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    太白米離體愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生1)

    2014-09-18 11:12:10宋利偉張存旭康永祥
    關(guān)鍵詞:太白鱗莖外植體

    宋利偉 張存旭 康永祥 王 豪

    (西北農(nóng)林科技大學(xué),楊凌,712100)

    太白米[Notholin hyacinthinum(wils)staff],又名假百合,系百合科假百合屬的多年生草本植物。其具有寬胸理氣、健胃鎮(zhèn)痛、祛風(fēng)止咳等功效,主要用于對淺表性胃炎、萎縮性胃炎及胃痛腹脹、嘔吐、風(fēng)寒咳嗽等的治療[1],多數(shù)情況下,與其他藥物配合,對肝癌、胃癌、食道癌等疾病的治療有特殊功效,因此,被視為名貴中草藥[2]。由于其顯著療效及多樣化的用途,人們對其需求日益增長。太白米生長高山之上,主要由天然資源供應(yīng),長期盲目的采用,又加上人們對植物藥的需求量日益劇增,使得這一野生資源近于枯竭[3]。保護(hù)和大規(guī)模栽植這一重要物種迫在眉睫。為此,早在20世紀(jì)80年代太白米就被列為太白山國家自然保護(hù)區(qū)珍稀瀕危植物之一[2],并開展了一系列的相關(guān)栽培技術(shù)研究[4-5]。在自然條件下,太白米依靠鱗莖進(jìn)行無性繁殖,一般周期長、繁殖率低[6];因其為種子后熟植物,種子細(xì)小、休眠期長、發(fā)芽率低,故一般不用種子繁殖[4]。因此,對太白米進(jìn)行組織快繁培養(yǎng),以便大面積的人工栽培擴(kuò)大藥源十分必要。與傳統(tǒng)繁殖方法相比,植物組織培養(yǎng)快繁技術(shù)能在較短的時間內(nèi)提供大量的優(yōu)質(zhì)種苗,越來越受到人們的重視,并在生產(chǎn)上得到了廣泛應(yīng)用[7-8]。有關(guān)太白米的組織培養(yǎng)研究鮮有報道[3,9-10],且均未完成植株再生方案的建立。文中旨在通過系統(tǒng)研究太白米離體愈傷組織的誘導(dǎo)及植株再生過程,建立一套完整的太白米植株再生體系,為工廠化生產(chǎn)提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    2012年7月份,在陜西太白山采挖優(yōu)良野生植株,立即帶回實驗室。以葉片、鱗莖的外鱗片、小鱗莖、鱗葉以及組織培養(yǎng)獲得的不定芽,作為起始外植體。

    外植體消毒條件的建立:取太白米葉片、鱗莖的外鱗片、剝?nèi)ズ稚鈿さ男△[莖,用洗潔精浸泡10~15 min,流水沖洗1 h,無菌條件下,葉片用75%酒精消毒6 s、其余外植體75%酒精消毒30 s,無菌水沖洗2次,葉片及鱗莖的外鱗片用0.1%HgCl2消毒6 min、小鱗莖消毒10 min,無菌水沖洗5~6次,將外鱗片與葉片(含有中脈)切成約1 cm×1 cm、不定芽切為長1~1.5 cm,鱗片、小鱗莖及鱗葉凹面朝上,葉片遠(yuǎn)軸面朝上,不定芽水平放置,接種于培養(yǎng)基中。

    培養(yǎng)基配制:愈傷組織誘導(dǎo)以MS(Murashige and Skoog,1962)為基本培養(yǎng)基,分別添加 NAA(0.1、0.5、1.0 mg·L-1)、2,4-D(0.1、0.5 mg·L-1)、0.1 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA、0.1 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-12,4-D。

    將初代培養(yǎng)的愈傷組織轉(zhuǎn)接到MS附加0.5mg·L-1NAA的增殖培養(yǎng)基上,每隔28 d繼代一次。將增殖后的愈傷組織切成3 mm×3 mm×3 mm左右,轉(zhuǎn)接到不同的分化培養(yǎng)基上:MS分別添加TDZ(0.1、0.5、1.0 mg·L-1)、6-BA(0.1、0.5、1.0 mg·L-1)、1.0 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA。

