CircFoxo3調(diào)節(jié)miR-130a-5p/TEAD1軸對心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡影響的實(shí)驗(yàn)研究

曹彥花, 樂金海, 陳新宇, 劉建和, 劉越美, 李 俊, 李 蘇

心力衰竭(heart failure,HF)是一種慢性疾病,其特點(diǎn)是心臟不能向外周組織提供代謝所需的血液和氧氣[1]。盡管治療HF的藥物有利尿劑、正性肌力藥物、神經(jīng)體液抑制劑、血管擴(kuò)張劑和離子通道調(diào)節(jié)劑等,但其仍然是心血管疾病患者病死的主要原因,給社會(huì)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。針對HF病理、生理及治療分子機(jī)制的研究有助于降低HF患者的發(fā)病率,提高患者生活質(zhì)量[3]。有研究表明,HF會(huì)促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡,而心肌細(xì)胞凋亡也加速了HF的進(jìn)展[4]。因此,了解HF心肌細(xì)胞凋亡的具體分子機(jī)制將有助于開發(fā)新的治療。環(huán)狀RNA叉頭框蛋白O3(circular RNA forkhead box protein O3,CircFoxo3)是一種常規(guī)的外顯子環(huán)狀RNA,已被證明與某些人類癌癥的特定病理變化有關(guān)[5-6]。據(jù)報(bào)道,敲低CircFoxo3可減輕小鼠心臟移植中發(fā)生的缺血再灌注損傷,發(fā)揮心肌保護(hù)作用[7]。有研究顯示,過表達(dá)miR-130a-5p可減輕心肌缺血再灌注對小鼠心肌造成的損傷[8];下調(diào)TEA域轉(zhuǎn)錄因子1(TEA domain transcription factor 1,TEAD1)表達(dá)可抑制缺氧引起的心肌細(xì)胞損傷[9]。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),CircFoxo3與miR-130a-5p、miR-130a-5p與TEAD1存在靶向關(guān)系,但CircFoxo3能否通過調(diào)節(jié)miR-130a-5p/TEAD1軸影響HF大鼠心肌細(xì)胞凋亡尚不明確。鑒于此,本研究旨在探究CircFoxo3對HF大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響以及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞 選擇體質(zhì)量為250～260 g的7周齡,無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級雄性SD大鼠144只,購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司,生產(chǎn)許可證號：SCXK(湘)2019-0014。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,使用許可證號：SYXK(湘)2020-0010。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循3R原則,并獲得湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[批號：(2020)倫審第(228)號]。人胚腎細(xì)胞HEK-293T購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑 CircFoxo3干擾載體(si-CircFoxo3)及其陰性對照(si-NC)、miR-130a-5p激動(dòng)劑(miR-130a-5p agomir)及其陰性對照(agomir NC)、miR-130a-5p拮抗劑(miR-130a-5p antagomir)及其陰性對照(antagomir NC)購自重慶英茂盛業(yè)生物科技有限公司。鹽酸阿霉素購自美國MCE公司。Trizol試劑購自愛必信(上海)生物科技有限公司。HE染色液購自南京建成生物工程研究所。Masson染色液、脫脂奶粉購自南京森貝伽生物科技有限公司。RIPA裂解液購自金克隆(北京)生物技術(shù)有限公司。大鼠人基質(zhì)裂解素2(human stromelysin-2,ST2)、N端腦鈉肽前體(N-terminal pro-brain natriuretic peptide,NT-pro BNP)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測試劑盒購自上?？婆嗳鹕锟萍加邢薰尽UNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司。TEAD1、B淋巴細(xì)胞瘤-2(B cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)、裂解的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(cleaved aspartate-specific cysteine protease-3,cleaved caspase-3)、GAPDH兔源一抗及辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自英國Abcam公司。CircFoxo3野生型質(zhì)粒CircFoxo3-WT和突變型質(zhì)粒CircFoxo3-MUT購自蘇州泓迅生物科技股份有限公司。

