非創(chuàng)傷性股骨頭壞死檢測血清NFE2L2 的意義△

王仕迎，陳敏，張雁，趙強(qiáng)*

（1.臨沂市人民醫(yī)院股骨頭科，山東臨沂 276000；2.青島市胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東青島 266043；3.青島市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東青島 266042）

非創(chuàng)傷性股骨頭壞死（non-traumatic osteonecrosis of the femoral head, NONFH）一種進(jìn)展性髖部疾病，發(fā)病隱匿，致殘率高，以髖關(guān)節(jié)疼痛、功能活動受限、股骨頭塌陷和關(guān)節(jié)破壞等為特征［1］。我國第一次流行病學(xué)抽樣調(diào)查表明，我國15 歲以上人群累計(jì)有812 萬例NONFH 患者［2］。NONFH 好發(fā)于30～50歲的青壯年，起病隱匿，致殘率高，約有67%的無癥狀患者與85%的有癥狀患者會進(jìn)展為股骨頭塌陷［3］。股骨頭一旦出現(xiàn)塌陷，最終將不可避免行全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)，給患者身體和精神上帶來了巨大的痛苦，增加了患者家庭和社會的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前，早期NONFH 的診斷主要依靠核磁共振成像（magnetic resonance imaging,MRI）檢查，臨床上尚無有效的血清標(biāo)志物用于早期診斷。因此，尋找早期診斷NONFH的血清標(biāo)志物是亟待解決的醫(yī)學(xué)難題。

NONFH 的發(fā)病機(jī)制至今仍不完全明確。新近研究表明，氧化應(yīng)激在NONFH 的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用。核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2- related factor 2, NFE2L2）， 又稱NRF2，是細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)中的一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，與骨代謝密切相關(guān)［4］。NFE2L2 可降低細(xì)胞內(nèi)的氧自由基（reactive oxygen species,ROS）水平而抑制破骨細(xì)胞的分化［5］。最近一項(xiàng)臨床研究表明，血清NFE2L2 水平在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis,RA）患者顯著升高，是監(jiān)測RA 疾病活動和預(yù)后的潛在血清標(biāo)志物［6］。目前，NFE2L2 與NONFH 的相關(guān)研究罕有報(bào)道。本研究旨在探討NONFH 患者檢測血清NFE2L2 的意義，為NONFH 的臨床血清標(biāo)志物篩選提供一定的研究依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

NONFH 組的納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡≥18 歲；（2）根據(jù)《中國成人股骨頭壞死臨床診療指南》［7］診斷為ONFH；（3）酒精或激素單因素致病。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有骨折手術(shù)史或髖部外傷史者；（2）有惡性腫瘤、心血管疾病、RA 等代謝性骨病者；（3）妊娠期、哺乳期女性；（4）酒精、糖皮質(zhì)激素等多因素致病；（5）資料不全者。

健康組的納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡≥18 歲；（2）無長期飲酒、應(yīng)用激素史。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）近3 個(gè)月接受過影響骨代謝藥物治療者；（2）骨代謝疾病及嚴(yán)重內(nèi)科疾病者；（3）妊娠期、哺乳期女性。

1.2 一般資料

本研究為回顧性分析，選取2021 年8 月—2022年2 月就診于臨沂市人民醫(yī)院符合納入和排除標(biāo)準(zhǔn)的78 例NONFH 患者（壞死組）和80 例健康對照者（正常組）納入本研究。壞死組包括62 例男性和16例女性，平均年齡（50.2±10.0）歲；正常組包括58例男性和22 例女性，平均年齡（49.8±14.0）歲。本研究為回顧性研究，經(jīng)臨沂市人民醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)并豁免知情同意，倫理號為No.YX200342。

1.3 檢測方法

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測試劑盒（武漢華美，CSB-EL015752HU）測定血清NFE2L2 水平，該試劑盒檢測范圍為31.25～2 000 pg/ml。試劑盒的批內(nèi)差＜8%，批間差＜10%。具體操作步驟如下：（1）將待測血清樣本和檢測試劑盒所有試劑移至室溫（18℃～25℃）條件下平衡至少半小時(shí)，血清樣本解凍后再次進(jìn)行離心；（2）加樣：在孔板上分別設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測樣品孔。每孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測血清100 μl，覆蓋上板貼，37℃溫孵2 h。所有標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液和血清均在加樣前吹打2～3 次，加樣總時(shí)間控制在5 min以內(nèi)；（3）揭開板貼，棄掉板內(nèi)孔中液體，無需洗滌，各孔中均加入辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液100 μl，蓋上新板貼，37℃溫孵1 h；（4）棄掉酶標(biāo)板內(nèi)孔中液體，甩干后用洗滌緩沖液洗滌板孔5 次，每次均在洗滌緩沖液浸泡大約2 min 后甩干；（5）90 μl 底物溶液加入孔板，37℃溫孵顯色約20 min，10 min 后每隔5 min 觀察標(biāo)準(zhǔn)孔顏色變化，當(dāng)觀察到標(biāo)準(zhǔn)品前3～4 孔有較為明顯的梯度變化，后3～4 孔無明顯變色時(shí)，每孔加入50 μl 終止液終止反應(yīng)進(jìn)行；（6）終止反應(yīng)后5 min 之內(nèi)，酶標(biāo)儀450 nm 波長條件下測量每孔的OD 值。

