綜合營養(yǎng)價(jià)值的食品,雞蛋和蛋類食品往往成為食源性微生物的攜帶者[1]。盡管新鮮雞蛋無菌或含有少量細(xì)菌,并且雞蛋自身也具備一些物理和化學(xué)防護(hù)機(jī)制[2]。但隨著儲存時間的延長,其防御能力會逐漸減弱,各種微生物會侵入雞蛋并迅速繁殖,使新鮮雞蛋的品質(zhì)下降,甚至危害消費(fèi)者的健康[3]。其中大腸桿菌的檢出率高達(dá)70%,沙門氏菌的檢出率僅為5%左右[4-5]。為了防止雞蛋污染,最好在產(chǎn)蛋后立即進(jìn)行清洗和消毒。目前常用于清潔殼蛋表面的化學(xué)試劑浸泡法和熏蒸法容易出現(xiàn)化學(xué)試劑殘留問題[6-7],而大劑量的臭氧氣體又對人體有害[8]。

    和其他消毒方法相比,熱處理能達(dá)到完全殺滅蛋殼表面細(xì)菌的效果。目前常見的帶殼全蛋熱殺菌一般采用水浴法或熱蒸汽法。水浴法是指將帶殼雞蛋浸泡于一定溫度的熱水中加熱升溫,最終殺死致病菌。Geveke等[9]證實(shí),熱水浸泡過程能夠使帶殼雞蛋的耐熱腸炎沙門氏菌失活4.5 個對數(shù)值。Himathongkham等[10]將蛋殼雞蛋浸入腸炎沙門氏菌的培養(yǎng)物中,發(fā)現(xiàn)細(xì)菌可以穿透蛋殼到達(dá)細(xì)胞膜,將染菌雞蛋在沸水中浸泡3 s即可完全殺滅細(xì)菌,效果優(yōu)于其他所有測試方法(主要是化學(xué)方法)。但水浴法通常會導(dǎo)致蛋殼破裂,從而造成不必要的損失,因此應(yīng)用較為有限。蒸汽因?yàn)槠錆撛谀芰靠梢栽诤芏痰臅r間內(nèi)轉(zhuǎn)移到表面,常用于食品工業(yè)儀器表面的清潔和消毒,以及化妝品和藥品的生產(chǎn)[11]。目前蒸汽處理在減少雞肉、杏仁和新鮮切果蔬表面細(xì)菌數(shù)量方面取得了一定的成功[12]。Zion等[13]設(shè)計(jì)出一款蒸汽熱阱,經(jīng)過幾秒鐘的短時處理即能實(shí)現(xiàn)對人工接種新鮮蛋殼上沙門氏菌的完全滅活。已有研究表明,95 ℃條件下,雞蛋可以承受長達(dá)10 s的蒸汽處理,而此時蛋內(nèi)部溫度僅為40 ℃左右,不會使雞蛋內(nèi)部發(fā)生大量變性和破壞;而在沸水中處理時長超過3 s時,部分蛋殼會出現(xiàn)裂紋,且長時間的加熱會對其功能性質(zhì)產(chǎn)生很大影響[14]。因此需要嚴(yán)格控制蒸汽處理時間。

    超聲波空化已被證明能夠通過增強(qiáng)細(xì)菌的凝聚能力實(shí)現(xiàn)殺菌[15-16]。然而,單獨(dú)使用超聲波處理時,很容易導(dǎo)致殺菌不夠徹底。因此常將其與其他殺菌手段結(jié)合,利用它們之間的協(xié)同效應(yīng)顯著提高殺菌效果[17]。此外,還有部分研究表明,在聲熱復(fù)合處理過程中,超聲波預(yù)處理可以在細(xì)胞內(nèi)造成一定程度的非致死性損傷,導(dǎo)致微生物物理性損傷,從而提高熱處理對微生物細(xì)胞的殺傷效率,使其對熱處理更加敏感[18-19]。因此,通過充分利用超聲波輔助熱殺菌過程中兩者之間的協(xié)同作用,可以有效減少食品中微生物污染,并節(jié)省成本。