1.3HF大鼠模型的構(gòu)建 通過腹腔注射鹽酸阿霉素的方法構(gòu)建HF大鼠模型。在第1、3、9、11天腹腔注射鹽酸阿霉素1 mg/kg,在第5、7、13、15天腹腔注射鹽酸阿霉素2 mg/kg。第16天時(shí)若觀察到大鼠出現(xiàn)體重減輕、精神不佳、運(yùn)動(dòng)量減少、毛發(fā)無光澤,且左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)<40%則判定HF大鼠模型構(gòu)建成功[10]。本研究HF大鼠造模成功率為100%。

1.4實(shí)驗(yàn)分組及處理方法 采用隨機(jī)數(shù)字表法將SD大鼠分為對照組、HF組、si-NC組、si-CircFoxo3組、agomir NC組、miR-130a-5p agomir組、si-CircFoxo3+antagomir NC組、si-CircFoxo3+miR-130a-5p antagomir組,每組18只。干預(yù)方法,(1)si-NC組：按照方法1.3實(shí)驗(yàn)步驟成功構(gòu)建HF大鼠模型后于尾靜脈注射si-NC 33.33 μg。(2)si-CircFoxo3組：按照方法1.3實(shí)驗(yàn)步驟成功構(gòu)建HF大鼠模型后于尾靜脈注射si-CircFoxo3 33.33 μg。(3)agomir NC組：按照方法1.3實(shí)驗(yàn)步驟成功構(gòu)建HF大鼠模型后于尾靜脈按200 nmol/kg注射agomir NC。(4)miR-130a-5p agomir組：按照方法1.3實(shí)驗(yàn)步驟成功構(gòu)建HF大鼠模型后于尾靜脈按200 nmol/kg注射miR-130a-5p agomir。(5)si-CircFoxo3+antagomir NC組：按照方法1.3實(shí)驗(yàn)步驟成功構(gòu)建HF大鼠模型后于尾靜脈注射33.33 μg si-CircFoxo3,并同時(shí)按200 nmol/kg注射antagomir NC。(6)si-CircFoxo3+miR-130a-5p antagomir組：按照方法1.3實(shí)驗(yàn)步驟成功構(gòu)建HF大鼠模型后于尾靜脈注射33.33 μg si-CircFoxo3,并按200 nmol/kg注射miR-130a-5p antagomir。(7)對照組：以生理鹽水代替阿霉素進(jìn)行方法1.3中的造模實(shí)驗(yàn)操作,模擬造模過程結(jié)束后,于尾靜脈注射與上述處理組等體積的生理鹽水。(8)HF組：按照方法1.3實(shí)驗(yàn)步驟構(gòu)建HF大鼠模型,建模成功后,于尾靜脈注射與上述處理組等體積的生理鹽水。尾靜脈注射生理鹽水或藥物為每3 d一次,持續(xù)3周。

1.5標(biāo)本收集 于末次干預(yù)處理結(jié)束后,每組選取6只大鼠,予2%戊巴比妥鈉麻醉并處死。收集大鼠的心肌組織用于CircFoxo3、miR-130a-5p表達(dá)及TEAD1蛋白表達(dá)的檢測。對每組剩余的12只大鼠,應(yīng)用彩色多普勒超聲儀檢測其左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end systolic diameter,LVESD)、左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end diastolic diameter,LVEDD)、LVEF的變化。心功能指標(biāo)檢測結(jié)束后,予2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠,腹主動(dòng)脈取血,經(jīng)離心獲血清用于ELISA檢測。血液收集完畢后,處死所有大鼠,收集大鼠的心肌組織用于HE染色、TUNEL染色及Western blot檢測。

1.6檢測方法

1.6.1 反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)法檢測心肌組織中CircFoxo3、miR-130a-5p表達(dá)水平 使用Trizol試劑提取心肌組織勻漿總RNA。將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)體系為20 μL：cDNA 2 μL,2×SYBR預(yù)混合物10 μL,去離子水7 μL,正、反向引物各0.5 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s,60 ℃ 60 s,擴(kuò)增38個(gè)循環(huán)。所用引物序列見表1。以GAPDH、U6為內(nèi)參,通過2-ΔΔCT法分別計(jì)算CircFoxo3、miR-130a-5p的相對表達(dá)量。