1.4 評價(jià)指標(biāo)

收集兩組受試者的年齡、性別、體重、身高和既往史等一般資料，壞死組患者還需收集病變側(cè)別（單髖/雙髖）、ARCO 分期［8］、Harris 評分和視覺模擬評分（visual analogue scale, VAS）。對于雙側(cè)均診斷NONFH 的患者，以病變較重一側(cè)的ARCO 分期和Harris 評分為準(zhǔn)。檢驗(yàn)指標(biāo)為兩組受試者的血清NFE2L2 水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 24 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)。連續(xù)性變量以±s表示，若呈正態(tài)分布，則兩組間均值的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間均值的比較采用one-way ANOVA 分析，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)（方差齊）或Tamhane'sT2檢驗(yàn)（方差不齊）；呈非正態(tài)分布時(shí)，采用秩和檢驗(yàn)。血清NFE2L2 與ARCO 分期、VAS 和Harris 評分之間的相關(guān)性分析采用Spearman分析。繪制受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic,ROC）分析血清NFE2L2 診斷NONFH 的準(zhǔn)確性。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 股骨頭壞死患者與正常人比較

壞死組和正常組的一般資料比較見表1。壞死組和正常組的受試者的性別、年齡和BMI 差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明兩組的資料均衡性較好，因此，壞死組和正常組的血清NFE2L2 水平具有可比性。壞死組的ARCO 分期和血清NFE2L2 水平顯著高于正常組（P＜0.05）。

表1 壞死與正常兩組資料比較Table 1 Comparison of data between the necrosis and normal groups

2.2 股骨頭壞死患者分層比較

78 例NONFH 患者按不同指標(biāo)分層比較血清NFE2L2 水平見表2。激素性、酒精性和特發(fā)性不同病因之間的NFE2L2 血清濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。不同側(cè)別（單側(cè)、雙側(cè)）之間的血清NFE2L2 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。按是否塌陷進(jìn)行分層比較：股骨頭塌陷后的血清NFE2L2 水平顯著高于塌陷前（P＜0.05）。按不同ARCO 分期進(jìn)行分層比較：不同ARCO 分期股骨頭壞死患者之間的血清NFE2L2 水平的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），隨著ARCO 分期的增加，血清NFE2L2 水平顯著升高。

表2 78 例股骨頭壞死患者分層血清NFE2L2 水平比較Table 2 Stratified comparison of serum NFE2L2 levels among 78 patients with femoral head necrosis

2.3 股骨頭壞死患者血清檢測與臨床指標(biāo)的相關(guān)分析

78 例NONFH 患者的血清NFE2L2 水平與ARCO分期、VAS 和Harris 評分的相關(guān)性分析見圖1a～1c。如圖1a 所示，血清NFE2L2 水平與ARCO 分期呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），說明隨著ARCO 分期的遞增，血清NFE2L2 水平依次升高；如圖1b 所示，血清NFE2L2 水平與VAS 評分均呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），說明隨著VAS 評分的增加，血清NFE2L2 水平逐漸上升；如圖1c 所示，血清NFE2L2 水平與Harris 評分呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），表明隨著Harris評分的增加，血清NFE2L2 水平呈下降趨勢。

圖1 血清NFE2L2 水平與臨床資料相關(guān)分析的散點(diǎn)直線圖和臨床診斷的ROC 曲線。1a: NFE2L2 與ARCO 分期的散點(diǎn)-直線圖；1b: NFE2L2 與VAS 評分的散點(diǎn)-直線圖；1c: NFE2L2 與Harris 評分的散點(diǎn)-直線圖；1d: NFE2L2 判斷是否股骨頭壞死的ROC 曲線。Figure 1. Scatter-line graph of serum NFE2L2 level and clinical data, as well as ROC curve of clinical diagnosis. 1a: Scatter-line diagram of NFE2L2 and ARCO stages; 1b: Scatter-line graph of NFE2L2 and Harris score; 1c: Scatter-line graph of NFE2L2 and VAS score;1d:ROC curve of NFE2L2 predicting whether affected with femoral head necrosis or not.

