超聲協(xié)同蒸汽處理對(duì)殼雞蛋表面大腸桿菌的殺菌機(jī)理及動(dòng)力學(xué)分析

張雅琪，遲玉杰,，遲 媛

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

作為一種具有綜合營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的食品，雞蛋和蛋類食品往往成為食源性微生物的攜帶者[1]。盡管新鮮雞蛋無(wú)菌或含有少量細(xì)菌，并且雞蛋自身也具備一些物理和化學(xué)防護(hù)機(jī)制[2]。但隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，其防御能力會(huì)逐漸減弱，各種微生物會(huì)侵入雞蛋并迅速繁殖，使新鮮雞蛋的品質(zhì)下降，甚至危害消費(fèi)者的健康[3]。其中大腸桿菌的檢出率高達(dá)70%，沙門氏菌的檢出率僅為5%左右[4-5]。為了防止雞蛋污染，最好在產(chǎn)蛋后立即進(jìn)行清洗和消毒。目前常用于清潔殼蛋表面的化學(xué)試劑浸泡法和熏蒸法容易出現(xiàn)化學(xué)試劑殘留問(wèn)題[6-7]，而大劑量的臭氧氣體又對(duì)人體有害[8]。

和其他消毒方法相比，熱處理能達(dá)到完全殺滅蛋殼表面細(xì)菌的效果。目前常見(jiàn)的帶殼全蛋熱殺菌一般采用水浴法或熱蒸汽法。水浴法是指將帶殼雞蛋浸泡于一定溫度的熱水中加熱升溫，最終殺死致病菌。Geveke等[9]證實(shí)，熱水浸泡過(guò)程能夠使帶殼雞蛋的耐熱腸炎沙門氏菌失活4.5 個(gè)對(duì)數(shù)值。Himathongkham等[10]將蛋殼雞蛋浸入腸炎沙門氏菌的培養(yǎng)物中，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌可以穿透蛋殼到達(dá)細(xì)胞膜，將染菌雞蛋在沸水中浸泡3 s即可完全殺滅細(xì)菌，效果優(yōu)于其他所有測(cè)試方法（主要是化學(xué)方法）。但水浴法通常會(huì)導(dǎo)致蛋殼破裂，從而造成不必要的損失，因此應(yīng)用較為有限。蒸汽因?yàn)槠錆撛谀芰靠梢栽诤芏痰臅r(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)移到表面，常用于食品工業(yè)儀器表面的清潔和消毒，以及化妝品和藥品的生產(chǎn)[11]。目前蒸汽處理在減少雞肉、杏仁和新鮮切果蔬表面細(xì)菌數(shù)量方面取得了一定的成功[12]。Zion等[13]設(shè)計(jì)出一款蒸汽熱阱，經(jīng)過(guò)幾秒鐘的短時(shí)處理即能實(shí)現(xiàn)對(duì)人工接種新鮮蛋殼上沙門氏菌的完全滅活。已有研究表明，95 ℃條件下，雞蛋可以承受長(zhǎng)達(dá)10 s的蒸汽處理，而此時(shí)蛋內(nèi)部溫度僅為40 ℃左右，不會(huì)使雞蛋內(nèi)部發(fā)生大量變性和破壞；而在沸水中處理時(shí)長(zhǎng)超過(guò)3 s時(shí)，部分蛋殼會(huì)出現(xiàn)裂紋，且長(zhǎng)時(shí)間的加熱會(huì)對(duì)其功能性質(zhì)產(chǎn)生很大影響[14]。因此需要嚴(yán)格控制蒸汽處理時(shí)間。

超聲波空化已被證明能夠通過(guò)增強(qiáng)細(xì)菌的凝聚能力實(shí)現(xiàn)殺菌[15-16]。然而，單獨(dú)使用超聲波處理時(shí)，很容易導(dǎo)致殺菌不夠徹底。因此常將其與其他殺菌手段結(jié)合，利用它們之間的協(xié)同效應(yīng)顯著提高殺菌效果[17]。此外，還有部分研究表明，在聲熱復(fù)合處理過(guò)程中，超聲波預(yù)處理可以在細(xì)胞內(nèi)造成一定程度的非致死性損傷，導(dǎo)致微生物物理性損傷，從而提高熱處理對(duì)微生物細(xì)胞的殺傷效率，使其對(duì)熱處理更加敏感[18-19]。因此，通過(guò)充分利用超聲波輔助熱殺菌過(guò)程中兩者之間的協(xié)同作用，可以有效減少食品中微生物污染，并節(jié)省成本。