表1 引物序列

1.6.2 大鼠心功能檢測 采用DC-35Pro型彩色多普勒超聲儀(南京貝登醫(yī)療股份有限公司)檢測大鼠LVESD、LVEDD、LVEF水平。

1.6.3 ELISA法檢測大鼠血清中ST2、NT-pro BNP水平 嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟檢測大鼠血清中ST2、NT-pro BNP水平。

我國電子商務(wù)的發(fā)展占據(jù)了中國經(jīng)濟(jì)市場的半壁江山，大數(shù)據(jù)時(shí)代推動(dòng)著電子商務(wù)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展，也衍生出了新的經(jīng)濟(jì)模式，其中最新型的模式就是共享經(jīng)濟(jì)。我國現(xiàn)存的狀態(tài)是共享經(jīng)濟(jì)市場和租賃服務(wù)市場混雜。本文主要研究的是正確了解共享經(jīng)濟(jì)以及關(guān)于電子商務(wù)和共享經(jīng)濟(jì)之間的關(guān)系。在大數(shù)據(jù)的環(huán)境下，我國電商的現(xiàn)狀，以及這種衍生的新經(jīng)濟(jì)是否有利于中國經(jīng)濟(jì)未來的發(fā)展，這是值得我們深思的問題。

1.6.4 HE染色、Masson染色檢測大鼠心肌組織病理變化、心肌纖維化 將心肌組織浸入4%多聚甲醛中24 h,然后轉(zhuǎn)移到70%乙醇中,梯度濃度乙醇脫水,石蠟包埋,切成5 μm厚的切片。將切片經(jīng)二甲苯中脫蠟、梯度乙醇水化、磷酸緩沖鹽溶液沖洗后進(jìn)行HE染色、Masson染色。通過光學(xué)顯微鏡觀察心肌組織病理變化、心肌纖維化情況。

1.6.5 TUNEL染色檢測心肌細(xì)胞凋亡 取心肌組織切片用二甲苯脫蠟,梯度乙醇脫水,磷酸緩沖鹽溶液沖洗后,加入蛋白酶K溶液除去組織蛋白,然后用蒸餾水沖洗。根據(jù)TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒的說明書步驟對心肌組織切片進(jìn)行TUNEL染色,使用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡。以染色呈棕黃色的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞,細(xì)胞核染色呈藍(lán)色的細(xì)胞為活細(xì)胞。凋亡率(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.6.6 Western blot法檢測大鼠心肌組織TEAD1、Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3蛋白表達(dá) 取心肌組織制成勻漿后,使用RIPA裂解液裂解心肌組織勻漿以獲取總蛋白質(zhì),BCA法檢測蛋白濃度。取30 μg總蛋白,在94 ℃水浴變性3 min后進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳,將蛋白通過電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,用5%脫脂奶粉液封閉處理1 h。在4 ℃下將PVDF膜與一抗液[TEAD1(1∶3 000)、Bax(1∶4 000)、Bcl-2(1∶4 000)、cleaved caspase-3(1∶2 000)、GAPDH(1∶3 000)]孵育過夜。以Tris緩沖鹽溶液沖洗膜后,將PVDF膜與二抗液(1∶5 000)共同孵育2 h。再次沖洗膜后在暗室中曝光、顯影。應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)(UVP GelDoc-It型,美國UVP公司)分析各蛋白的灰度值,并以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量。

1.6.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 分別構(gòu)建CircFoxo3野生型質(zhì)粒CircFoxo3-WT和突變型質(zhì)粒CircFoxo3-MUT。將CircFoxo3-WT和CircFoxo3-MUT分別與mimic NC或miR-130a-5p mimic共轉(zhuǎn)染于HEK-293T細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后通過化學(xué)發(fā)光多功能酶標(biāo)儀(LATECH LUMIstar Omega型,德國BMG公司)觀察熒光素酶活性變化。

2 結(jié)果

2.1沉默CircFoxo3或過表達(dá)miR-130a-5p對各組大鼠心肌組織病理變化的影響 HE染色結(jié)果顯示,對照組大鼠心肌組織完整,心肌纖維排列規(guī)律。HF組大鼠心肌組織有嚴(yán)重的病理損傷,如心肌纖維形態(tài)紊亂和炎性細(xì)胞浸潤。與HF組、si-NC組比較,si-CircFoxo3組大鼠心肌組織病理損傷減輕。與HF組、agomir NC組比較,miR-130a-5p agomir組大鼠心肌組織病理損傷有所改善。與si-CircFoxo3組、si-CircFoxo3+antagomir NC組比較,si-CircFoxo3+miR-130a-5p antagomir組大鼠心肌組織病理損傷較重,見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織的HE染色結(jié)果比較圖(×200)