    動力學(xué)模型是研究微生物殺菌效果的重要工具,可為實(shí)際應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。因此,本實(shí)驗(yàn)通過建立殺菌動力學(xué)模型研究超聲協(xié)同蒸汽處理對蛋殼表面大腸桿菌的殺菌效果,以期為殺滅蛋殼表面微生物提供方法依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    新鮮A級雞蛋(平均質(zhì)量45~55 g)好優(yōu)多超市(產(chǎn)自中國黑龍江省雙縣農(nóng)場),購買后24 h內(nèi)使用;大腸桿菌(Escherichia coli)ATCC 25922 福建賽莫爾科學(xué)實(shí)驗(yàn)用品城。

    平板技術(shù)瓊脂、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂 上海博微生物技科技有限公司;次氯酸鈉(NaClO)溶液 汕頭市蓮塘化工廠有限公司;考馬斯亮藍(lán)G-250、碘化丙啶(propidium iodide,PI)北京索萊寶科技有限公司;氯化鈉、氫氧化鈉等均為國產(chǎn)分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    TU-1810紫外-可見分光光度儀 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;KQ3200DE型數(shù)控超聲清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;CHA-S型氣浴振蕩恒溫培養(yǎng)箱蘇州市國飛實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司;YX180B型高壓滅菌鍋天津賽得利斯實(shí)驗(yàn)分析儀器制造廠;MK-21A高速冷凍離心機(jī) 湖南邁克爾實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;DDB-11A電導(dǎo)率儀 杭州齊威儀器有限公司;F-7100型熒光分光光度計(jì)、SU8010型場發(fā)射掃描電鏡 日本日立公司。

    1.3 方法

    1.3.1 菌懸液制備

    參照文獻(xiàn)[20]的方法并進(jìn)行改進(jìn)。將大腸桿菌菌株在營養(yǎng)瓊脂平板劃線后,在37 ℃的環(huán)境中活化24 h,然后挑取適量的菌株放入100 mL的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,置于恒溫振蕩器中,以37 ℃、200 r/min條件孵育12 h。將含有細(xì)菌的培養(yǎng)基以6000 r/min離心5 min,棄去培養(yǎng)基,用無菌生理鹽水適當(dāng)稀釋。根據(jù)GB 4789.2—2022《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》中平板計(jì)數(shù)法計(jì)算原始細(xì)菌數(shù),便于下一步制備不同濃度的細(xì)菌懸浮液。

    1.3.2 接種

    選擇產(chǎn)后質(zhì)量為50~70 g的新鮮雞蛋,且照蛋檢查無細(xì)微裂紋、氣室偏移以及蛋黃出現(xiàn)陰影等問題。用無菌脫脂棉球蘸體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液擦拭蛋殼表面,擦拭后將其放在超凈工作臺上紫外線照射30 min,殺滅蛋殼表面的細(xì)菌。檢測處理過的雞蛋表面細(xì)菌總數(shù)。準(zhǔn)備濃度約為108CFU/mL的大腸桿菌懸浮液,將雞蛋在細(xì)菌懸浮液中浸泡1 h,然后取出雞蛋放在無菌操作平臺上干燥備用。

    1.3.3 殺菌處理

    選擇接種并干燥后完整備用的雞蛋,對其進(jìn)行分組。分組后參照不同方法對鮮蛋蛋殼進(jìn)行處理,具體方法見表1。

    表1 不同殺菌處理方法Table 1 Different sterilization methods

    1.3.4 雞蛋殼表面殘余菌數(shù)的檢測

    用無菌棉球蘸取適量無菌生理鹽水,擦拭各組接種雞蛋的整個表面,將棉球浸泡在100 mL無菌生理鹽水中充分混勻,獲得處理過的洗脫液。大腸桿菌計(jì)數(shù)可參考GB 4789.3—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》中的第二法——大腸菌群平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)。利用殺菌前后樣品大腸桿菌殘存率對數(shù)值表示超聲波協(xié)同蒸汽的致死效果,致死率按式(1)計(jì)算:

    式中:N0和N分別為殺菌前后菌落數(shù)/(CFU/mL)。

    1.3.5 數(shù)學(xué)模型的建立

    1.3.5.1 線性模型

    D值是指在一定的溫度條件下,殺滅90%的活菌數(shù)或者芽孢數(shù)所需要的時間,是表示微生物死亡速率的一種方法。該模型假設(shè)微生物對殺菌條件具有相同的抗性,致死動力學(xué)可以用線性模型描述,微生物數(shù)量下降對數(shù)值隨時間的變化呈線性變化。線性模型計(jì)算如式(2)所示:

    式中:N0為殺菌處理前大腸桿菌數(shù)量/(CFU/mL);N為殺菌處理后大腸桿菌數(shù)量/(CFU/mL);t為殺菌時間/s;D為指數(shù)遞減時間/s。

    1.3.5.2 Weibull模型

    該模型由Weibull提出,通常用于描述各種凹凸性曲線[21-22]。Weibull模型假設(shè)菌體之間的熱抗性和耐壓性存在差別,其存活曲線符合累積分布函數(shù)[23]。Weibull模型計(jì)算如式(3)所示:

    式中:a為規(guī)模參數(shù);b為形狀因子;t為殺菌時間/s。

    1.3.5.3 Log-Logistic模型

    該模型是假設(shè)菌體對殺菌強(qiáng)度的抗性不同。本研究在文獻(xiàn)[24]的基礎(chǔ)上做了簡化處理,Log-Logistic模型計(jì)算如式(4)所示:

    式中:p為最低殘存菌數(shù);q、m為曲線方程的參數(shù);t為殺菌時間/s。

    1.3.5.4 Modified Gompertz模型

    本研究在文獻(xiàn)[25]的基礎(chǔ)上做了簡化處理,Modified Gompertz模型如式(5)所示:

    式中:a為曲線下漸近線值;b為(Kdm×e)/a,其中Kdm為曲線指數(shù)階段的線性失活率;c為細(xì)菌滯后階段的時間/s;t為殺菌時間/s。

    1.3.5.5 模型評價(jià)

    采用精確因子(Af)、偏差因子(Bf)、均方根誤差(root mean squared error,RMSE)和決定系數(shù)(R2)4 個參數(shù)評價(jià)模型擬合度的優(yōu)劣[26]。其中,Af和Bf反映模型的性能,Af值越小,Bf值越接近于1,模型的擬合度就越高;R2和RMSE反映模型的可靠度,R2越大,RMSE越小,模型的擬合度越好。Af、Bf、RMSE的計(jì)算如式(6)~(8)所示:

    式中:n為實(shí)測值的個數(shù);p為考察指標(biāo)數(shù)。

    1.3.6 掃描電鏡觀察

    將各處理組的洗脫液加入滅菌的10 mL離心管中,以8000 r/min離心3 min,棄去上清液,加入滅菌生理鹽水洗滌兩次,轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管,得到菌懸液。樣品經(jīng)過固定、干燥、脫水、置換、冷凍干燥后離子濺射鍍金,掃描電鏡觀察菌體結(jié)構(gòu)。未經(jīng)滅菌的對照樣品進(jìn)行類似處理。

    1.3.7 PI攝取量測定

    將PI溶于去離子水中,制備成1 mg/mL的溶液,并在4 ℃的黑暗環(huán)境中貯存。各處理組洗脫液8000×g、4 ℃離心10 min,棄去上清液,用無菌生理鹽水調(diào)整菌液濃度至106CFU/mL。實(shí)驗(yàn)分為滅菌處理前和滅菌處理后PI染色:對于滅菌處理前的PI染色組,需要將未經(jīng)處理的菌液分別加入0.5 mL的PI溶液,然后接種雞蛋,并對其進(jìn)行相應(yīng)的處理和洗脫;對于處理后的PI染色組,取10 mL 1.3.4節(jié)洗脫液,加入0.5 mL PI溶液。對照組無任何處理直接加入PI溶液。所有染色組都在37 ℃的黑暗環(huán)境中孵育15 min。6000×g、4 ℃離心10 min,無菌生理鹽水重懸沉淀兩次。接著使用熒光分光光度計(jì)測定吸光度,激發(fā)光波長為495 nm,發(fā)射光波長為615 nm,狹縫寬度為10 nm。以吸光度表征PI攝取量。

    1.3.8 細(xì)胞膜通透性測定

    用相同濃度稀釋不同處理后的洗脫液,并用電導(dǎo)率儀測定其電導(dǎo)率。利用電導(dǎo)率的變化表征不同處理對蛋殼表面大腸桿菌細(xì)胞膜通透性的影響。

    1.3.9 細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)損失的測定

    參照文獻(xiàn)[27]測定滅菌后洗脫液中核酸、可溶性蛋白和還原糖的含量。

    還原糖含量測定:取2 mL各處理后的洗脫液,加入乳糖膽鹽培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫培養(yǎng)3 h后,于6000 r/min離心10 min,采用直接滴定法測定不同處理后上清液中的還原糖含量。