動(dòng)力學(xué)模型是研究微生物殺菌效果的重要工具，可為實(shí)際應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立殺菌動(dòng)力學(xué)模型研究超聲協(xié)同蒸汽處理對(duì)蛋殼表面大腸桿菌的殺菌效果，以期為殺滅蛋殼表面微生物提供方法依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮A級(jí)雞蛋（平均質(zhì)量45～55 g）好優(yōu)多超市（產(chǎn)自中國(guó)黑龍江省雙縣農(nóng)場(chǎng)），購(gòu)買后24 h內(nèi)使用；大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC 25922 福建賽莫爾科學(xué)實(shí)驗(yàn)用品城。

平板技術(shù)瓊脂、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂 上海博微生物技科技有限公司；次氯酸鈉（NaClO）溶液 汕頭市蓮塘化工廠有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250、碘化丙啶（propidium iodide，PI）北京索萊寶科技有限公司；氯化鈉、氫氧化鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1810紫外-可見(jiàn)分光光度儀 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；KQ3200DE型數(shù)控超聲清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；CHA-S型氣浴振蕩恒溫培養(yǎng)箱蘇州市國(guó)飛實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司；YX180B型高壓滅菌鍋天津賽得利斯實(shí)驗(yàn)分析儀器制造廠；MK-21A高速冷凍離心機(jī) 湖南邁克爾實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；DDB-11A電導(dǎo)率儀 杭州齊威儀器有限公司；F-7100型熒光分光光度計(jì)、SU8010型場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液制備

參照文獻(xiàn)[20]的方法并進(jìn)行改進(jìn)。將大腸桿菌菌株在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板劃線后，在37 ℃的環(huán)境中活化24 h，然后挑取適量的菌株放入100 mL的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，置于恒溫振蕩器中，以37 ℃、200 r/min條件孵育12 h。將含有細(xì)菌的培養(yǎng)基以6000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)基，用無(wú)菌生理鹽水適當(dāng)稀釋。根據(jù)GB 4789.2—2022《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》中平板計(jì)數(shù)法計(jì)算原始細(xì)菌數(shù)，便于下一步制備不同濃度的細(xì)菌懸浮液。

1.3.2 接種

選擇產(chǎn)后質(zhì)量為50～70 g的新鮮雞蛋，且照蛋檢查無(wú)細(xì)微裂紋、氣室偏移以及蛋黃出現(xiàn)陰影等問(wèn)題。用無(wú)菌脫脂棉球蘸體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液擦拭蛋殼表面，擦拭后將其放在超凈工作臺(tái)上紫外線照射30 min，殺滅蛋殼表面的細(xì)菌。檢測(cè)處理過(guò)的雞蛋表面細(xì)菌總數(shù)。準(zhǔn)備濃度約為108CFU/mL的大腸桿菌懸浮液，將雞蛋在細(xì)菌懸浮液中浸泡1 h，然后取出雞蛋放在無(wú)菌操作平臺(tái)上干燥備用。

1.3.3 殺菌處理

選擇接種并干燥后完整備用的雞蛋，對(duì)其進(jìn)行分組。分組后參照不同方法對(duì)鮮蛋蛋殼進(jìn)行處理，具體方法見(jiàn)表1。

表1 不同殺菌處理方法Table 1 Different sterilization methods

1.3.4 雞蛋殼表面殘余菌數(shù)的檢測(cè)

用無(wú)菌棉球蘸取適量無(wú)菌生理鹽水，擦拭各組接種雞蛋的整個(gè)表面，將棉球浸泡在100 mL無(wú)菌生理鹽水中充分混勻，獲得處理過(guò)的洗脫液。大腸桿菌計(jì)數(shù)可參考GB 4789.3—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》中的第二法——大腸菌群平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)。利用殺菌前后樣品大腸桿菌殘存率對(duì)數(shù)值表示超聲波協(xié)同蒸汽的致死效果，致死率按式（1）計(jì)算：

式中：N0和N分別為殺菌前后菌落數(shù)/（CFU/mL）。

1.3.5 數(shù)學(xué)模型的建立

1.3.5.1 線性模型

D值是指在一定的溫度條件下，殺滅90%的活菌數(shù)或者芽孢數(shù)所需要的時(shí)間，是表示微生物死亡速率的一種方法。該模型假設(shè)微生物對(duì)殺菌條件具有相同的抗性，致死動(dòng)力學(xué)可以用線性模型描述，微生物數(shù)量下降對(duì)數(shù)值隨時(shí)間的變化呈線性變化。線性模型計(jì)算如式（2）所示：

