超聲協(xié)同蒸汽處理對殼雞蛋表面大腸桿菌的殺菌機理及動力學分析

張雅琪，遲玉杰,，遲 媛

（1.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學工程學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

作為一種具有綜合營養(yǎng)價值的食品，雞蛋和蛋類食品往往成為食源性微生物的攜帶者[1]。盡管新鮮雞蛋無菌或含有少量細菌，并且雞蛋自身也具備一些物理和化學防護機制[2]。但隨著儲存時間的延長，其防御能力會逐漸減弱，各種微生物會侵入雞蛋并迅速繁殖，使新鮮雞蛋的品質(zhì)下降，甚至危害消費者的健康[3]。其中大腸桿菌的檢出率高達70%，沙門氏菌的檢出率僅為5%左右[4-5]。為了防止雞蛋污染，最好在產(chǎn)蛋后立即進行清洗和消毒。目前常用于清潔殼蛋表面的化學試劑浸泡法和熏蒸法容易出現(xiàn)化學試劑殘留問題[6-7]，而大劑量的臭氧氣體又對人體有害[8]。

和其他消毒方法相比，熱處理能達到完全殺滅蛋殼表面細菌的效果。目前常見的帶殼全蛋熱殺菌一般采用水浴法或熱蒸汽法。水浴法是指將帶殼雞蛋浸泡于一定溫度的熱水中加熱升溫，最終殺死致病菌。Geveke等[9]證實，熱水浸泡過程能夠使帶殼雞蛋的耐熱腸炎沙門氏菌失活4.5 個對數(shù)值。Himathongkham等[10]將蛋殼雞蛋浸入腸炎沙門氏菌的培養(yǎng)物中，發(fā)現(xiàn)細菌可以穿透蛋殼到達細胞膜，將染菌雞蛋在沸水中浸泡3 s即可完全殺滅細菌，效果優(yōu)于其他所有測試方法（主要是化學方法）。但水浴法通常會導(dǎo)致蛋殼破裂，從而造成不必要的損失，因此應(yīng)用較為有限。蒸汽因為其潛在能量可以在很短的時間內(nèi)轉(zhuǎn)移到表面，常用于食品工業(yè)儀器表面的清潔和消毒，以及化妝品和藥品的生產(chǎn)[11]。目前蒸汽處理在減少雞肉、杏仁和新鮮切果蔬表面細菌數(shù)量方面取得了一定的成功[12]。Zion等[13]設(shè)計出一款蒸汽熱阱，經(jīng)過幾秒鐘的短時處理即能實現(xiàn)對人工接種新鮮蛋殼上沙門氏菌的完全滅活。已有研究表明，95 ℃條件下，雞蛋可以承受長達10 s的蒸汽處理，而此時蛋內(nèi)部溫度僅為40 ℃左右，不會使雞蛋內(nèi)部發(fā)生大量變性和破壞；而在沸水中處理時長超過3 s時，部分蛋殼會出現(xiàn)裂紋，且長時間的加熱會對其功能性質(zhì)產(chǎn)生很大影響[14]。因此需要嚴格控制蒸汽處理時間。

超聲波空化已被證明能夠通過增強細菌的凝聚能力實現(xiàn)殺菌[15-16]。然而，單獨使用超聲波處理時，很容易導(dǎo)致殺菌不夠徹底。因此常將其與其他殺菌手段結(jié)合，利用它們之間的協(xié)同效應(yīng)顯著提高殺菌效果[17]。此外，還有部分研究表明，在聲熱復(fù)合處理過程中，超聲波預(yù)處理可以在細胞內(nèi)造成一定程度的非致死性損傷，導(dǎo)致微生物物理性損傷，從而提高熱處理對微生物細胞的殺傷效率，使其對熱處理更加敏感[18-19]。因此，通過充分利用超聲波輔助熱殺菌過程中兩者之間的協(xié)同作用，可以有效減少食品中微生物污染，并節(jié)省成本。