    可溶性蛋白質(zhì)量濃度測定:使用Bradford法,取殺菌后的洗脫液2 mL,經(jīng)-20 ℃冷凍12 h后,加入0.01 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)緩沖液。取0.1 mL的處理過的樣品加入到10 mL試管中,加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250染料,混合均勻后靜置2 min,在595 nm波長處測定吸光度,利用牛血清白蛋白繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算相應(yīng)樣品的蛋白質(zhì)量濃度。

    核酸含量測定:將各處理后的洗脫液以6000 r/min離心10 min,然后取適量上清液置于石英比色皿中,直接用紫外分光光度計(jì)在260 nm波長處測定其吸光度,以表征核酸泄漏情況。

    1.3.10 雞蛋品質(zhì)分析

    將分組處理后的雞蛋置于室溫貯藏,分別測定其貯藏0 d和7 d的雞蛋品質(zhì)。

    1.3.10.1 質(zhì)量損失率

    質(zhì)量損失率與鮮蛋內(nèi)部的水分散失密切相關(guān)。采用質(zhì)量法進(jìn)行測定,通過電子天平測定雞蛋貯藏7 d期間的質(zhì)量變化,質(zhì)量損失率計(jì)算如式(9)所示:

    式中:m1為雞蛋貯藏前質(zhì)量/g;m2為雞蛋貯藏后質(zhì)量/g。

    1.3.10.2 濃蛋白高度

    濃蛋白高度被用作雞蛋整體質(zhì)量的衡量標(biāo)準(zhǔn),濃蛋白高度越高,雞蛋質(zhì)量越好。將雞蛋打破倒在蛋品檢測臺上,在保持蛋黃和濃蛋白完好的情況下,避開系帶用精密游標(biāo)卡尺測量蛋黃周圍濃蛋白中心部分的高度,取3 個等距離點(diǎn)的平均值為濃蛋白高度。

    1.3.10.3 哈夫單位

    哈夫單位按式(10)計(jì)算:

    式中:H為濃蛋白高度/mm;m為蛋質(zhì)量/g。

    1.3.10.4 蛋黃指數(shù)測定

    將被檢測蛋橫向磕破蛋殼,將蛋內(nèi)容物全部流入玻璃平皿內(nèi),用精度0.1 mm的游標(biāo)卡尺測量蛋黃高度與直徑,蛋黃高度與直徑之比為蛋黃指數(shù)(式(11))。