式中：N0為殺菌處理前大腸桿菌數(shù)量/（CFU/mL）；N為殺菌處理后大腸桿菌數(shù)量/（CFU/mL）；t為殺菌時(shí)間/s；D為指數(shù)遞減時(shí)間/s。

1.3.5.2 Weibull模型

該模型由Weibull提出，通常用于描述各種凹凸性曲線[21-22]。Weibull模型假設(shè)菌體之間的熱抗性和耐壓性存在差別，其存活曲線符合累積分布函數(shù)[23]。Weibull模型計(jì)算如式（3）所示：

式中：a為規(guī)模參數(shù)；b為形狀因子；t為殺菌時(shí)間/s。

1.3.5.3 Log-Logistic模型

該模型是假設(shè)菌體對(duì)殺菌強(qiáng)度的抗性不同。本研究在文獻(xiàn)[24]的基礎(chǔ)上做了簡(jiǎn)化處理，Log-Logistic模型計(jì)算如式（4）所示：

式中：p為最低殘存菌數(shù)；q、m為曲線方程的參數(shù)；t為殺菌時(shí)間/s。

1.3.5.4 Modified Gompertz模型

本研究在文獻(xiàn)[25]的基礎(chǔ)上做了簡(jiǎn)化處理，Modified Gompertz模型如式（5）所示：

式中：a為曲線下漸近線值；b為（Kdm×e）/a，其中Kdm為曲線指數(shù)階段的線性失活率；c為細(xì)菌滯后階段的時(shí)間/s；t為殺菌時(shí)間/s。

1.3.5.5 模型評(píng)價(jià)

采用精確因子（Af）、偏差因子（Bf）、均方根誤差（root mean squared error，RMSE）和決定系數(shù)（R2）4 個(gè)參數(shù)評(píng)價(jià)模型擬合度的優(yōu)劣[26]。其中，Af和Bf反映模型的性能，Af值越小，Bf值越接近于1，模型的擬合度就越高；R2和RMSE反映模型的可靠度，R2越大，RMSE越小，模型的擬合度越好。Af、Bf、RMSE的計(jì)算如式（6）～（8）所示：

式中：n為實(shí)測(cè)值的個(gè)數(shù)；p為考察指標(biāo)數(shù)。

1.3.6 掃描電鏡觀察

將各處理組的洗脫液加入滅菌的10 mL離心管中，以8000 r/min離心3 min，棄去上清液，加入滅菌生理鹽水洗滌兩次，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管，得到菌懸液。樣品經(jīng)過(guò)固定、干燥、脫水、置換、冷凍干燥后離子濺射鍍金，掃描電鏡觀察菌體結(jié)構(gòu)。未經(jīng)滅菌的對(duì)照樣品進(jìn)行類似處理。

1.3.7 PI攝取量測(cè)定

將PI溶于去離子水中，制備成1 mg/mL的溶液，并在4 ℃的黑暗環(huán)境中貯存。各處理組洗脫液8000×g、4 ℃離心10 min，棄去上清液，用無(wú)菌生理鹽水調(diào)整菌液濃度至106CFU/mL。實(shí)驗(yàn)分為滅菌處理前和滅菌處理后PI染色：對(duì)于滅菌處理前的PI染色組，需要將未經(jīng)處理的菌液分別加入0.5 mL的PI溶液，然后接種雞蛋，并對(duì)其進(jìn)行相應(yīng)的處理和洗脫；對(duì)于處理后的PI染色組，取10 mL 1.3.4節(jié)洗脫液，加入0.5 mL PI溶液。對(duì)照組無(wú)任何處理直接加入PI溶液。所有染色組都在37 ℃的黑暗環(huán)境中孵育15 min。6000×g、4 ℃離心10 min，無(wú)菌生理鹽水重懸沉淀兩次。接著使用熒光分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，激發(fā)光波長(zhǎng)為495 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為615 nm，狹縫寬度為10 nm。以吸光度表征PI攝取量。

1.3.8 細(xì)胞膜通透性測(cè)定

用相同濃度稀釋不同處理后的洗脫液，并用電導(dǎo)率儀測(cè)定其電導(dǎo)率。利用電導(dǎo)率的變化表征不同處理對(duì)蛋殼表面大腸桿菌細(xì)胞膜通透性的影響。

1.3.9 細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)損失的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[27]測(cè)定滅菌后洗脫液中核酸、可溶性蛋白和還原糖的含量。

還原糖含量測(cè)定：取2 mL各處理后的洗脫液，加入乳糖膽鹽培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)3 h后，于6000 r/min離心10 min，采用直接滴定法測(cè)定不同處理后上清液中的還原糖含量。