動力學模型是研究微生物殺菌效果的重要工具，可為實際應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。因此，本實驗通過建立殺菌動力學模型研究超聲協(xié)同蒸汽處理對蛋殼表面大腸桿菌的殺菌效果，以期為殺滅蛋殼表面微生物提供方法依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮A級雞蛋（平均質(zhì)量45～55 g）好優(yōu)多超市（產(chǎn)自中國黑龍江省雙縣農(nóng)場），購買后24 h內(nèi)使用；大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC 25922 福建賽莫爾科學實驗用品城。

平板技術(shù)瓊脂、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂 上海博微生物技科技有限公司；次氯酸鈉（NaClO）溶液 汕頭市蓮塘化工廠有限公司；考馬斯亮藍G-250、碘化丙啶（propidium iodide，PI）北京索萊寶科技有限公司；氯化鈉、氫氧化鈉等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1810紫外-可見分光光度儀 北京普析通用儀器有限責任公司；KQ3200DE型數(shù)控超聲清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；CHA-S型氣浴振蕩恒溫培養(yǎng)箱蘇州市國飛實驗室儀器有限公司；YX180B型高壓滅菌鍋天津賽得利斯實驗分析儀器制造廠；MK-21A高速冷凍離心機 湖南邁克爾實驗儀器有限公司；DDB-11A電導(dǎo)率儀 杭州齊威儀器有限公司；F-7100型熒光分光光度計、SU8010型場發(fā)射掃描電鏡 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液制備

參照文獻[20]的方法并進行改進。將大腸桿菌菌株在營養(yǎng)瓊脂平板劃線后，在37 ℃的環(huán)境中活化24 h，然后挑取適量的菌株放入100 mL的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，置于恒溫振蕩器中，以37 ℃、200 r/min條件孵育12 h。將含有細菌的培養(yǎng)基以6000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)基，用無菌生理鹽水適當稀釋。根據(jù)GB 4789.2—2022《食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》中平板計數(shù)法計算原始細菌數(shù)，便于下一步制備不同濃度的細菌懸浮液。

1.3.2 接種

選擇產(chǎn)后質(zhì)量為50～70 g的新鮮雞蛋，且照蛋檢查無細微裂紋、氣室偏移以及蛋黃出現(xiàn)陰影等問題。用無菌脫脂棉球蘸體積分數(shù)75%乙醇溶液擦拭蛋殼表面，擦拭后將其放在超凈工作臺上紫外線照射30 min，殺滅蛋殼表面的細菌。檢測處理過的雞蛋表面細菌總數(shù)。準備濃度約為108CFU/mL的大腸桿菌懸浮液，將雞蛋在細菌懸浮液中浸泡1 h，然后取出雞蛋放在無菌操作平臺上干燥備用。

1.3.3 殺菌處理

選擇接種并干燥后完整備用的雞蛋，對其進行分組。分組后參照不同方法對鮮蛋蛋殼進行處理，具體方法見表1。

表1 不同殺菌處理方法Table 1 Different sterilization methods

1.3.4 雞蛋殼表面殘余菌數(shù)的檢測

用無菌棉球蘸取適量無菌生理鹽水，擦拭各組接種雞蛋的整個表面，將棉球浸泡在100 mL無菌生理鹽水中充分混勻，獲得處理過的洗脫液。大腸桿菌計數(shù)可參考GB 4789.3—2016《食品微生物學檢驗 大腸菌群計數(shù)》中的第二法——大腸菌群平板計數(shù)法計數(shù)。利用殺菌前后樣品大腸桿菌殘存率對數(shù)值表示超聲波協(xié)同蒸汽的致死效果，致死率按式（1）計算：

式中：N0和N分別為殺菌前后菌落數(shù)/（CFU/mL）。

1.3.5 數(shù)學模型的建立

1.3.5.1 線性模型

D值是指在一定的溫度條件下，殺滅90%的活菌數(shù)或者芽孢數(shù)所需要的時間，是表示微生物死亡速率的一種方法。該模型假設(shè)微生物對殺菌條件具有相同的抗性，致死動力學可以用線性模型描述，微生物數(shù)量下降對數(shù)值隨時間的變化呈線性變化。線性模型計算如式（2）所示：