    將長約3 cm的不定芽從基部切下,轉(zhuǎn)接到添加NAA 梯度為 0.5、1.0 mg·L-1的 MS 和 1/2MS 的生根培養(yǎng)基中。

    所有培養(yǎng)基均添加 30 g·L-1蔗糖、6 g·L-1瓊脂(產(chǎn)地:北京)、0.5 g·L-1水解酪蛋白;pH 值調(diào)至5.8,于121℃高壓濕熱滅菌20 min。

    培養(yǎng)條件:培養(yǎng)容器均采用青色琉璃瓶(60 mm×90 mm),培養(yǎng)室溫度(25±1)℃,采用暗培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織,其余為光培養(yǎng),以光照強(qiáng)度為50 umol·m-2·s-1的冷白熒光燈管為光源,光照 14 h·d-1。

    試驗設(shè)計和數(shù)據(jù)分析:誘導(dǎo)愈傷組織階段每個處理6瓶,每瓶5個外植體;誘導(dǎo)分化芽階段每個處理5瓶,每瓶4個外植體;誘導(dǎo)生根階段每個處理5瓶,每瓶4個外植體;所有試驗均重復(fù)3次。統(tǒng)計參數(shù)包括:愈傷組織誘導(dǎo)率=(長愈傷的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù))×100%,愈傷組織形成所需時間;芽分化率=(長芽的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù))×100%,增殖后芽長及個數(shù);生根誘導(dǎo)率=(生根的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù))×100%,根長及個數(shù)。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,其中包括方差分析、Duncan’s多重比較分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 愈傷組織的誘導(dǎo)

    2.1.1 外植體類型對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

    將不同類型的外植體接種到 MS+1.0 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-12,4-D 的培養(yǎng)基中。3 d 后小鱗莖稍有膨大,5 d后鱗片膨大,7 d后鱗葉膨大。所有外植體都有不同程度的褐化現(xiàn)象,其中葉片褐化最為嚴(yán)重,鱗片次之,小鱗莖、鱗葉、不定芽較輕。不同類型外植體上均有愈傷組織形成(圖1A~E),其中以鱗片上出現(xiàn)的最早,約為9 d;不定芽上的最晚,約為24 d。葉片、鱗片及不定芽的愈傷組織形成于切口邊緣;鱗葉、小鱗莖在基部或切口邊緣,且伴隨有鱗芽的萌發(fā)。30 d后統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率(表1)。方差分析表明,不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)率間存在極顯著差異(P<0.01),其中以鱗葉誘導(dǎo)率最高,為75.5%;葉片的最低,為3.3%。葉片愈傷組織為白色,質(zhì)地疏松;不定芽的為黃色、瘤狀,質(zhì)地緊密;其余均為淡黃色、瘤狀,質(zhì)地緊密。

    表1 外植體類型對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

    2.1.2 植物生長調(diào)節(jié)劑對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

    將鱗葉接種于MS附加不同植物生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上,7 d稍有膨大,12 d左右在鱗葉基部或切口處產(chǎn)生淡黃色愈傷組織,30 d后統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率(表2)。方差分析表明,植物生長調(diào)節(jié)劑對愈傷組織誘導(dǎo)的影響極顯著(P<0.01)。不同處理均有淡黃色、瘤狀、緊密的愈傷組織形成。分別附加0.5 mg·L-1NAA、0.5 mg·L-1NAA+0.1 mg·L-16-BA的MS培養(yǎng)基中的愈傷組織出現(xiàn)的最早,約為12 d;MS+0.1 mg·L-1NAA中的愈傷組織出現(xiàn)的最晚,約為22 d。MS+0.5 mg·L-1NAA 中的愈傷組織誘導(dǎo)率最高,可達(dá) 90.5%;MS+1.0 mg·L-1NAA 中的最低,為47.1%。單獨(dú)添加生長素時,愈傷組織誘導(dǎo)率高于生長素和細(xì)胞分裂素組合。