可溶性蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定：使用Bradford法，取殺菌后的洗脫液2 mL，經(jīng)－20 ℃冷凍12 h后，加入0.01 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液。取0.1 mL的處理過(guò)的樣品加入到10 mL試管中，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250染料，混合均勻后靜置2 min，在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，利用牛血清白蛋白繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算相應(yīng)樣品的蛋白質(zhì)量濃度。

核酸含量測(cè)定：將各處理后的洗脫液以6000 r/min離心10 min，然后取適量上清液置于石英比色皿中，直接用紫外分光光度計(jì)在260 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，以表征核酸泄漏情況。

1.3.10 雞蛋品質(zhì)分析

將分組處理后的雞蛋置于室溫貯藏，分別測(cè)定其貯藏0 d和7 d的雞蛋品質(zhì)。

1.3.10.1 質(zhì)量損失率

質(zhì)量損失率與鮮蛋內(nèi)部的水分散失密切相關(guān)。采用質(zhì)量法進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)電子天平測(cè)定雞蛋貯藏7 d期間的質(zhì)量變化，質(zhì)量損失率計(jì)算如式（9）所示：

式中：m1為雞蛋貯藏前質(zhì)量/g；m2為雞蛋貯藏后質(zhì)量/g。

1.3.10.2 濃蛋白高度

濃蛋白高度被用作雞蛋整體質(zhì)量的衡量標(biāo)準(zhǔn)，濃蛋白高度越高，雞蛋質(zhì)量越好。將雞蛋打破倒在蛋品檢測(cè)臺(tái)上，在保持蛋黃和濃蛋白完好的情況下，避開(kāi)系帶用精密游標(biāo)卡尺測(cè)量蛋黃周圍濃蛋白中心部分的高度，取3 個(gè)等距離點(diǎn)的平均值為濃蛋白高度。

1.3.10.3 哈夫單位

哈夫單位按式（10）計(jì)算：

式中：H為濃蛋白高度/mm；m為蛋質(zhì)量/g。

1.3.10.4 蛋黃指數(shù)測(cè)定

將被檢測(cè)蛋橫向磕破蛋殼，將蛋內(nèi)容物全部流入玻璃平皿內(nèi)，用精度0.1 mm的游標(biāo)卡尺測(cè)量蛋黃高度與直徑，蛋黃高度與直徑之比為蛋黃指數(shù)（式（11））。

式中：YI為蛋黃指數(shù)；h為蛋黃高度/mm；d為蛋黃直徑/mm。

1.3.10.5 蛋白pH值

蛋白pH值的測(cè)定需將蛋黃與蛋清分離，用勻漿機(jī)將蛋清均質(zhì)2 min，每隔30 s停一次。然后用pH計(jì)測(cè)定其pH值。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲協(xié)同蒸汽對(duì)蛋殼表面大腸桿菌的影響

由圖1可知，相比較蒸汽單獨(dú)處理，不同功率的超聲協(xié)同殺菌使大腸桿菌的致死率顯著增加；相同超聲功率（60 W）處理60 s協(xié)同蒸汽處理?xiàng)l件下，比單獨(dú)蒸汽處理1、2、3 s的致死率分別提高了47%、40%和61%。在同一蒸汽處理?xiàng)l件下，隨著超聲功率的增加，對(duì)蛋殼表面大腸桿菌的殺菌效果也逐漸增強(qiáng)。超聲60 W預(yù)處理180 s協(xié)同蒸汽處理1 s后，細(xì)菌存活率僅下降2.63 個(gè)對(duì)數(shù)值，超聲120 W預(yù)處理180 s協(xié)同蒸汽處理1 s后，細(xì)菌存活率下降3.11 個(gè)對(duì)數(shù)值，其他條件不變情況下，當(dāng)超聲功率達(dá)到150 W時(shí)，細(xì)菌存活率下降達(dá)到3.43 個(gè)對(duì)數(shù)值。同樣，在蒸汽處理2 s和3 s的條件下，也可以觀察到同樣的趨勢(shì)。由此可見(jiàn)，超聲波輔助確實(shí)能夠提高殺菌效果。可能原因是超聲波能夠通過(guò)強(qiáng)烈的空化效應(yīng)洗脫不牢固的微生物，同時(shí)也能夠增加細(xì)菌的通透性，從而提高殺菌效果。而由于菌體存在一定的自我防御能力以及抗性，當(dāng)超聲功率逐漸增大和處理時(shí)間逐漸延長(zhǎng)時(shí)，穩(wěn)定的超聲波可以迅速打破細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的生理平衡，破壞細(xì)菌形態(tài)及其完整性，從而有助于后續(xù)的殺菌處理。此外，隨著蒸汽處理時(shí)間的延長(zhǎng)，殺菌效果也逐漸增加，同一超聲功率（150 W）預(yù)處理180 s后，蒸汽處理時(shí)間由1 s延長(zhǎng)到3 s時(shí)，大腸桿菌的存活率同比下降了67%。說(shuō)明當(dāng)蒸汽時(shí)間持續(xù)的時(shí)間越長(zhǎng)，擴(kuò)散作用越大，蒸汽的滲透率越高。使用150 W的超聲波進(jìn)行180 s預(yù)處理后再進(jìn)行3 s的蒸汽處理，大腸桿菌總數(shù)的對(duì)數(shù)值從6.26下降到2.04，此時(shí)對(duì)大腸桿菌的殺菌量能夠達(dá)到4.22 個(gè)對(duì)數(shù)值，對(duì)比單獨(dú)蒸汽處理的殺菌量提高了49%。弓敏等[28]使用超聲波協(xié)同次氯酸鈉處理蛋液中的典型腐敗菌（大腸桿菌、考克氏菌、枯草芽孢桿菌），發(fā)現(xiàn)超聲（150 W）與次氯酸鈉（200 mg/L、180 s）協(xié)同處理后大腸桿菌的殺菌率也在4 個(gè)對(duì)數(shù)值附近，與本研究結(jié)果接近。綜上，超聲波和蒸汽相結(jié)合會(huì)產(chǎn)生協(xié)同作用，從而加速微生物的死亡。