式中：N0為殺菌處理前大腸桿菌數(shù)量/（CFU/mL）；N為殺菌處理后大腸桿菌數(shù)量/（CFU/mL）；t為殺菌時間/s；D為指數(shù)遞減時間/s。

1.3.5.2 Weibull模型

該模型由Weibull提出，通常用于描述各種凹凸性曲線[21-22]。Weibull模型假設(shè)菌體之間的熱抗性和耐壓性存在差別，其存活曲線符合累積分布函數(shù)[23]。Weibull模型計算如式（3）所示：

式中：a為規(guī)模參數(shù)；b為形狀因子；t為殺菌時間/s。

1.3.5.3 Log-Logistic模型

該模型是假設(shè)菌體對殺菌強度的抗性不同。本研究在文獻[24]的基礎(chǔ)上做了簡化處理，Log-Logistic模型計算如式（4）所示：

式中：p為最低殘存菌數(shù)；q、m為曲線方程的參數(shù)；t為殺菌時間/s。

1.3.5.4 Modified Gompertz模型

本研究在文獻[25]的基礎(chǔ)上做了簡化處理，Modified Gompertz模型如式（5）所示：

式中：a為曲線下漸近線值；b為（Kdm×e）/a，其中Kdm為曲線指數(shù)階段的線性失活率；c為細菌滯后階段的時間/s；t為殺菌時間/s。

1.3.5.5 模型評價

采用精確因子（Af）、偏差因子（Bf）、均方根誤差（root mean squared error，RMSE）和決定系數(shù)（R2）4 個參數(shù)評價模型擬合度的優(yōu)劣[26]。其中，Af和Bf反映模型的性能，Af值越小，Bf值越接近于1，模型的擬合度就越高；R2和RMSE反映模型的可靠度，R2越大，RMSE越小，模型的擬合度越好。Af、Bf、RMSE的計算如式（6）～（8）所示：

式中：n為實測值的個數(shù)；p為考察指標數(shù)。

1.3.6 掃描電鏡觀察

將各處理組的洗脫液加入滅菌的10 mL離心管中，以8000 r/min離心3 min，棄去上清液，加入滅菌生理鹽水洗滌兩次，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管，得到菌懸液。樣品經(jīng)過固定、干燥、脫水、置換、冷凍干燥后離子濺射鍍金，掃描電鏡觀察菌體結(jié)構(gòu)。未經(jīng)滅菌的對照樣品進行類似處理。

1.3.7 PI攝取量測定

將PI溶于去離子水中，制備成1 mg/mL的溶液，并在4 ℃的黑暗環(huán)境中貯存。各處理組洗脫液8000×g、4 ℃離心10 min，棄去上清液，用無菌生理鹽水調(diào)整菌液濃度至106CFU/mL。實驗分為滅菌處理前和滅菌處理后PI染色：對于滅菌處理前的PI染色組，需要將未經(jīng)處理的菌液分別加入0.5 mL的PI溶液，然后接種雞蛋，并對其進行相應(yīng)的處理和洗脫；對于處理后的PI染色組，取10 mL 1.3.4節(jié)洗脫液，加入0.5 mL PI溶液。對照組無任何處理直接加入PI溶液。所有染色組都在37 ℃的黑暗環(huán)境中孵育15 min。6000×g、4 ℃離心10 min，無菌生理鹽水重懸沉淀兩次。接著使用熒光分光光度計測定吸光度，激發(fā)光波長為495 nm，發(fā)射光波長為615 nm，狹縫寬度為10 nm。以吸光度表征PI攝取量。

1.3.8 細胞膜通透性測定

用相同濃度稀釋不同處理后的洗脫液，并用電導(dǎo)率儀測定其電導(dǎo)率。利用電導(dǎo)率的變化表征不同處理對蛋殼表面大腸桿菌細胞膜通透性的影響。

1.3.9 細菌細胞內(nèi)物質(zhì)損失的測定

參照文獻[27]測定滅菌后洗脫液中核酸、可溶性蛋白和還原糖的含量。

還原糖含量測定：取2 mL各處理后的洗脫液，加入乳糖膽鹽培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)3 h后，于6000 r/min離心10 min，采用直接滴定法測定不同處理后上清液中的還原糖含量。