    式中:YI為蛋黃指數(shù);h為蛋黃高度/mm;d為蛋黃直徑/mm。

    1.3.10.5 蛋白pH值

    蛋白pH值的測定需將蛋黃與蛋清分離,用勻漿機(jī)將蛋清均質(zhì)2 min,每隔30 s停一次。然后用pH計(jì)測定其pH值。

    1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

    2 結(jié)果與分析

    2.1 超聲協(xié)同蒸汽對蛋殼表面大腸桿菌的影響

    由圖1可知,相比較蒸汽單獨(dú)處理,不同功率的超聲協(xié)同殺菌使大腸桿菌的致死率顯著增加;相同超聲功率(60 W)處理60 s協(xié)同蒸汽處理?xiàng)l件下,比單獨(dú)蒸汽處理1、2、3 s的致死率分別提高了47%、40%和61%。在同一蒸汽處理?xiàng)l件下,隨著超聲功率的增加,對蛋殼表面大腸桿菌的殺菌效果也逐漸增強(qiáng)。超聲60 W預(yù)處理180 s協(xié)同蒸汽處理1 s后,細(xì)菌存活率僅下降2.63 個對數(shù)值,超聲120 W預(yù)處理180 s協(xié)同蒸汽處理1 s后,細(xì)菌存活率下降3.11 個對數(shù)值,其他條件不變情況下,當(dāng)超聲功率達(dá)到150 W時,細(xì)菌存活率下降達(dá)到3.43 個對數(shù)值。同樣,在蒸汽處理2 s和3 s的條件下,也可以觀察到同樣的趨勢。由此可見,超聲波輔助確實(shí)能夠提高殺菌效果??赡茉蚴浅暡軌蛲ㄟ^強(qiáng)烈的空化效應(yīng)洗脫不牢固的微生物,同時也能夠增加細(xì)菌的通透性,從而提高殺菌效果。而由于菌體存在一定的自我防御能力以及抗性,當(dāng)超聲功率逐漸增大和處理時間逐漸延長時,穩(wěn)定的超聲波可以迅速打破細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的生理平衡,破壞細(xì)菌形態(tài)及其完整性,從而有助于后續(xù)的殺菌處理。此外,隨著蒸汽處理時間的延長,殺菌效果也逐漸增加,同一超聲功率(150 W)預(yù)處理180 s后,蒸汽處理時間由1 s延長到3 s時,大腸桿菌的存活率同比下降了67%。說明當(dāng)蒸汽時間持續(xù)的時間越長,擴(kuò)散作用越大,蒸汽的滲透率越高。使用150 W的超聲波進(jìn)行180 s預(yù)處理后再進(jìn)行3 s的蒸汽處理,大腸桿菌總數(shù)的對數(shù)值從6.26下降到2.04,此時對大腸桿菌的殺菌量能夠達(dá)到4.22 個對數(shù)值,對比單獨(dú)蒸汽處理的殺菌量提高了49%。弓敏等[28]使用超聲波協(xié)同次氯酸鈉處理蛋液中的典型腐敗菌(大腸桿菌、考克氏菌、枯草芽孢桿菌),發(fā)現(xiàn)超聲(150 W)與次氯酸鈉(200 mg/L、180 s)協(xié)同處理后大腸桿菌的殺菌率也在4 個對數(shù)值附近,與本研究結(jié)果接近。綜上,超聲波和蒸汽相結(jié)合會產(chǎn)生協(xié)同作用,從而加速微生物的死亡。

    圖1 超聲協(xié)同蒸汽對蛋殼表面大腸桿菌的殺菌效果Fig.1 Sterilization effect of ultrasound-assisted steam on E.coli on eggshell surface

    2.2 超聲協(xié)同蒸汽處理殺菌效果動力學(xué)分析

    由殺菌曲線可知,當(dāng)處理時間較短時,超聲協(xié)同蒸汽處理的殺菌曲線前端呈現(xiàn)出線性,但隨著時間以及超聲功率的增加,殺菌曲線分別逐漸出現(xiàn)向x軸靠攏和偏離的趨勢。為了更好地分析超聲協(xié)同蒸汽處理對雞蛋殼表面大腸桿菌的的殺菌動力學(xué)規(guī)律,本實(shí)驗(yàn)中采用了線性模型、Weibull、Log-Logistic以及Modified Gompertz 4 種模型對殺菌曲線進(jìn)行了擬合,擬合效果見表2。通常情況下,決定系數(shù)R2一般用來對模型的擬合程度做一個總體評價(jià)[29]。分析表2數(shù)據(jù)可知,當(dāng)采用線性模型擬合不同處理?xiàng)l件,其部分R2小于0.80,尤其是隨著蒸汽作用時間延長后,線性擬合的R2明顯降低,甚至出現(xiàn)了0.7196,說明線性擬合的效果較差。分析Weibull模型參數(shù)時,可以看出其R2均大于0.96,大部分條件下的R2均在0.99上下浮動。Log-Logistic模型對低強(qiáng)度超聲協(xié)同體系進(jìn)行擬合時,其R2相對高強(qiáng)度超聲協(xié)同體系較低,且該趨勢在不同時長蒸汽處理?xiàng)l件下都有體現(xiàn)。利用Modified Gompertz模型對整個超聲蒸汽協(xié)同體系的殺菌曲線擬合時,其R2保持在0.91~0.99之間。一般認(rèn)為微生物的殘留數(shù)量和時間呈線性關(guān)系,而通過本研究的模型分析發(fā)現(xiàn)超聲協(xié)同蒸汽處理對蛋殼表面大腸桿菌的殺菌更符合非線性動力學(xué)模型,并且通過分析3 種非線性模型的R2,發(fā)現(xiàn)Weibull模型更加符合整個殺菌過程。

    表2 4 種模型對大腸桿菌致死效果的動力學(xué)模型參數(shù)Table 2 Kineticmodel parameters of lethal efficiency of four models on E.coli

    2.3 模型擬合度評價(jià)