圖1 超聲協(xié)同蒸汽對(duì)蛋殼表面大腸桿菌的殺菌效果Fig.1 Sterilization effect of ultrasound-assisted steam on E.coli on eggshell surface

2.2 超聲協(xié)同蒸汽處理殺菌效果動(dòng)力學(xué)分析

由殺菌曲線可知，當(dāng)處理時(shí)間較短時(shí)，超聲協(xié)同蒸汽處理的殺菌曲線前端呈現(xiàn)出線性，但隨著時(shí)間以及超聲功率的增加，殺菌曲線分別逐漸出現(xiàn)向x軸靠攏和偏離的趨勢(shì)。為了更好地分析超聲協(xié)同蒸汽處理對(duì)雞蛋殼表面大腸桿菌的的殺菌動(dòng)力學(xué)規(guī)律，本實(shí)驗(yàn)中采用了線性模型、Weibull、Log-Logistic以及Modified Gompertz 4 種模型對(duì)殺菌曲線進(jìn)行了擬合，擬合效果見(jiàn)表2。通常情況下，決定系數(shù)R2一般用來(lái)對(duì)模型的擬合程度做一個(gè)總體評(píng)價(jià)[29]。分析表2數(shù)據(jù)可知，當(dāng)采用線性模型擬合不同處理?xiàng)l件，其部分R2小于0.80，尤其是隨著蒸汽作用時(shí)間延長(zhǎng)后，線性擬合的R2明顯降低，甚至出現(xiàn)了0.7196，說(shuō)明線性擬合的效果較差。分析Weibull模型參數(shù)時(shí)，可以看出其R2均大于0.96，大部分條件下的R2均在0.99上下浮動(dòng)。Log-Logistic模型對(duì)低強(qiáng)度超聲協(xié)同體系進(jìn)行擬合時(shí)，其R2相對(duì)高強(qiáng)度超聲協(xié)同體系較低，且該趨勢(shì)在不同時(shí)長(zhǎng)蒸汽處理?xiàng)l件下都有體現(xiàn)。利用Modified Gompertz模型對(duì)整個(gè)超聲蒸汽協(xié)同體系的殺菌曲線擬合時(shí)，其R2保持在0.91～0.99之間。一般認(rèn)為微生物的殘留數(shù)量和時(shí)間呈線性關(guān)系，而通過(guò)本研究的模型分析發(fā)現(xiàn)超聲協(xié)同蒸汽處理對(duì)蛋殼表面大腸桿菌的殺菌更符合非線性動(dòng)力學(xué)模型，并且通過(guò)分析3 種非線性模型的R2，發(fā)現(xiàn)Weibull模型更加符合整個(gè)殺菌過(guò)程。

表2 4 種模型對(duì)大腸桿菌致死效果的動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)Table 2 Kineticmodel parameters of lethal efficiency of four models on E.coli

2.3 模型擬合度評(píng)價(jià)