可溶性蛋白質(zhì)量濃度測定：使用Bradford法，取殺菌后的洗脫液2 mL，經(jīng)－20 ℃冷凍12 h后，加入0.01 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液。取0.1 mL的處理過的樣品加入到10 mL試管中，加入5 mL考馬斯亮藍G-250染料，混合均勻后靜置2 min，在595 nm波長處測定吸光度，利用牛血清白蛋白繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線方程計算相應(yīng)樣品的蛋白質(zhì)量濃度。

核酸含量測定：將各處理后的洗脫液以6000 r/min離心10 min，然后取適量上清液置于石英比色皿中，直接用紫外分光光度計在260 nm波長處測定其吸光度，以表征核酸泄漏情況。

1.3.10 雞蛋品質(zhì)分析

將分組處理后的雞蛋置于室溫貯藏，分別測定其貯藏0 d和7 d的雞蛋品質(zhì)。

1.3.10.1 質(zhì)量損失率

質(zhì)量損失率與鮮蛋內(nèi)部的水分散失密切相關(guān)。采用質(zhì)量法進行測定，通過電子天平測定雞蛋貯藏7 d期間的質(zhì)量變化，質(zhì)量損失率計算如式（9）所示：

式中：m1為雞蛋貯藏前質(zhì)量/g；m2為雞蛋貯藏后質(zhì)量/g。

1.3.10.2 濃蛋白高度

濃蛋白高度被用作雞蛋整體質(zhì)量的衡量標準，濃蛋白高度越高，雞蛋質(zhì)量越好。將雞蛋打破倒在蛋品檢測臺上，在保持蛋黃和濃蛋白完好的情況下，避開系帶用精密游標卡尺測量蛋黃周圍濃蛋白中心部分的高度，取3 個等距離點的平均值為濃蛋白高度。

1.3.10.3 哈夫單位

哈夫單位按式（10）計算：

式中：H為濃蛋白高度/mm；m為蛋質(zhì)量/g。

1.3.10.4 蛋黃指數(shù)測定

將被檢測蛋橫向磕破蛋殼，將蛋內(nèi)容物全部流入玻璃平皿內(nèi)，用精度0.1 mm的游標卡尺測量蛋黃高度與直徑，蛋黃高度與直徑之比為蛋黃指數(shù)（式（11））。

式中：YI為蛋黃指數(shù)；h為蛋黃高度/mm；d為蛋黃直徑/mm。

1.3.10.5 蛋白pH值

蛋白pH值的測定需將蛋黃與蛋清分離，用勻漿機將蛋清均質(zhì)2 min，每隔30 s停一次。然后用pH計測定其pH值。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲協(xié)同蒸汽對蛋殼表面大腸桿菌的影響

