Niemann-Pick C1蛋白在埃博拉病毒感染中的作用及其靶向藥物研究進展

吳海燕，陳國江

（軍事科學院軍事醫(yī)學研究院毒物藥物研究所，北京 100850）

埃博拉病毒（Ebola virus，EBOV）屬于絲狀病毒科，絲狀病毒科主要分為EBOV 屬、馬爾堡病毒（Marburg virus，MARV）屬和奎瓦病毒屬。EBOV屬包括EBOV、本迪布焦病毒、萊斯頓病毒、蘇丹病毒和塔伊森林病毒［1］。自1976年在非洲大陸被發(fā)現(xiàn)以來，EBOV 已在非洲引起多次致命出血性疾病的暴發(fā)，給世界公共衛(wèi)生帶來巨大挑戰(zhàn)［2］。EBOV的主要感染途徑有直接接觸感染、醫(yī)源性接觸感染、性傳播和母嬰傳播，感染EBOV 可引起發(fā)熱、頭痛和肌痛等癥狀，最后發(fā)展為肝、腎功能衰竭，導致死亡［3］。埃博拉病毒?。‥bola virus disease，EVD）的暴發(fā)主要在非洲國家，在2013年至2016年西非暴發(fā)的疫情中，報告病例約28 000 例，死亡高達約11 000 例［4］。盡管目前已有多個治療EVD 的候選藥物，但考慮到病毒的高頻突變性，開發(fā)靶向絲狀病毒的廣譜治療藥物仍有迫切的現(xiàn)實需求。

1 Niemann-Pick C1在EBOV感染中的作用

EBOV 是一類單鏈負義RNA 病毒，其基因組編碼7 種蛋白，分別為核蛋白、聚合酶輔因子、基質(zhì)蛋白、糖蛋白（glycoprotein，GP）、轉錄激活因子、次要基質(zhì)蛋白和RNA 依賴的RNA 聚合酶［5］。EBOV 利用多種宿主因子進入細胞，包括去唾液酸糖蛋白受體、C 型凝集素、T 細胞免疫球蛋白黏蛋白結構域1和β1 整合素等［6-7］。EBOV 表面蛋白GP 為單一的包膜糖蛋白，介導病毒附著、進入與膜融合。GP 分子以同源三聚體形式存在于病毒粒子表面，每個單體由二硫鍵連接的GP1 和GP2 亞單位異源二聚體組成。GP 介導EBOV 進入靶細胞，與宿主細胞膜相互作用觸發(fā)病毒顆粒內(nèi)吞。GP1 包含受體結合位點（receptor binding site，RBS）、聚糖帽和黏蛋白樣結構域，而GP2 包含融合環(huán)和跨膜結構域［8］。在病毒與細胞表面黏附因子（如C 型凝集素）結合后，EBOV 通過胞吞作用進入細胞［9-11］。在晚期內(nèi)體中，GP 被宿主組織蛋白酶（如組織蛋白酶L 和B）切割為酶裂解GP（cleaved GP，GPcl），去除聚糖帽和黏蛋白樣結構域，進而暴露RBS［12］。RBS 與內(nèi)體膜上的膽固醇轉運蛋白Niemann-Pick C 1（NPC1）結合，促進GP2 介導的病毒膜與內(nèi)體膜融合。隨后，病毒RNA 釋放到胞質(zhì)中，完成復制等步驟［13-15］。

近期研究發(fā)現(xiàn)，NPC1 是絲狀病毒感染靶細胞的關鍵受體。NPC1蛋白是溶酶體和內(nèi)體膜上的膽固醇轉運體，人NPC1 蛋白包含1278 個氨基酸殘基，包括1 個N 端結構域（N-terminal lumenal domain，NTD）、1 個中間結構域（middle luminal domain，MLD）、1個C端結構域（C-terminal lumenal domain，CTD）和13 個跨膜段（transmembrane segments，TM），TM3～7 片段被稱為甾醇傳感結構域（sterol-sensing domain，SSD）［16］（圖1）。MLD主要由中心的7個α螺旋作為核心和圍繞核心的7個β 鏈組成，并有2 個突出的環(huán)。第一突出環(huán)（loop1）位于β2 和β3 鏈之間，而第二突出環(huán)（loop2）位于α4 和α5 螺旋線之間。MLD 利用2 個突出環(huán)結合GPcl 頭部的疏水空腔，GPcl 是EBOV 進入內(nèi)體被組織蛋白酶切割后的GP，能暴露出RBS。EBOV GPcl和NPC1-MLD 之間的分子相互作用由NPC1-MLD的2個突出環(huán)介導，它們與GPcl頭部RBS中的疏水口袋結合。在第一突出環(huán)中，7 個殘基Y420，Q421，Y423，P424，S425，G426 和D428 參與相互作用，其中殘基Y423 和P424 參與大部分原子間的接觸。在第二突出環(huán)中，6 個殘基D501，D502，F(xiàn)503，F(xiàn)504，V505 和Y506 參與結合過程，殘基F503，F(xiàn)504 和Y506 通過與GPcl 頭部空腔的緊密疏水相互作用發(fā)揮主要作用（圖2）。在酶切并與MLD 結合后，GPcl 的構象變化進一步影響內(nèi)部融合環(huán)的狀態(tài)，觸發(fā)膜融合。疏水相互作用主要有助于在MLD 和EBOV-GPcl 之間的接觸表面水平上，穩(wěn)定蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復合物［17-18］。