為了更好地比較3 種非線性模型在超聲協(xié)同蒸汽處理過(guò)程中的擬合情況，本研究對(duì)Af、Bf、R2和RMSE進(jìn)行了評(píng)估。由表3可知，Log-Logistic模型和Modified Gompertz模型的Af分別為1.0804和1.0703，均小于Weibull模型（1.1000）；且Weibull模型的R2為0.9867，大于Log-Logistic模型和Modified Gompertz模型；Weibull模型的Bf等于1.0001，更加接近1，說(shuō)明模型的實(shí)測(cè)值和預(yù)測(cè)值之間的偏差較小。此外，RMSE也是評(píng)價(jià)模型的典型指標(biāo)，從表3可知，Weibull模型的RMSE明顯小于Log-Logistic模型和Modified Gompertz模型。

表3 數(shù)學(xué)模型評(píng)價(jià)參數(shù)的比較Table 3 Comparison of mathematical model evaluation parameters

通過(guò)將實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)作為橫坐標(biāo)，模型預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)作為縱坐標(biāo)，可以使用線性擬合得到的相關(guān)方程和R2比較模型預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間的差異。由圖2可知，3 種模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間有很好的相關(guān)性。線性相關(guān)方程的斜率及截距越接近于0，R2越接近于1，表明模型的擬合效果越好。Weibull模型、Log-Logistic模型以及Modified Gompertz模型擬合得到的方程分別為y＝0.9885x＋0.0336、y＝0.9563x＋0.0704、y＝0.9720x＋0.0602，其對(duì)應(yīng)的R2分別為0.99、0.94、0.96。因此，3 個(gè)模型中Weibull模型更好地?cái)M合了殼蛋表面大腸桿菌的失活曲線。

2.4 殺菌機(jī)理分析

2.4.1 大腸桿菌微觀結(jié)構(gòu)觀察

如圖3所示，對(duì)照組的菌體結(jié)構(gòu)更為完整，呈現(xiàn)出典型的桿狀外形，胞體表面光滑，菌體形態(tài)完整，邊緣線條流暢。而不同的處理?xiàng)l件使得菌體表面出現(xiàn)了不同程度的損傷。次氯酸鈉處理組的菌體整體上依然比較完整，部分細(xì)胞表面損傷破裂，出現(xiàn)井噴現(xiàn)象。單獨(dú)超聲處理組與對(duì)照組組外觀基本相似，絕大部分菌體飽滿且完整。經(jīng)過(guò)單獨(dú)蒸汽處理的細(xì)菌菌體開(kāi)始畸變，可以看出細(xì)菌出現(xiàn)溶解痕跡，細(xì)胞膜破裂，表面有黏附物，說(shuō)明菌體破壞嚴(yán)重。而經(jīng)過(guò)超聲協(xié)同蒸汽處理的細(xì)菌，菌體外觀和表面結(jié)構(gòu)出現(xiàn)顯著變化，大部分細(xì)胞外部結(jié)構(gòu)發(fā)生嚴(yán)重變形，可以明顯觀察到細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)滲漏，從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡。通過(guò)掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，除對(duì)照組外，其余各組的菌體細(xì)胞膜受到了各種程度的損傷，這是導(dǎo)致它們失活或死亡的一個(gè)重要原因。完整的菌體細(xì)胞膜可為細(xì)胞內(nèi)部提供一個(gè)穩(wěn)定的環(huán)境，保證了細(xì)胞與外界之間的有效物質(zhì)交換。當(dāng)細(xì)胞膜發(fā)生重大破壞時(shí)，其通透性會(huì)急劇增加，這可能會(huì)導(dǎo)致菌體死亡[30]。

圖3 處理前后的掃描電鏡圖Fig.3 SEM before and after treatments

2.4.2 PI攝取量

PI是一種特殊的熒光染料，它能夠穿過(guò)不完整的細(xì)胞膜并與核酸類物質(zhì)結(jié)合，發(fā)出可以被檢測(cè)到的熒光。這種染料在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用，有助于了解菌體的完整狀況[31]。染料在處理前后分別添加到菌懸液中，通過(guò)在處理前加入PI染料，能測(cè)定比較不同處理過(guò)程中細(xì)胞膜完整性的變化；處理后PI染料的加入，則能夠反映不同處理后細(xì)胞膜損傷與修復(fù)狀況。