由圖1可知，相比較蒸汽單獨處理，不同功率的超聲協(xié)同殺菌使大腸桿菌的致死率顯著增加；相同超聲功率（60 W）處理60 s協(xié)同蒸汽處理條件下，比單獨蒸汽處理1、2、3 s的致死率分別提高了47%、40%和61%。在同一蒸汽處理條件下，隨著超聲功率的增加，對蛋殼表面大腸桿菌的殺菌效果也逐漸增強。超聲60 W預(yù)處理180 s協(xié)同蒸汽處理1 s后，細菌存活率僅下降2.63 個對數(shù)值，超聲120 W預(yù)處理180 s協(xié)同蒸汽處理1 s后，細菌存活率下降3.11 個對數(shù)值，其他條件不變情況下，當超聲功率達到150 W時，細菌存活率下降達到3.43 個對數(shù)值。同樣，在蒸汽處理2 s和3 s的條件下，也可以觀察到同樣的趨勢。由此可見，超聲波輔助確實能夠提高殺菌效果?？赡茉蚴浅暡軌蛲ㄟ^強烈的空化效應(yīng)洗脫不牢固的微生物，同時也能夠增加細菌的通透性，從而提高殺菌效果。而由于菌體存在一定的自我防御能力以及抗性，當超聲功率逐漸增大和處理時間逐漸延長時，穩(wěn)定的超聲波可以迅速打破細菌細胞內(nèi)的生理平衡，破壞細菌形態(tài)及其完整性，從而有助于后續(xù)的殺菌處理。此外，隨著蒸汽處理時間的延長，殺菌效果也逐漸增加，同一超聲功率（150 W）預(yù)處理180 s后，蒸汽處理時間由1 s延長到3 s時，大腸桿菌的存活率同比下降了67%。說明當蒸汽時間持續(xù)的時間越長，擴散作用越大，蒸汽的滲透率越高。使用150 W的超聲波進行180 s預(yù)處理后再進行3 s的蒸汽處理，大腸桿菌總數(shù)的對數(shù)值從6.26下降到2.04，此時對大腸桿菌的殺菌量能夠達到4.22 個對數(shù)值，對比單獨蒸汽處理的殺菌量提高了49%。弓敏等[28]使用超聲波協(xié)同次氯酸鈉處理蛋液中的典型腐敗菌（大腸桿菌、考克氏菌、枯草芽孢桿菌），發(fā)現(xiàn)超聲（150 W）與次氯酸鈉（200 mg/L、180 s）協(xié)同處理后大腸桿菌的殺菌率也在4 個對數(shù)值附近，與本研究結(jié)果接近。綜上，超聲波和蒸汽相結(jié)合會產(chǎn)生協(xié)同作用，從而加速微生物的死亡。

圖1 超聲協(xié)同蒸汽對蛋殼表面大腸桿菌的殺菌效果Fig.1 Sterilization effect of ultrasound-assisted steam on E.coli on eggshell surface

2.2 超聲協(xié)同蒸汽處理殺菌效果動力學分析

由殺菌曲線可知，當處理時間較短時，超聲協(xié)同蒸汽處理的殺菌曲線前端呈現(xiàn)出線性，但隨著時間以及超聲功率的增加，殺菌曲線分別逐漸出現(xiàn)向x軸靠攏和偏離的趨勢。為了更好地分析超聲協(xié)同蒸汽處理對雞蛋殼表面大腸桿菌的的殺菌動力學規(guī)律，本實驗中采用了線性模型、Weibull、Log-Logistic以及Modified Gompertz 4 種模型對殺菌曲線進行了擬合，擬合效果見表2。通常情況下，決定系數(shù)R2一般用來對模型的擬合程度做一個總體評價[29]。分析表2數(shù)據(jù)可知，當采用線性模型擬合不同處理條件，其部分R2小于0.80，尤其是隨著蒸汽作用時間延長后，線性擬合的R2明顯降低，甚至出現(xiàn)了0.7196，說明線性擬合的效果較差。分析Weibull模型參數(shù)時，可以看出其R2均大于0.96，大部分條件下的R2均在0.99上下浮動。Log-Logistic模型對低強度超聲協(xié)同體系進行擬合時，其R2相對高強度超聲協(xié)同體系較低，且該趨勢在不同時長蒸汽處理條件下都有體現(xiàn)。利用Modified Gompertz模型對整個超聲蒸汽協(xié)同體系的殺菌曲線擬合時，其R2保持在0.91～0.99之間。一般認為微生物的殘留數(shù)量和時間呈線性關(guān)系，而通過本研究的模型分析發(fā)現(xiàn)超聲協(xié)同蒸汽處理對蛋殼表面大腸桿菌的殺菌更符合非線性動力學模型，并且通過分析3 種非線性模型的R2，發(fā)現(xiàn)Weibull模型更加符合整個殺菌過程。

表2 4 種模型對大腸桿菌致死效果的動力學模型參數(shù)Table 2 Kineticmodel parameters of lethal efficiency of four models on E.coli

2.3 模型擬合度評價

為了更好地比較3 種非線性模型在超聲協(xié)同蒸汽處理過程中的擬合情況，本研究對Af、Bf、R2和RMSE進行了評估。由表3可知，Log-Logistic模型和Modified Gompertz模型的Af分別為1.0804和1.0703，均小于Weibull模型（1.1000）；且Weibull模型的R2為0.9867，大于Log-Logistic模型和Modified Gompertz模型；Weibull模型的Bf等于1.0001，更加接近1，說明模型的實測值和預(yù)測值之間的偏差較小。此外，RMSE也是評價模型的典型指標，從表3可知，Weibull模型的RMSE明顯小于Log-Logistic模型和Modified Gompertz模型。