    為了更好地比較3 種非線性模型在超聲協(xié)同蒸汽處理過程中的擬合情況,本研究對Af、Bf、R2和RMSE進(jìn)行了評估。由表3可知,Log-Logistic模型和Modified Gompertz模型的Af分別為1.0804和1.0703,均小于Weibull模型(1.1000);且Weibull模型的R2為0.9867,大于Log-Logistic模型和Modified Gompertz模型;Weibull模型的Bf等于1.0001,更加接近1,說明模型的實(shí)測值和預(yù)測值之間的偏差較小。此外,RMSE也是評價(jià)模型的典型指標(biāo),從表3可知,Weibull模型的RMSE明顯小于Log-Logistic模型和Modified Gompertz模型。

    表3 數(shù)學(xué)模型評價(jià)參數(shù)的比較Table 3 Comparison of mathematical model evaluation parameters

    通過將實(shí)測數(shù)據(jù)作為橫坐標(biāo),模型預(yù)測數(shù)據(jù)作為縱坐標(biāo),可以使用線性擬合得到的相關(guān)方程和R2比較模型預(yù)測值與實(shí)測值之間的差異。由圖2可知,3 種模型的預(yù)測值與實(shí)測值之間有很好的相關(guān)性。線性相關(guān)方程的斜率及截距越接近于0,R2越接近于1,表明模型的擬合效果越好。Weibull模型、Log-Logistic模型以及Modified Gompertz模型擬合得到的方程分別為y=0.9885x+0.0336、y=0.9563x+0.0704、y=0.9720x+0.0602,其對應(yīng)的R2分別為0.99、0.94、0.96。因此,3 個模型中Weibull模型更好地?cái)M合了殼蛋表面大腸桿菌的失活曲線。

    2.4 殺菌機(jī)理分析

    2.4.1 大腸桿菌微觀結(jié)構(gòu)觀察

    如圖3所示,對照組的菌體結(jié)構(gòu)更為完整,呈現(xiàn)出典型的桿狀外形,胞體表面光滑,菌體形態(tài)完整,邊緣線條流暢。而不同的處理?xiàng)l件使得菌體表面出現(xiàn)了不同程度的損傷。次氯酸鈉處理組的菌體整體上依然比較完整,部分細(xì)胞表面損傷破裂,出現(xiàn)井噴現(xiàn)象。單獨(dú)超聲處理組與對照組組外觀基本相似,絕大部分菌體飽滿且完整。經(jīng)過單獨(dú)蒸汽處理的細(xì)菌菌體開始畸變,可以看出細(xì)菌出現(xiàn)溶解痕跡,細(xì)胞膜破裂,表面有黏附物,說明菌體破壞嚴(yán)重。而經(jīng)過超聲協(xié)同蒸汽處理的細(xì)菌,菌體外觀和表面結(jié)構(gòu)出現(xiàn)顯著變化,大部分細(xì)胞外部結(jié)構(gòu)發(fā)生嚴(yán)重變形,可以明顯觀察到細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)滲漏,從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡。通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn),除對照組外,其余各組的菌體細(xì)胞膜受到了各種程度的損傷,這是導(dǎo)致它們失活或死亡的一個重要原因。完整的菌體細(xì)胞膜可為細(xì)胞內(nèi)部提供一個穩(wěn)定的環(huán)境,保證了細(xì)胞與外界之間的有效物質(zhì)交換。當(dāng)細(xì)胞膜發(fā)生重大破壞時,其通透性會急劇增加,這可能會導(dǎo)致菌體死亡[30]。

    圖3 處理前后的掃描電鏡圖Fig.3 SEM before and after treatments

    2.4.2 PI攝取量

    PI是一種特殊的熒光染料,它能夠穿過不完整的細(xì)胞膜并與核酸類物質(zhì)結(jié)合,發(fā)出可以被檢測到的熒光。這種染料在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用,有助于了解菌體的完整狀況[31]。染料在處理前后分別添加到菌懸液中,通過在處理前加入PI染料,能測定比較不同處理過程中細(xì)胞膜完整性的變化;處理后PI染料的加入,則能夠反映不同處理后細(xì)胞膜損傷與修復(fù)狀況。