從圖4可以看出，處理前加入PI，不同條件下染料的攝取量相應(yīng)發(fā)生改變。對(duì)比可知，次氯酸鈉處理和超聲協(xié)同蒸汽處理能在一定程度上破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性。這和掃描電鏡中觀察到的結(jié)果一致。此外，經(jīng)過(guò)次氯酸鈉、超聲處理后，PI熒光染料的攝取量顯著降低。說(shuō)明經(jīng)過(guò)不同的處理，大腸桿菌中的一些細(xì)胞開(kāi)始進(jìn)行自我修復(fù)，從而恢復(fù)了一定的活性。而蒸汽處理和超聲協(xié)同蒸汽處理兩組在處理前后其PI的攝取量相差很小，表明膜完整性永久性喪失。推測(cè)其主要原因可能是高溫?zé)崽幚硎辜?xì)胞膜被破壞，呈全透性，胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)等基本完全流出，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡[32]。

圖4 不同處理?xiàng)l件對(duì)大腸桿菌細(xì)胞PI攝取量的影響Fig.4 Effects of different treatment conditions on PI uptake of E.coli

2.4.3 電導(dǎo)率

細(xì)胞膜破裂會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的離子（如鉀離子、鈣離子和鈉離子）大量滲出。因此電導(dǎo)率的變化可以在一定程度上反映細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的變化情況。從表4可以看出，超聲協(xié)同蒸汽處理組在各組別中電導(dǎo)率是最大的，說(shuō)明超聲協(xié)同蒸汽處理能夠致使大腸桿菌細(xì)胞的細(xì)胞膜發(fā)生改變，從而導(dǎo)致培養(yǎng)液電導(dǎo)率顯著變化，這與Tao Yan等[33]研究結(jié)論一致，當(dāng)菌體細(xì)胞膜破壞程度越高，電導(dǎo)率越大。

表4 不同處理?xiàng)l件下對(duì)大腸桿菌細(xì)胞膜通透性的影響Table 4 Effects of different treatment conditions on the membrane permeability of E.coli

2.4.4 細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的損失

當(dāng)細(xì)菌的細(xì)胞膜受到損傷時(shí)，大分子質(zhì)量的還原糖會(huì)流出，導(dǎo)致菌液中可溶性還原糖的含量增加?？扇苄缘鞍踪|(zhì)是細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中不可或缺的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其數(shù)量變化可以反映菌體蛋白質(zhì)合成的情況。核酸在紫外線波長(zhǎng)260 nm處具有最強(qiáng)的吸收能力，并且吸光度與核酸濃度呈正比。因此，為了進(jìn)一步研究不同處理對(duì)蛋殼表面大腸桿菌菌株菌體的破壞情況，測(cè)定并比較了超聲協(xié)同蒸汽、單獨(dú)超聲、單獨(dú)蒸汽以及次氯酸鈉處理對(duì)細(xì)菌內(nèi)物質(zhì)損失的影響。如表5所示，幾種殺菌處理方式均可造成大腸桿菌菌體內(nèi)容物的滲漏，從而使得其還原糖、可溶性蛋白以及核酸泄漏量都出現(xiàn)增加的現(xiàn)象。超聲協(xié)同蒸汽處理與單獨(dú)超聲和單獨(dú)蒸汽處理相比，可溶性蛋白質(zhì)量濃度約提高了3.28 倍和1.72 倍，還原糖含量約提高了1.97 倍和1.19 倍，而核酸泄漏量提高了1.31 倍和1.07 倍，且單獨(dú)蒸汽和單獨(dú)超聲兩者作用效果相比差異不顯著（P＞0.05），而單獨(dú)次氯酸鈉處理和超聲協(xié)同蒸汽處理效果稍強(qiáng)。由此說(shuō)明次氯酸鈉處理和超聲協(xié)同蒸汽處理的菌體細(xì)胞膜在一定程度上遭到破壞，上清液中核酸與蛋白類物質(zhì)含量增加，導(dǎo)致細(xì)菌活性出現(xiàn)不同程度的喪失。且超聲協(xié)同蒸汽處理組細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)損失量更高，說(shuō)明超聲協(xié)同蒸汽處理對(duì)菌體的損傷更為嚴(yán)重。由此可見(jiàn)，超聲協(xié)同蒸汽處理會(huì)極大程度地?fù)p傷菌體細(xì)胞膜，改變其細(xì)胞膜通透性，使菌體中可溶性蛋白及還原糖等物質(zhì)流失，加速菌體的死亡。

表5 超聲協(xié)同蒸汽殺菌對(duì)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)損失的影響Table 5 Effect of ultrasound-assisted steam sterilization on material loss in bacterial cells

2.5 品質(zhì)指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果

質(zhì)量損失率是反映雞蛋品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)，從表6可以看出，與對(duì)照組相比，兩種處理方法對(duì)貯藏7 d雞蛋質(zhì)量損失率的上升均有顯著的抑制作用，且次氯酸鈉處理組和超聲協(xié)同蒸汽處理組之間質(zhì)量損失率差異不顯著（P＞0.05）。