表3 數(shù)學模型評價參數(shù)的比較Table 3 Comparison of mathematical model evaluation parameters

通過將實測數(shù)據(jù)作為橫坐標，模型預(yù)測數(shù)據(jù)作為縱坐標，可以使用線性擬合得到的相關(guān)方程和R2比較模型預(yù)測值與實測值之間的差異。由圖2可知，3 種模型的預(yù)測值與實測值之間有很好的相關(guān)性。線性相關(guān)方程的斜率及截距越接近于0，R2越接近于1，表明模型的擬合效果越好。Weibull模型、Log-Logistic模型以及Modified Gompertz模型擬合得到的方程分別為y＝0.9885x＋0.0336、y＝0.9563x＋0.0704、y＝0.9720x＋0.0602，其對應(yīng)的R2分別為0.99、0.94、0.96。因此，3 個模型中Weibull模型更好地擬合了殼蛋表面大腸桿菌的失活曲線。

2.4 殺菌機理分析

2.4.1 大腸桿菌微觀結(jié)構(gòu)觀察

如圖3所示，對照組的菌體結(jié)構(gòu)更為完整，呈現(xiàn)出典型的桿狀外形，胞體表面光滑，菌體形態(tài)完整，邊緣線條流暢。而不同的處理條件使得菌體表面出現(xiàn)了不同程度的損傷。次氯酸鈉處理組的菌體整體上依然比較完整，部分細胞表面損傷破裂，出現(xiàn)井噴現(xiàn)象。單獨超聲處理組與對照組組外觀基本相似，絕大部分菌體飽滿且完整。經(jīng)過單獨蒸汽處理的細菌菌體開始畸變，可以看出細菌出現(xiàn)溶解痕跡，細胞膜破裂，表面有黏附物，說明菌體破壞嚴重。而經(jīng)過超聲協(xié)同蒸汽處理的細菌，菌體外觀和表面結(jié)構(gòu)出現(xiàn)顯著變化，大部分細胞外部結(jié)構(gòu)發(fā)生嚴重變形，可以明顯觀察到細菌細胞質(zhì)滲漏，從而導(dǎo)致細菌死亡。通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，除對照組外，其余各組的菌體細胞膜受到了各種程度的損傷，這是導(dǎo)致它們失活或死亡的一個重要原因。完整的菌體細胞膜可為細胞內(nèi)部提供一個穩(wěn)定的環(huán)境，保證了細胞與外界之間的有效物質(zhì)交換。當細胞膜發(fā)生重大破壞時，其通透性會急劇增加，這可能會導(dǎo)致菌體死亡[30]。

圖3 處理前后的掃描電鏡圖Fig.3 SEM before and after treatments

2.4.2 PI攝取量

PI是一種特殊的熒光染料，它能夠穿過不完整的細胞膜并與核酸類物質(zhì)結(jié)合，發(fā)出可以被檢測到的熒光。這種染料在生物學和醫(yī)學領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用，有助于了解菌體的完整狀況[31]。染料在處理前后分別添加到菌懸液中，通過在處理前加入PI染料，能測定比較不同處理過程中細胞膜完整性的變化；處理后PI染料的加入，則能夠反映不同處理后細胞膜損傷與修復(fù)狀況。

從圖4可以看出，處理前加入PI，不同條件下染料的攝取量相應(yīng)發(fā)生改變。對比可知，次氯酸鈉處理和超聲協(xié)同蒸汽處理能在一定程度上破壞細菌細胞膜的完整性。這和掃描電鏡中觀察到的結(jié)果一致。此外，經(jīng)過次氯酸鈉、超聲處理后，PI熒光染料的攝取量顯著降低。說明經(jīng)過不同的處理，大腸桿菌中的一些細胞開始進行自我修復(fù)，從而恢復(fù)了一定的活性。而蒸汽處理和超聲協(xié)同蒸汽處理兩組在處理前后其PI的攝取量相差很小，表明膜完整性永久性喪失。推測其主要原因可能是高溫熱處理使細胞膜被破壞，呈全透性，胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)等基本完全流出，最終導(dǎo)致細菌死亡[32]。