    表2 植物生長調(diào)節(jié)劑對鱗葉愈傷組織誘導(dǎo)的影響

    2.2 愈傷組織增殖與芽的分化

    2.2.1 愈傷組織的增殖

    將初代培養(yǎng)的愈傷組織,轉(zhuǎn)接到附加不同種類和不同質(zhì)量濃度植物生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基上。隨著繼代次數(shù)的增加,有些愈傷組織上直接長出白色的不定根且有不同程度的褐化現(xiàn)象。當(dāng)NAA質(zhì)量濃度分別降低為 0.1、0.2、0.3 mg·L-1后,培養(yǎng) 28 d,其中添加0.3 mg·L-1NAA 的培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)有不定根生成和褐化現(xiàn)象;質(zhì)量濃度為 0.2 mg·L-1時,無不定根形成,但愈傷組織增殖緩慢;在質(zhì)量濃度為 0.1 mg·L-1的培養(yǎng)基上,愈傷組織生長旺盛,富有光澤,且增殖較快(圖1F)。

    圖1 太白米愈傷組織的誘導(dǎo)及植株再生

    2.2.2 植物生長調(diào)節(jié)劑對不定芽分化及生長的影響

    將繼代3次后的愈傷組織轉(zhuǎn)接到不同的分化培養(yǎng)基上,誘導(dǎo)不定芽分化。15 d左右,在附加0.1 mg·L-1TDZ培養(yǎng)基的愈傷組織表面凸現(xiàn)少量淺白色的芽點;在 MS+0.1 mg·L-16-BA 的培養(yǎng)基上不定芽出現(xiàn)的最晚,為20 d左右,45 d后芽叢數(shù)目增多且顏色轉(zhuǎn)綠(圖1G)。方差分析表明,不同處理芽分化率間存在極顯著差異(P<0.01)。由表3可知,隨 TDZ 質(zhì)量濃度增加(0.1~1.0 mg·L-1),芽分化率明顯降低;而6-BA對芽分化的影響,則隨質(zhì)量濃度的增加而增加。

    單獨(dú)使用低質(zhì)量濃度的TDZ(0.1 mg·L-1)時,不定芽平均個數(shù)可達(dá)7.4個、長度可達(dá)4.8 cm,伸長效果較佳,但叢生芽細(xì)弱,不利于生根培養(yǎng);隨著濃度的增加,叢生芽數(shù)及長度均有所下降,所以高濃度TDZ不利于芽的增殖。單獨(dú)附加6-BA時,隨濃度的增加,叢生芽數(shù)增多;當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為1.0 mg·L-1時,叢生芽數(shù)最多,約平均為 7.6 個、平均長度可達(dá)4.3 cm,但同樣出現(xiàn)叢生芽細(xì)弱的現(xiàn)象,有些甚至形成了畸形芽。在 MS+1.0 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA的培養(yǎng)基上的叢生芽數(shù)最多,平均約為9個,平均長度為3.5 cm,且叢生芽生長健壯,適于生根培養(yǎng)。

    2.3 生根誘導(dǎo)

    將長約3 cm的芽從基部切下,轉(zhuǎn)接到不同的生根培養(yǎng)基中(表4)。20 d左右,在1/2MS+NAA1.0 mg·L-1培養(yǎng)基中,芽基部膨大處凸顯白色小點;其余在25 d出現(xiàn)白色小點。培養(yǎng)40 d后,長出細(xì)絲毛狀約0.5 cm的不定根,且基部都有不同程度的愈傷化,60 d左右根長可達(dá)1~2 cm,其上有許多須根(圖1H)。方差分析表明,不同培養(yǎng)基間生根率差異不顯著(P=0.132),但平均根數(shù)(P=0.010)及根長(P=0.042)存在顯著差異。其中添加不同質(zhì)量濃度的NAA的MS培養(yǎng)基上的根生長細(xì)弱,個數(shù)較少,生長緩慢;添加 1.0 mg·L-1NAA 的 1/2MS培養(yǎng)基上的根長勢粗壯,根毛較多,且生根率較高,其平均根數(shù)為 9.8 個、平均根長為 2.2 cm。