表6 未經(jīng)處理和清洗處理雞蛋品質(zhì)屬性的平均結(jié)果Table 6 Average results of quality attributes of untreated and washed eggs

蛋白質(zhì)量是保障雞蛋新鮮度的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。通常用濃蛋白高度、哈夫單位以及蛋白pH值3 個(gè)指標(biāo)衡量，濃蛋白高度越高、哈夫單位越高，則蛋白品質(zhì)越好，雞蛋越新鮮。通過(guò)分析蛋白pH值的變化能更深入地了解雞蛋品質(zhì)的變化過(guò)程。如表6所示，貯藏前期，處理組與對(duì)照組相比，濃蛋白高度、哈夫單位和pH值差異均不明顯。說(shuō)明處理并沒(méi)有使雞蛋蛋白發(fā)生變形。Perry等[34]將雞蛋浸泡在57 ℃的水中，直到內(nèi)部溫度不低于56 ℃，結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)熱處理后，雞蛋哈夫單位從大約83顯著增加到98，雖然哈夫單位的增加被認(rèn)為是未經(jīng)處理雞蛋的積極品質(zhì)屬性，但熱處理雞蛋的哈夫單位增加是由于蛋白質(zhì)變性。通過(guò)貯藏7 d后的數(shù)據(jù)可以看出，處理組和對(duì)照組的濃蛋白高度和蛋白pH值之間差異顯著，說(shuō)明不同消毒方法對(duì)濃蛋白高度和蛋白pH值變化抑制作用明顯。貯藏7 d后超聲協(xié)同蒸汽處理的哈夫單位為80.37，對(duì)照組為73.76，二者差異顯著。推測(cè)原因是蒸汽處理將蛋殼表面的細(xì)菌殺死并能在蛋殼表面形成一層極薄的膜，這樣既可以防止微生物侵入，也可以防止蛋內(nèi)水分蒸發(fā)和二氧化碳逸出，從而減少蛋的干耗和延緩變質(zhì)[35]。

蛋黃品質(zhì)通常以蛋黃指數(shù)表示，新鮮雞蛋的蛋黃指數(shù)為0.38～0.49。由表6可知，0 d時(shí)對(duì)照組和超聲協(xié)同蒸汽處理組的蛋黃指數(shù)分別為0.44±0.01和0.43±0.02，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。類似的，以往的研究也并未發(fā)現(xiàn)巴氏殺菌后的蛋黃指數(shù)有顯著差異[36]。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，雞蛋的蛋黃指數(shù)逐漸下降。與對(duì)照組相比，處理后的實(shí)驗(yàn)組蛋黃指數(shù)下降速率相對(duì)緩慢，說(shuō)明在一定程度上延長(zhǎng)了鮮蛋的保質(zhì)期。

3 結(jié)論

超聲波協(xié)同蒸汽處理能夠有效地殺死蛋殼表面的大腸桿菌。本實(shí)驗(yàn)中使用150 W的超聲波進(jìn)行180 s預(yù)處理后再進(jìn)行3 s的蒸汽處理，此時(shí)對(duì)大腸桿菌的殺菌量能夠達(dá)到4.22 個(gè)對(duì)數(shù)值，對(duì)比單獨(dú)蒸汽處理的殺菌量提高了49%。通過(guò)對(duì)超聲波協(xié)同蒸汽處理對(duì)大腸桿菌殺菌的動(dòng)力學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)Weibull模型的決定系數(shù)R2＞0.96，表明該模型能夠較好地模擬大腸桿菌失活的動(dòng)力學(xué)過(guò)程。經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，超聲波協(xié)同蒸汽處理會(huì)對(duì)大腸桿菌的微觀結(jié)構(gòu)造成破壞，導(dǎo)致細(xì)胞壁的損傷，致使細(xì)胞內(nèi)容物外溢，從而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生不可逆死亡。此外，通過(guò)對(duì)處理后蛋品質(zhì)的監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，超聲波協(xié)同蒸汽處理可以使雞蛋在冷藏條件下保持較短時(shí)間內(nèi)的新鮮品質(zhì)，并且效果比次氯酸鈉浸泡處理更好，說(shuō)明超聲波協(xié)同蒸汽處理對(duì)雞蛋具有一定的保鮮作用。綜上，超聲協(xié)同蒸汽處理可能成為一種有效的消毒技術(shù)，可用于清洗和消毒蛋制品表面，從而延長(zhǎng)其保質(zhì)期。