圖4 不同處理條件對大腸桿菌細胞PI攝取量的影響Fig.4 Effects of different treatment conditions on PI uptake of E.coli

2.4.3 電導(dǎo)率

細胞膜破裂會導(dǎo)致細胞內(nèi)的離子（如鉀離子、鈣離子和鈉離子）大量滲出。因此電導(dǎo)率的變化可以在一定程度上反映細菌細胞膜通透性的變化情況。從表4可以看出，超聲協(xié)同蒸汽處理組在各組別中電導(dǎo)率是最大的，說明超聲協(xié)同蒸汽處理能夠致使大腸桿菌細胞的細胞膜發(fā)生改變，從而導(dǎo)致培養(yǎng)液電導(dǎo)率顯著變化，這與Tao Yan等[33]研究結(jié)論一致，當菌體細胞膜破壞程度越高，電導(dǎo)率越大。

表4 不同處理條件下對大腸桿菌細胞膜通透性的影響Table 4 Effects of different treatment conditions on the membrane permeability of E.coli

2.4.4 細菌細胞內(nèi)物質(zhì)的損失

當細菌的細胞膜受到損傷時，大分子質(zhì)量的還原糖會流出，導(dǎo)致菌液中可溶性還原糖的含量增加?？扇苄缘鞍踪|(zhì)是細胞生長過程中不可或缺的營養(yǎng)物質(zhì)，其數(shù)量變化可以反映菌體蛋白質(zhì)合成的情況。核酸在紫外線波長260 nm處具有最強的吸收能力，并且吸光度與核酸濃度呈正比。因此，為了進一步研究不同處理對蛋殼表面大腸桿菌菌株菌體的破壞情況，測定并比較了超聲協(xié)同蒸汽、單獨超聲、單獨蒸汽以及次氯酸鈉處理對細菌內(nèi)物質(zhì)損失的影響。如表5所示，幾種殺菌處理方式均可造成大腸桿菌菌體內(nèi)容物的滲漏，從而使得其還原糖、可溶性蛋白以及核酸泄漏量都出現(xiàn)增加的現(xiàn)象。超聲協(xié)同蒸汽處理與單獨超聲和單獨蒸汽處理相比，可溶性蛋白質(zhì)量濃度約提高了3.28 倍和1.72 倍，還原糖含量約提高了1.97 倍和1.19 倍，而核酸泄漏量提高了1.31 倍和1.07 倍，且單獨蒸汽和單獨超聲兩者作用效果相比差異不顯著（P＞0.05），而單獨次氯酸鈉處理和超聲協(xié)同蒸汽處理效果稍強。由此說明次氯酸鈉處理和超聲協(xié)同蒸汽處理的菌體細胞膜在一定程度上遭到破壞，上清液中核酸與蛋白類物質(zhì)含量增加，導(dǎo)致細菌活性出現(xiàn)不同程度的喪失。且超聲協(xié)同蒸汽處理組細胞內(nèi)物質(zhì)損失量更高，說明超聲協(xié)同蒸汽處理對菌體的損傷更為嚴重。由此可見，超聲協(xié)同蒸汽處理會極大程度地損傷菌體細胞膜，改變其細胞膜通透性，使菌體中可溶性蛋白及還原糖等物質(zhì)流失，加速菌體的死亡。

表5 超聲協(xié)同蒸汽殺菌對細菌細胞內(nèi)物質(zhì)損失的影響Table 5 Effect of ultrasound-assisted steam sterilization on material loss in bacterial cells

2.5 品質(zhì)指標的測定結(jié)果

質(zhì)量損失率是反映雞蛋品質(zhì)的一個重要指標，從表6可以看出，與對照組相比，兩種處理方法對貯藏7 d雞蛋質(zhì)量損失率的上升均有顯著的抑制作用，且次氯酸鈉處理組和超聲協(xié)同蒸汽處理組之間質(zhì)量損失率差異不顯著（P＞0.05）。