    表3 植物生長調(diào)節(jié)劑對不定芽分化的影響

    2.4 馴化移栽

    待根長至2 cm左右時,開瓶2 d,小心洗去上面殘留的瓊脂培養(yǎng)基,移入V(腐殖質(zhì))∶V(蛭石)∶V(沙)=1∶1∶1的基質(zhì)中,濕度保持在80%,自然光50%的條件下,培養(yǎng)15 d轉(zhuǎn)移到通風(fēng)透光處,獲得太白米植株(圖1I)。

    表4 不同處理對生根的影響

    3 結(jié)論與討論

    在離體繁殖中,愈傷組織的誘導(dǎo)、生長和發(fā)育受到諸多因子的影響,如外植體類型、不同的光照條件和光周期、培養(yǎng)基、溫度等。尤其是植物生長調(diào)節(jié)劑對愈傷組織誘導(dǎo)影響顯著,生長素在愈傷組織誘導(dǎo)及生長過程中起著主要作用[12]。在太白米的離體繁殖中,大多采用小鱗莖作為外植體,亦有人以葉片為外植體,但尚未有葉片愈傷組織的報道[3,5],更少有以鱗片、鱗葉以及愈傷組織誘導(dǎo)出的不定芽為外植體。本試驗通過太白米不同外植體類型及植物生長調(diào)節(jié)劑對愈傷組織誘導(dǎo)的研究,首次從鱗片和葉片上誘導(dǎo)出愈傷組織;鱗葉愈傷組織的誘導(dǎo)率高于其他外植體,且高于已有文獻(xiàn)報道的結(jié)果[13]。不同外植體上愈傷組織的誘導(dǎo)能力不同,表明植物材料本身各個部位的生理狀態(tài)不同。植物生長調(diào)節(jié)劑對鱗葉愈傷組織誘導(dǎo)的結(jié)果表明,其最適培養(yǎng)基為MS+0.5 mg·L-1NAA。

    愈傷組織增殖及不定芽分化是影響太白米離體快繁的主要因素。結(jié)果表明,低質(zhì)量濃度的NAA(0.1 mg·L-1)更有利于愈傷組織的增殖。一般來說,生長素用于愈傷組織的誘導(dǎo)和增殖;而生長素和細(xì)胞分裂素共同作用于愈傷組織的再分化[14]。在誘導(dǎo)器官分化途徑上,低質(zhì)量濃度的TDZ可誘導(dǎo)不定芽產(chǎn)生,被認(rèn)為是比其他細(xì)胞分裂素更有效的一種激素,且已廣泛應(yīng)用于百合科的許多植物中[15-18]。本研究結(jié)果顯示,MS+0.1 mg·L-1TDZ培養(yǎng)基中的愈傷組織分化率最高,而 MS+1.0 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA 培養(yǎng)基中芽的增殖效果最好。

    植物生根是移栽成苗的關(guān)鍵步驟,其受基本培養(yǎng)基與植物生長調(diào)節(jié)劑的影響。研究結(jié)果表明,1/2MS+1.0 mg·L-1NAA 的培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根效果最好,誘導(dǎo)率可達(dá)91.4%,且不定根長勢健壯,故最適合生根培養(yǎng)。

    綜上所述,通過組織培養(yǎng)器官發(fā)生途徑,獲得了太白米再生植株,初步建立了一套離體快繁培養(yǎng)體系。但要投入商業(yè)化應(yīng)用,仍然需要開展進(jìn)一步的研究工作,如愈傷組織增殖的液體培養(yǎng)、降低培養(yǎng)成本等。

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