2.2沉默CircFoxo3或過表達(dá)miR-130a-5p對各組大鼠心肌纖維化的影響比較 Masson染色結(jié)果顯示,與對照組相比,HF組大鼠心肌組織中有大量呈藍(lán)染的膠原沉積。與HF組、si-NC組比較,si-CircFoxo3組大鼠心肌組織中膠原沉積減少。與HF組、agomir NC組比較,miR-130a-5p agomir組大鼠心肌組織中膠原沉積減少。與si-CircFoxo3組、si-CircFoxo3+antagomir NC組比較,si-CircFoxo3+miR-130a-5p antagomir組大鼠心肌組織中膠原沉積增多,見圖2。

2.3沉默CircFoxo3或過表達(dá)miR-130a-5p對各組大鼠心肌組織中CircFoxo3、miR-130a-5p表達(dá)及TEAD1蛋白表達(dá)的影響比較 與對照組比較,HF組大鼠心肌組織CircFoxo3表達(dá)及TEAD1蛋白表達(dá)水平升高,miR-130a-5p表達(dá)水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與HF組、si-NC組比較,si-CircFoxo3組大鼠心肌組織CircFoxo3、TEAD1蛋白表達(dá)水平降低,miR-130a-5p表達(dá)水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與HF組、agomir NC組比較,miR-130a-5p agomir組大鼠心肌組織CircFoxo3表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),miR-130a-5p表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),TEAD1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。與si-CircFoxo3組、si-CircFoxo3+antagomir NC組比較,si-CircFoxo3+miR-130a-5p antagomir組大鼠心肌組織CircFoxo3表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),miR-130a-5p表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),TEAD1蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),見圖3。

?為Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。?～?為各組檢測指標(biāo)定量比較結(jié)果,與對照組比較,aP<0.05;與HF組比較,bP<0.05;與si-NC組比較,cP<0.05;與si-CircFoxo3組比較,dP<0.05;與agomir NC組比較,eP<0.05;與si-CircFoxo3+antagomir NC組比較,fP<0.05

2.4沉默CircFoxo3或過表達(dá)miR-130a-5p對各組大鼠LVESD、LVEDD、LVEF的影響比較 與對照組比較,HF組大鼠LVESD、LVEDD水平升高,LVEF水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與HF組、si-NC組比較,si-CircFoxo3組大鼠LVESD、LVEDD水平降低,LVEF水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與HF組、agomir NC組比較,miR-130a-5p agomir組大鼠LVESD、LVEDD水平降低,LVEF水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與si-CircFoxo3組、si-CircFoxo3+antagomir NC組比較,si-CircFoxo3+miR-130a-5p antagomir組大鼠LVESD、LVEDD水平升高,LVEF水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖4。

與對照組比較,aP<0.05;與HF組比較,bP<0.05;與si-NC組比較,cP<0.05;與si-CircFoxo3組比較,dP<0.05;與agomir NC組比較,eP<0.05;與si-CircFoxo3+antagomir NC組比較,fP<0.05

與對照組比較,aP<0.05;與HF組比較,bP<0.05;與si-NC組比較,cP<0.05;與si-CircFoxo3組比較,dP<0.05;與agomir NC組比較,eP<0.05;與si-CircFoxo3+antagomir NC組比較,fP<0.05

2.6沉默CircFoxo3或過表達(dá)miR-130a-5p對各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響比較 與對照組比較,HF組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。與HF組、si-NC組比較,si-CircFoxo3組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。與HF組、agomir NC組比較,miR-130a-5p agomir組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。與si-CircFoxo3組、si-CircFoxo3+antagomir NC組比較,si-CircFoxo3+miR-130a-5p antagomir組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05),見圖6。

?TUNEL染色結(jié)果(×200);?定量比較結(jié)果,與對照組比較,aP<0.05;與HF組比較,bP<0.05;與si-NC組比較,cP<0.05;與si-CircFoxo3組比較,dP<0.05;與agomir NC組比較,eP<0.05;與si-CircFoxo3+antagomir NC組比較,fP<0.05