圖1 埃博拉病毒（EBOV）入侵宿主細胞的過程［17］.NTD：Niemann-Pick C1（NPC1）蛋白N端結構域；MLD：NPC1蛋白中間結構域；CTD：NPC1 蛋白C 端結構域；Loop1：第一突出環(huán)；GPcl：酶裂解糖蛋白.

圖2 NPC1-MLD與GPcl復合結構［17］.

NPC1基因的缺失會使細胞內(nèi)膽固醇堆積，導致一種嚴重的神經(jīng)退行性疾病，稱為尼曼-匹克C型疾?。∟iemann-Pick disease type C）［19-20］。NPC1與NPC2 共同介導膽固醇的轉運。NPC2 結合到NPC1 的MLD 后將膽固醇轉移到NTD，MLD 與NPC2 的主要作用殘基為R404 和R518（圖3）。R518 暴露在MLD 頂部的短螺旋α3 末端，R404 埋在MLD 中，與TM3 N 端莖部分的E606 相互作用［16］。CTD 的所有8 個半胱氨酸形成4 個二硫鍵，其中C909～C914 形成1 個特定環(huán)，該環(huán)反過來介導與NTD 的相互作用［21-22］。之后NTD 從NPC2 接收到膽固醇，并將膽固醇轉移到膜上的SSD 區(qū)域［23］。值得注意的是，NPC1 在EBOV 入胞中的作用與其在膽固醇外排中的功能相互獨立，為病毒進入的治療性抑制劑的設計提供了分子基礎［15，24］。NPC1蛋白作為目前已知的絲狀病毒的共同進入受體，靶向NPC1的藥物可能具有廣譜抗絲狀病毒作用。

圖3 NPC1與NPC2結合的關鍵位點［16］.

2 靶向NPC1的藥物

目前抗病毒治療大多針對病毒本身，由于病毒具有高頻突變的特性，一段時間后這些治療方法往往失效或耐藥。針對病毒識別的關鍵宿主分子開發(fā)藥物具有廣譜性、不易誘發(fā)變異等優(yōu)點，且在阻斷病毒與宿主相互作用的同時，還能調(diào)節(jié)宿主的免疫反應，增強抗病毒功效［25］。目前，NPC1已成為抗EVD 藥物研發(fā)領域頗具吸引力的靶點。NPC1 已被證實在其他病毒感染中也起重要作用。NPC1能與嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2 核蛋白相互作用，增強其感染性，抑制NPC1夠顯著減輕其引起的病變［26-27］。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，NPC1也涉及如丙肝病毒［28］、人類免疫缺陷病毒［29］、基孔肯雅病毒［30］、登革熱病毒［31］、寨卡病毒［32］和桿狀病毒［33］等感染。由于NPC1 為多種包膜病毒的共同受體，靶向NPC1的抑制劑可能成為廣譜抗病毒候選藥物。針對NPC1 的藥物主要包括小分子抑制劑、單克隆抗體以及基因治療藥物，在非臨床研究中展示了較好活性。

2.1 小分子抑制劑

2.1.1 直接作用于NPC1

一類化合物，如金剛烷二肽哌嗪、磺胺、三唑硫醚、咔唑和硫化物等，可結合到NPC1 上與GPcl 結合的位點，競爭性阻斷GP與膜的結合（表1）。

表1 抗EBOV NPC1-C-GPcl相互作用的化合物

金剛烷二肽哌嗪系列包括化合物3.0 和化合物3.47，能識別NPC1 在絲狀病毒進入過程中的關鍵作用，干擾NPC1-GP 相互作用［34］?；衔?.0 半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）為1.6 μmol·L-1，而化合物3.47的IC50低至130 nmol·L-1。通過改進化合物3.47 體外藥動學特性獲得的衍生物3.23和3.24，比3.47更有效，疏水性更低，且對導致人類感染大暴發(fā)的Mayinga EBOV（1976年）和Makona EBOV（2014年）具有很強抑制活性，其對Makona EBOV的半數(shù)效應濃度（half maximal inhitory concentration，EC50）分別為52 和17 nmol·L-1，對Mayinga EBOV 的EC50值分別為33 和35 nmol·L-1［35］，但小鼠體內(nèi)實驗顯示，這類化合物并未提高小鼠生存率。