    從圖4可以看出,處理前加入PI,不同條件下染料的攝取量相應(yīng)發(fā)生改變。對比可知,次氯酸鈉處理和超聲協(xié)同蒸汽處理能在一定程度上破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性。這和掃描電鏡中觀察到的結(jié)果一致。此外,經(jīng)過次氯酸鈉、超聲處理后,PI熒光染料的攝取量顯著降低。說明經(jīng)過不同的處理,大腸桿菌中的一些細(xì)胞開始進(jìn)行自我修復(fù),從而恢復(fù)了一定的活性。而蒸汽處理和超聲協(xié)同蒸汽處理兩組在處理前后其PI的攝取量相差很小,表明膜完整性永久性喪失。推測其主要原因可能是高溫?zé)崽幚硎辜?xì)胞膜被破壞,呈全透性,胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)等基本完全流出,最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡[32]。

    圖4 不同處理?xiàng)l件對大腸桿菌細(xì)胞PI攝取量的影響Fig.4 Effects of different treatment conditions on PI uptake of E.coli

    2.4.3 電導(dǎo)率

    細(xì)胞膜破裂會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的離子(如鉀離子、鈣離子和鈉離子)大量滲出。因此電導(dǎo)率的變化可以在一定程度上反映細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的變化情況。從表4可以看出,超聲協(xié)同蒸汽處理組在各組別中電導(dǎo)率是最大的,說明超聲協(xié)同蒸汽處理能夠致使大腸桿菌細(xì)胞的細(xì)胞膜發(fā)生改變,從而導(dǎo)致培養(yǎng)液電導(dǎo)率顯著變化,這與Tao Yan等[33]研究結(jié)論一致,當(dāng)菌體細(xì)胞膜破壞程度越高,電導(dǎo)率越大。

    表4 不同處理?xiàng)l件下對大腸桿菌細(xì)胞膜通透性的影響Table 4 Effects of different treatment conditions on the membrane permeability of E.coli

    2.4.4 細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的損失

    當(dāng)細(xì)菌的細(xì)胞膜受到損傷時,大分子質(zhì)量的還原糖會流出,導(dǎo)致菌液中可溶性還原糖的含量增加??扇苄缘鞍踪|(zhì)是細(xì)胞生長過程中不可或缺的營養(yǎng)物質(zhì),其數(shù)量變化可以反映菌體蛋白質(zhì)合成的情況。核酸在紫外線波長260 nm處具有最強(qiáng)的吸收能力,并且吸光度與核酸濃度呈正比。因此,為了進(jìn)一步研究不同處理對蛋殼表面大腸桿菌菌株菌體的破壞情況,測定并比較了超聲協(xié)同蒸汽、單獨(dú)超聲、單獨(dú)蒸汽以及次氯酸鈉處理對細(xì)菌內(nèi)物質(zhì)損失的影響。如表5所示,幾種殺菌處理方式均可造成大腸桿菌菌體內(nèi)容物的滲漏,從而使得其還原糖、可溶性蛋白以及核酸泄漏量都出現(xiàn)增加的現(xiàn)象。超聲協(xié)同蒸汽處理與單獨(dú)超聲和單獨(dú)蒸汽處理相比,可溶性蛋白質(zhì)量濃度約提高了3.28 倍和1.72 倍,還原糖含量約提高了1.97 倍和1.19 倍,而核酸泄漏量提高了1.31 倍和1.07 倍,且單獨(dú)蒸汽和單獨(dú)超聲兩者作用效果相比差異不顯著(P>0.05),而單獨(dú)次氯酸鈉處理和超聲協(xié)同蒸汽處理效果稍強(qiáng)。由此說明次氯酸鈉處理和超聲協(xié)同蒸汽處理的菌體細(xì)胞膜在一定程度上遭到破壞,上清液中核酸與蛋白類物質(zhì)含量增加,導(dǎo)致細(xì)菌活性出現(xiàn)不同程度的喪失。且超聲協(xié)同蒸汽處理組細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)損失量更高,說明超聲協(xié)同蒸汽處理對菌體的損傷更為嚴(yán)重。由此可見,超聲協(xié)同蒸汽處理會極大程度地?fù)p傷菌體細(xì)胞膜,改變其細(xì)胞膜通透性,使菌體中可溶性蛋白及還原糖等物質(zhì)流失,加速菌體的死亡。

    表5 超聲協(xié)同蒸汽殺菌對細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)損失的影響Table 5 Effect of ultrasound-assisted steam sterilization on material loss in bacterial cells

    2.5 品質(zhì)指標(biāo)的測定結(jié)果

    質(zhì)量損失率是反映雞蛋品質(zhì)的一個重要指標(biāo),從表6可以看出,與對照組相比,兩種處理方法對貯藏7 d雞蛋質(zhì)量損失率的上升均有顯著的抑制作用,且次氯酸鈉處理組和超聲協(xié)同蒸汽處理組之間質(zhì)量損失率差異不顯著(P>0.05)。