2.7沉默CircFoxo3或過表達(dá)miR-130a-5p對各組大鼠心肌組織中Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的影響比較 與對照組比較,HF組大鼠心肌組織中Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平升高,Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)。與HF組、si-NC組比較,si-CircFoxo3組大鼠心肌組織中Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平降低,Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。與HF組、agomir NC組比較,miR-130a-5p agomir組大鼠心肌組織中Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平降低,Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。與si-CircFoxo3組、si-CircFoxo3+antagomir NC組比較,si-CircFoxo3+miR-130a-5p antagomir組大鼠心肌組織中Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平升高,Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05),見圖7。

?為Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。?～?為各組檢測指標(biāo)定量比較結(jié)果,與對照組比較,aP<0.05;與HF組比較,bP<0.05;與si-NC組比較,cP<0.05;與si-CircFoxo3組比較,dP<0.05;與agomir NC組比較,eP<0.05;與si-CircFoxo3+antagomir NC組比較,fP<0.05

2.8CircFoxo3調(diào)控miR-130a-5p/TEAD1軸的驗(yàn)證結(jié)果 Starbase網(wǎng)站預(yù)測CircFoxo3與miR-130a-5p、miR-130a-5p與TEAD1的結(jié)合位點(diǎn),見圖8。與mimic NC和CircFoxo3-WT共轉(zhuǎn)染組比較,miR-130a-5p mimic和CircFoxo3-WT共轉(zhuǎn)染組HEK-293T細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)。與mimic NC和CircFoxo3-MUT共轉(zhuǎn)染組比較,miR-130a-5p mimic和CircFoxo3-MUT共轉(zhuǎn)染組HEK-293T細(xì)胞的熒光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與mimic NC和TEAD1-WT共轉(zhuǎn)染組比較,miR-130a-5p mimic和TEAD1-WT共轉(zhuǎn)染組HEK-293T細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)。與mimic NC和TEAD1-MUT共轉(zhuǎn)染組比較,miR-130a-5p mimic和TEAD1-MUT共轉(zhuǎn)染組HEK-293T細(xì)胞的熒光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖9。

圖8 Starbase網(wǎng)站預(yù)測CircFoxo3與miR-130a-5p、miR-130a-5p與TEAD1的結(jié)合位點(diǎn)圖

圖9 各組HEK-293T細(xì)胞熒光素酶活性比較圖(*P<0.05)

3 討論

3.1HF通常是心血管疾病逐漸演變的終點(diǎn),其中心臟的長期代償活動(dòng)最終導(dǎo)致心臟舒張和收縮功能障礙[11]。此外,HF過程中由于體內(nèi)水液滯留,造成循環(huán)機(jī)械應(yīng)力傳導(dǎo)至心肌細(xì)胞,促使ST2大量產(chǎn)生,ST2可作為HF的標(biāo)志物[12]。NT-pro BNP也稱為氨基末端腦利鈉肽前體,心臟處于衰竭狀態(tài)時(shí)可引起NT-pro BNP升高[13]。本研究通過腹腔注射鹽酸阿霉素的方法構(gòu)建了HF大鼠模型,結(jié)果顯示,與對照組比較,HF組大鼠心功能指標(biāo)LVESD、LVEDD升高,LVEF降低,血清ST2、NT-pro BNP水平升高,符合HF的特征。