Basu 等［36］發(fā)現(xiàn)了2 種分別基于磺胺和三唑硫醚骨架的小分子氨基乙酰胺磺酰胺MBX2254和三唑硫醚MBX2270，兩者能在病毒入胞后的晚期內(nèi)體中抑制EBOV-GP 與NPC1-MLD 相互作用，在體外對EBOV 的IC50分別為8.07 和10.00 μmol·L-1，半數(shù)細胞毒性濃度（half cytotoxic concentration，CC50）均＞50 μmol·L-1，且兩者與NPC1-MLD 的結合誘導構象變化，阻斷NPC1 的膽固醇轉運。另外，Lasala 等［37］運用虛擬篩選方法獲得具有病毒抑制活性的7 種化合物，分別屬于苯并噻唑（9，12，19和30）、咔唑（SC2）和硫化物（14 和26）衍生物。在EBOV假病毒感染實驗中，二芳基硫化物（14和26）的IC50分別為4.69 和2.04 μmol·L-1，SC2 的IC50為0.37 μmol·L-1，均顯示出較好的抗病毒活性。ELISA結果顯示，這些化合物抑制EBOV-GPcl 和NPC1-MLD 之間的相互作用，而苯并噻唑類藥物不影響NPC1-GP的相互作用。

Wang 等［38］采用計算機方法在化合物庫中針對NPC1 與GP 相互作用的RBS 區(qū)域篩選出化合物A 和U，及其類似物A3 和A4 及U6 和U7，它們對EBOV 和MARV 感染均表現(xiàn)出較強抑制活性。在體外假病毒實驗中，化合物A 對MARV 的IC50值最低（0.86 μmol·L-1），化合物A3 對EBOV 的IC50值最低（3.87 μmol·L-1）。對于EBOV 和MARV，化合物U 的IC50值分別為12.38 和21.72 μmol·L-1。在細胞毒性實驗中，化合物A 顯示出更大毒性，CC50值為3.91 μmol·L-1，而化合物U 表現(xiàn)出較低細胞毒性，其CC50值接近100 μmol·L-1。在EBOV 真毒實驗中，化合物A 和U 均顯示較強抑制活性，IC50值分別為11.92和8.77 μmol·L-1。

另一類化合物與NPC1 上的其他位點結合，使其無法在晚期內(nèi)體正常表達，影響GPcl與NPC1的結合。以雄烯酮衍生物U18666A（表1）為例，它是一種兩親性類固醇，能抑制溶酶體膜蛋白NPC1 轉運膽固醇，導致膽固醇在溶酶體中累積［39］。盡管U18666A 和丙咪嗪（imipramine）治療均可使感染EBOV 小鼠的病毒復制降低，但未顯示出明顯保護作用［24］。先前的研究結果也表明，U18666A和三唑類藥物伊曲康唑（itraconazole）（表1）均可阻斷NPC1 介導的膽固醇轉運，對EBOV 感染具有抑制作用。U18666A與伊曲康唑?qū)PC1的抑制作用位點主要在NPC1-SSD［40］，NPC1-SSD的P691S突變可以阻止NPC1蛋白與這些配體的結合［41-42］。

2.1.2 作用于GP間接影響NPC1

除上述化合物外，進入抑制劑（entry inhibitor）還可通過作用于EBOV-GP 的GP1-GP2 界面的融合環(huán)水平變構干擾NPC1-MLD-GPcl相互作用。通過使用GP 假病毒，Basu 等［43］在進入抑制劑篩選中發(fā)現(xiàn)了苯二氮衍生物化合物7（表1）。與其他RNA和DNA病毒相比，化合物7 在細胞實驗中表現(xiàn)出對EBOV 和MARV 的抑制具有選擇性，IC50值分別為10和12 μmol·L-1。研究表明，化合物7 可與GP1 和GP2 之間界面上的疏水口袋結合，這種與EBOV-GP 的結合會對GP 蛋白在GP1-GP2 二聚表面的穩(wěn)定性產(chǎn)生負面影響。配體誘導的失穩(wěn)將隨著EBOV-GP 結構擴散到容納NPC1-MLD 的空腔，最終損害結合位點的蛋白質(zhì)相互作用。

2.2 單克隆抗體藥物

目前對絲狀病毒抗體藥物的研究主要針對病毒表面GP，在眾多靶向EBOV GP 的單克隆抗體中，較為有效的有3 種，分別是Zmapp，REGN-EB3和mAb114。Zmapp 和REGN-EB3 是治療性混合物，各自含有3 個針對不同表位的單抗，mAb114 是針對EBOV GP 受體結合域的單一治療性單抗；mAb114 與EBOV GP 受體結合域上的一個保守氨基酸區(qū)域結合，即使在低pH（如內(nèi)體中的pH）下仍保持結合，提示mAb114 可阻斷GP 在晚期內(nèi)體中與宿主細胞受體蛋白NPC1的相互作用［44-45］。無法避免的是，當GP 表位發(fā)生突變時，這些靶向EBOV GP 表位抗體的中和效果將大幅下降。但由于這些單抗對嚴重EVD 的治療僅具有中等效力，對其他種類EBOV 無效，因此開展針對所有絲狀病毒科的廣譜抗體藥物研究具有重要意義。