    表6 未經(jīng)處理和清洗處理雞蛋品質(zhì)屬性的平均結(jié)果Table 6 Average results of quality attributes of untreated and washed eggs

    蛋白質(zhì)量是保障雞蛋新鮮度的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。通常用濃蛋白高度、哈夫單位以及蛋白pH值3 個指標(biāo)衡量,濃蛋白高度越高、哈夫單位越高,則蛋白品質(zhì)越好,雞蛋越新鮮。通過分析蛋白pH值的變化能更深入地了解雞蛋品質(zhì)的變化過程。如表6所示,貯藏前期,處理組與對照組相比,濃蛋白高度、哈夫單位和pH值差異均不明顯。說明處理并沒有使雞蛋蛋白發(fā)生變形。Perry等[34]將雞蛋浸泡在57 ℃的水中,直到內(nèi)部溫度不低于56 ℃,結(jié)果表明,經(jīng)過熱處理后,雞蛋哈夫單位從大約83顯著增加到98,雖然哈夫單位的增加被認(rèn)為是未經(jīng)處理雞蛋的積極品質(zhì)屬性,但熱處理雞蛋的哈夫單位增加是由于蛋白質(zhì)變性。通過貯藏7 d后的數(shù)據(jù)可以看出,處理組和對照組的濃蛋白高度和蛋白pH值之間差異顯著,說明不同消毒方法對濃蛋白高度和蛋白pH值變化抑制作用明顯。貯藏7 d后超聲協(xié)同蒸汽處理的哈夫單位為80.37,對照組為73.76,二者差異顯著。推測原因是蒸汽處理將蛋殼表面的細(xì)菌殺死并能在蛋殼表面形成一層極薄的膜,這樣既可以防止微生物侵入,也可以防止蛋內(nèi)水分蒸發(fā)和二氧化碳逸出,從而減少蛋的干耗和延緩變質(zhì)[35]。

    蛋黃品質(zhì)通常以蛋黃指數(shù)表示,新鮮雞蛋的蛋黃指數(shù)為0.38~0.49。由表6可知,0 d時對照組和超聲協(xié)同蒸汽處理組的蛋黃指數(shù)分別為0.44±0.01和0.43±0.02,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。類似的,以往的研究也并未發(fā)現(xiàn)巴氏殺菌后的蛋黃指數(shù)有顯著差異[36]。隨著貯藏時間的延長,雞蛋的蛋黃指數(shù)逐漸下降。與對照組相比,處理后的實(shí)驗(yàn)組蛋黃指數(shù)下降速率相對緩慢,說明在一定程度上延長了鮮蛋的保質(zhì)期。

    3 結(jié)論

    超聲波協(xié)同蒸汽處理能夠有效地殺死蛋殼表面的大腸桿菌。本實(shí)驗(yàn)中使用150 W的超聲波進(jìn)行180 s預(yù)處理后再進(jìn)行3 s的蒸汽處理,此時對大腸桿菌的殺菌量能夠達(dá)到4.22 個對數(shù)值,對比單獨(dú)蒸汽處理的殺菌量提高了49%。通過對超聲波協(xié)同蒸汽處理對大腸桿菌殺菌的動力學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)Weibull模型的決定系數(shù)R2>0.96,表明該模型能夠較好地模擬大腸桿菌失活的動力學(xué)過程。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn),超聲波協(xié)同蒸汽處理會對大腸桿菌的微觀結(jié)構(gòu)造成破壞,導(dǎo)致細(xì)胞壁的損傷,致使細(xì)胞內(nèi)容物外溢,從而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生不可逆死亡。此外,通過對處理后蛋品質(zhì)的監(jiān)測發(fā)現(xiàn),超聲波協(xié)同蒸汽處理可以使雞蛋在冷藏條件下保持較短時間內(nèi)的新鮮品質(zhì),并且效果比次氯酸鈉浸泡處理更好,說明超聲波協(xié)同蒸汽處理對雞蛋具有一定的保鮮作用。綜上,超聲協(xié)同蒸汽處理可能成為一種有效的消毒技術(shù),可用于清洗和消毒蛋制品表面,從而延長其保質(zhì)期。

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