3.2CircFoxo3是一種新發(fā)現(xiàn)的環(huán)狀RNA,來源于親本FOXO3,可參與細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)[14]。已有研究報(bào)道,沉默CircFoxo3可抑制氧化應(yīng)激下的顆粒細(xì)胞凋亡[15]。心肌缺血再灌注損傷過程心肌組織中高表達(dá)的CircFoxo3能夠促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡[16]。本研究顯示,CircFoxo3在HF大鼠心肌組織中高表達(dá),沉默CircFoxo3可抑制HF大鼠心肌細(xì)胞凋亡,提示CircFoxo3可能成為治療HF的潛在有效靶點(diǎn)。CircRNA可通過充當(dāng)miRNA的海綿在HF進(jìn)展中發(fā)揮作用[17]。為了進(jìn)一步探究沉默CircFoxo3抑制HF大鼠心肌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制,本研究通過生物信息學(xué)分析及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)miR-130a-5p為CircFoxo3的靶基因。miR-130a-5p作為眾多miRNAs中的一種,過表達(dá)miR-130a-5p可對HF大鼠心臟重塑產(chǎn)生有益影響[18]。本研究結(jié)果也顯示,miR-130a-5p在HF大鼠心肌組織中低表達(dá),過表達(dá)miR-130a-5p可抑制HF大鼠心肌細(xì)胞凋亡,且沉默CircFoxo3后HF大鼠心肌組織中miR-130a-5p表達(dá)上調(diào),推測沉默CircFoxo3可能通過上調(diào)miR-130a-5p表達(dá)抑制HF大鼠心肌細(xì)胞凋亡。為了驗(yàn)證該推測,本研究在沉默CircFoxo3的基礎(chǔ)上再加上miR-130a-5p antagomir來對HF大鼠進(jìn)行干預(yù),結(jié)果顯示,miR-130a-5p antagomir減弱了沉默CircFoxo3對HF大鼠心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用,即認(rèn)為沉默CircFoxo3可能通過上調(diào)miR-130a-5p表達(dá)抑制HF大鼠心肌細(xì)胞凋亡。

3.3為了進(jìn)一步探究CircFoxo3/miR-130a-5p軸影響HF大鼠心肌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制,本研究通過生物信息學(xué)分析及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)TEAD1與miR-130a-5p存在靶向關(guān)系。TEAD1是一種在心血管發(fā)育中起著至關(guān)重要作用的因子[19]。據(jù)報(bào)道,上調(diào)TEAD1可促進(jìn)急性心肌梗死模型大鼠心肌細(xì)胞凋亡[20]。本研究也發(fā)現(xiàn),TEAD1蛋白在HF大鼠心肌組織中高表達(dá),沉默CircFoxo3后HF大鼠心肌組織中miR-130a-5p表達(dá)上調(diào),TEAD1蛋白表達(dá)下調(diào),且miR-130a-5p antagomir減弱了沉默CircFoxo3對HF大鼠心肌組織中TEAD1蛋白表達(dá)的抑制作用。證實(shí)了沉默CircFoxo3可能通過調(diào)控miR-130a-5p/TEAD1軸抑制HF大鼠心肌細(xì)胞凋亡。

3.4近年來,細(xì)胞凋亡一直是HF研究的熱點(diǎn)。研究表明細(xì)胞凋亡與HF的嚴(yán)重程度之間存在正相關(guān)關(guān)系[21]。Bcl-2是抗凋亡蛋白,而Bax是促凋亡蛋白,在持續(xù)壓力超負(fù)荷引起的HF過程中,Bcl-2蛋白參與抑制心肌細(xì)胞凋亡,Bax蛋白僅參與心肌細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)[22]。作為細(xì)胞凋亡的最終執(zhí)行者,天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(aspartate-specific cysteine protease-3,caspase-3)通常以無活性酶原的形式存在,一旦發(fā)生凋亡級聯(lián)反應(yīng),caspase-3被裂解并活化為cleaved caspase-3,因此抑制cleaved caspase-3也可以抑制細(xì)胞凋亡[23]。本研究顯示,與對照組比較,HF組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率和心肌組織中Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平升高,Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低,且心肌組織病理損傷及心肌纖維化嚴(yán)重,表明HF引起的心肌細(xì)胞凋亡會(huì)加重心肌組織損傷,提示抑制心肌細(xì)胞凋亡可能成為改善HF的有效策略之一。本研究結(jié)果顯示,沉默CircFoxo3后,大鼠心肌組織中Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平降低,Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高,提示沉默CircFoxo3可能通過調(diào)控miR-130a-5p/TEAD1軸影響凋亡相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)而抑制HF大鼠心肌細(xì)胞凋亡。

綜上所述,沉默CircFoxo3可能通過上調(diào)miR-130a-5p來抑制TEAD1表達(dá),進(jìn)而抑制HF大鼠心肌細(xì)胞凋亡。CircFoxo3/miR-130a-5p/TEAD1軸可能成為治療HF的潛在有效靶點(diǎn)。