表6 未經(jīng)處理和清洗處理雞蛋品質(zhì)屬性的平均結(jié)果Table 6 Average results of quality attributes of untreated and washed eggs

蛋白質(zhì)量是保障雞蛋新鮮度的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。通常用濃蛋白高度、哈夫單位以及蛋白pH值3 個指標衡量，濃蛋白高度越高、哈夫單位越高，則蛋白品質(zhì)越好，雞蛋越新鮮。通過分析蛋白pH值的變化能更深入地了解雞蛋品質(zhì)的變化過程。如表6所示，貯藏前期，處理組與對照組相比，濃蛋白高度、哈夫單位和pH值差異均不明顯。說明處理并沒有使雞蛋蛋白發(fā)生變形。Perry等[34]將雞蛋浸泡在57 ℃的水中，直到內(nèi)部溫度不低于56 ℃，結(jié)果表明，經(jīng)過熱處理后，雞蛋哈夫單位從大約83顯著增加到98，雖然哈夫單位的增加被認為是未經(jīng)處理雞蛋的積極品質(zhì)屬性，但熱處理雞蛋的哈夫單位增加是由于蛋白質(zhì)變性。通過貯藏7 d后的數(shù)據(jù)可以看出，處理組和對照組的濃蛋白高度和蛋白pH值之間差異顯著，說明不同消毒方法對濃蛋白高度和蛋白pH值變化抑制作用明顯。貯藏7 d后超聲協(xié)同蒸汽處理的哈夫單位為80.37，對照組為73.76，二者差異顯著。推測原因是蒸汽處理將蛋殼表面的細菌殺死并能在蛋殼表面形成一層極薄的膜，這樣既可以防止微生物侵入，也可以防止蛋內(nèi)水分蒸發(fā)和二氧化碳逸出，從而減少蛋的干耗和延緩變質(zhì)[35]。

蛋黃品質(zhì)通常以蛋黃指數(shù)表示，新鮮雞蛋的蛋黃指數(shù)為0.38～0.49。由表6可知，0 d時對照組和超聲協(xié)同蒸汽處理組的蛋黃指數(shù)分別為0.44±0.01和0.43±0.02，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。類似的，以往的研究也并未發(fā)現(xiàn)巴氏殺菌后的蛋黃指數(shù)有顯著差異[36]。隨著貯藏時間的延長，雞蛋的蛋黃指數(shù)逐漸下降。與對照組相比，處理后的實驗組蛋黃指數(shù)下降速率相對緩慢，說明在一定程度上延長了鮮蛋的保質(zhì)期。

3 結(jié)論

超聲波協(xié)同蒸汽處理能夠有效地殺死蛋殼表面的大腸桿菌。本實驗中使用150 W的超聲波進行180 s預(yù)處理后再進行3 s的蒸汽處理，此時對大腸桿菌的殺菌量能夠達到4.22 個對數(shù)值，對比單獨蒸汽處理的殺菌量提高了49%。通過對超聲波協(xié)同蒸汽處理對大腸桿菌殺菌的動力學分析，發(fā)現(xiàn)Weibull模型的決定系數(shù)R2＞0.96，表明該模型能夠較好地模擬大腸桿菌失活的動力學過程。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，超聲波協(xié)同蒸汽處理會對大腸桿菌的微觀結(jié)構(gòu)造成破壞，導(dǎo)致細胞壁的損傷，致使細胞內(nèi)容物外溢，從而導(dǎo)致細胞發(fā)生不可逆死亡。此外，通過對處理后蛋品質(zhì)的監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，超聲波協(xié)同蒸汽處理可以使雞蛋在冷藏條件下保持較短時間內(nèi)的新鮮品質(zhì)，并且效果比次氯酸鈉浸泡處理更好，說明超聲波協(xié)同蒸汽處理對雞蛋具有一定的保鮮作用。綜上，超聲協(xié)同蒸汽處理可能成為一種有效的消毒技術(shù)，可用于清洗和消毒蛋制品表面，從而延長其保質(zhì)期。