有研究表明，雙特異性抗體（bispecific antibody，BsAb）治療可成為一種很有前景的抗體聯(lián)合治療方法。Wec 等［46］開發(fā)了一種“特洛伊木馬”（Trojan horse）BsAb，他們分別將以RBS和NPC1-MLD 為靶向位點的單抗MR72 和mAb-548 偶聯(lián)靶向GP 表位的單抗FVM09。這類BsAb 能通過FVM09以“搭便車”方式進入感染病毒細胞，并通過MR72 或mAb-548 成功抑制GPcl-NPC1 相互作用。體內(nèi)實驗也表明，BsAb 對感染了EBOV 或蘇丹病毒的BALB/c 小鼠具有保護作用，與未治療組相比，F(xiàn)VM09-MR72 組小鼠存活率更高（70%），F(xiàn)VM09-548 具有部分保護作用。該方法對EBOV屬病毒提供了廣泛保護，即使在暴露后治療條件下，也可對抗致命的EBOV 攻擊，但該BsAb 不能中和其他絲狀病毒。在此基礎上，該團隊開發(fā)了第二代“特洛伊木馬”BsAb，通過與內(nèi)化細胞表面受體-離子非依賴性甘露糖-6-磷酸受體/胰島素樣生長因子2受體的結合，將抗體內(nèi)化到細胞中，增強對絲狀病毒進入細胞的阻斷作用［47］。該研究擴展了“特洛伊木馬”BsAb 傳遞機制，具有更加廣譜的抗病毒功能。

2.3 基因治療藥物

Sadewasser 等［48］采取一種基于反義寡核苷酸（antisense oligonucleotides，ASO）作用于NPC1的新方法，對感染了EBOV 的細胞具有體外抑制效果。ASO 是指短的（16～53 個核苷酸）、合成的低聚核苷酸，用于阻斷RNA（包括微RNA）的功能。研究人員選擇NPC1作為鎖定核酸修飾的反義寡核苷酸抑制的治療靶點。在人和小鼠細胞系中篩選ASO，鑒定出的候選寡核苷酸能夠在體外有效敲除NPC1蛋白，敲除效率高達94%，并且不改變細胞活力，其中最有效的ASO 05HM 抑制NPC1 表達的IC50值為668 nmol·L-1。用選出的候選寡核苷酸處理感染EBOV 的HeLa 細胞，病毒滴度顯著降低（＞99%），表明針對NPC1 的ASO 是一種有希望的治療方法。另外，Kondoh 等［49］利用國家生物技術信息中心單核苷酸多態(tài)性（single-nucleotide polymorphism，SNP）數(shù)據(jù)庫在人NPC1 中發(fā)現(xiàn)了10 個天然存在的錯義SNP，建立了穩(wěn)定表達NPC1 的具有SNP 替換的Vero E6 細胞系，發(fā)現(xiàn)核苷酸的替換導致細胞對絲狀病毒易感性降低。利用NPC1 SNP 雖可使病毒易感性降低，但很有可能會影響NPC1本身的生理功能而產(chǎn)生其他不良反應。

3 結語

全面了解病毒的感染過程如病毒的結構、病毒與宿主的相互作用機制等有利于研發(fā)新的抗病毒療法?；诓《颈砦谎邪l(fā)的小分子抑制劑及單克隆抗體等能有效抑制EVD 發(fā)生。目前，單克隆抗體是EBOV 感染的主要治療藥物，靶向位點主要是病毒表面GP。這些抗體雖表現(xiàn)了良好的中和活性，但仍存在一些問題。①EBOV 為RNA 病毒，易產(chǎn)生突變和逃逸，單克隆抗體容易失效；②靶向病毒表位的抗體不夠廣譜。宿主靶向抗病毒治療能克服這些缺點，但不可避免地導致藥物的一些不良反應。對于EBOV 來說，NPC1 是體內(nèi)膽固醇的轉運體，抑制NPC1 的藥物雖可降低EVD 發(fā)生，但也會影響細胞內(nèi)膽固醇轉運。如何有效控制EBOV 感染且不影響體內(nèi)正常NPC1功能是目前該研究領域面臨的一大挑戰(zhàn)。不斷發(fā)掘新宿主受體并開發(fā)新靶向藥物必將為EVD 治療提供更多選擇，并取得更好治療效果。