2.4 是否股骨頭壞死的ROC 分析

158 例受測試者血清NFE2L2 判斷是否股骨頭壞死的ROC 曲線見圖1d：縱坐標(biāo)為敏感性的百分?jǐn)?shù)，橫坐標(biāo)為（1-特異性）的百分?jǐn)?shù)，ROC 曲線與橫坐標(biāo)圍成的面積（area under curve, AUC）表示該指標(biāo)的診斷價(jià)值。當(dāng)血清NFE2L2 的水平為191.60 pg/ml時(shí)，診斷是否股骨頭壞死的準(zhǔn)確率為最高，敏感性為74.4%，特異性為68.8%，AUC 為0.769 （95%CI0.696～0.842,P＜0.05）。

3 討 論

NONFH 是一種難治性骨科疾病，如不能早診斷、早治療，將最終面臨髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。NONFH 的危險(xiǎn)因素有過量飲酒、皮質(zhì)類固醇、血液系統(tǒng)疾病（如鐮狀細(xì)胞?。┖统料洳〉龋?，10］。NONFH 患者由于激素、酒精、血液系統(tǒng)疾病等全身性因素的影響，雙髖患病的比例高達(dá)70%［11］。而對于雙髖患病的年輕患者，由于髖關(guān)節(jié)假體使用壽命的限制，一生中需進(jìn)行4 次以上的髖部手術(shù)，這將會給患者的身心帶來極大的痛苦。關(guān)于NONFH 的發(fā)病機(jī)制盡管研究者已經(jīng)提出了許多種假說，比如血供障礙、脂質(zhì)代謝紊亂、細(xì)胞凋亡和凝血功能異常等，但具體發(fā)病機(jī)制至今仍然不完全明確［12，13］。氧化應(yīng)激是指細(xì)胞在內(nèi)源性和外源性刺激下產(chǎn)生的氧化性物質(zhì)和抗氧化能力失衡的一種病理狀態(tài)［14］。氧化應(yīng)激產(chǎn)生大量ROS，可引起DNA、蛋白質(zhì)等細(xì)胞分子的氧化損傷［15］。近年來研究表明，高劑量的糖皮質(zhì)激素、酒精均能夠使成骨細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激［16，17］。氧化應(yīng)激是骨代謝穩(wěn)態(tài)破壞的主要原因，在NONFH 的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用［18，19］。

NFE2L2 是抗氧化防御系統(tǒng)中的一種重要的轉(zhuǎn)錄因子［20，21］。新近一項(xiàng)臨床研究表明，RA 患者血清NFE2L2 水平較正常人群明顯升高［6］。這預(yù)示著NFE2L2 在包括NONFH 在內(nèi)的骨代謝疾病中的重要研究價(jià)值。迄今為止，關(guān)于NFE2L2 與NONFH 的相關(guān)報(bào)道相對較少。在本研究中，與正常組相比，壞死組的血清NFE2L2 水平顯著升高，且股骨頭塌陷后的血清NFE2L2 水平明顯高于塌陷前，并與VAS、Harris 評分等臨床指標(biāo)密切相關(guān)。以上結(jié)果表明，NFE2L2 可能參與了NONFH 的疾病的發(fā)生和發(fā)展過程。正常情況下，機(jī)體內(nèi)NFE2L2 的基礎(chǔ)水平通常較低，這主要是因?yàn)镵elch 樣ECH 關(guān)聯(lián)蛋白1（Kelch like ech associated protein 1, Keap1）介導(dǎo)的蛋白酶體的不斷降解作用；而在氧化應(yīng)激情況下，NFE2L2 為應(yīng)對機(jī)體內(nèi)的氧化產(chǎn)物的不斷累及，從而代償性增加以維持或恢復(fù)機(jī)體的氧化還原穩(wěn)態(tài)［22］。根據(jù)以上研究結(jié)果，筆者推測NONFH 患者血清NFE2L2 水平的升高的原因可能是機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激產(chǎn)物的累積進(jìn)而引起NFE2L2 代償性的升高。

近年來，探索早期NONFH 診斷潛在血清標(biāo)志物的研究日益受到關(guān)注。例如，沈瑩姍等［23］研究表明血清Nesfatin-1 水平在NONFH 患者中顯著高于健康人，分層分析結(jié)果顯示在塌陷前水平顯著低于塌陷后。曹婷等［24］研究表明NONFH 患者血清Chemerin水平顯著高于正常人，且Chemerin 水平與ARCO 分期、VAS 評分呈正相關(guān)。詹會賢等［25］研究表明，NONFH 患者中的血清視黃醇結(jié)合蛋白-4 顯著低于健康者，且與疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)。本研究結(jié)果表明，血清NFE2L2 與ARCO 分期、VAS 評分和Harris評分密切相關(guān)，是判斷是否發(fā)生NONFH 的潛在的有價(jià)值的血清標(biāo)志物。

然而，本研究仍有一定的局限性：（1）這是一項(xiàng)橫斷面研究，受試者數(shù)量有限，因此需要進(jìn)一步進(jìn)行更大樣本量的縱向研究來進(jìn)一步驗(yàn)證；（2）本研究分析的受試者為我國漢族人群，血清NFE2L2 水平作為診斷標(biāo)志物仍需在不同種族人群中進(jìn)一步驗(yàn)證；（3）本研究只檢測了血清NFE2L2 水平，未檢測分析其他指標(biāo)與NFE2L2 的相關(guān)性。

綜上所述，本研究表明，血清NFE2L2 水平在NONFH 患者中顯著升高，與ARCO 分期、VAS 評分和Harris 評分密切相關(guān)，是診斷NONFH 的潛在血清標(biāo)志物。