奶牛乳源外泌體提取方法的優(yōu)化及效果評價

趙 瑩 王靖雷 王 萌 王立斌,2 張 倩 李志杰 馬 鑫 余四九,2 潘陽陽,2*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,蘭州 730070;2.甘肅省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心,蘭州 730070 )

外泌體是一種外形呈圓形或橢圓形,有部分凹陷,樣似“茶托”形,介于30～200 nm雙層膜結(jié)構(gòu)的納米級細(xì)胞外囊泡[1]。外泌體是由活細(xì)胞內(nèi)出芽方式分泌產(chǎn)生形成的內(nèi)吞小體,并以胞吐方式釋放到細(xì)胞間隙,當(dāng)受體細(xì)胞接收后發(fā)揮作用,從而達(dá)到細(xì)胞間信息交流[2]。外泌體可存在于機(jī)體大部分體液中,如乳液、唾液、羊水、腹水、血液、尿液、腦脊液等[3],且免疫系統(tǒng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、肥大細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等許多細(xì)胞均可分泌外泌體[4]。外泌體由脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸(DNA、mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA等)組成[5],因有脂質(zhì)雙分子層保護(hù),可穩(wěn)定存在。

荷斯坦奶牛乳中含豐富外泌體[6],由乳腺上皮細(xì)胞分泌產(chǎn)生,并包裹蛋白質(zhì)、核酸、聚糖、脂質(zhì)等具有生物活性的內(nèi)含物,內(nèi)含物被受體接收后進(jìn)行細(xì)胞間信息傳遞、細(xì)胞傳遞、血管新生、免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、抗氧化、腫瘤細(xì)胞生長等[7]。Munagala等[8]研究發(fā)現(xiàn),乳源外泌體可作為藥物載體達(dá)到靶向治療作用;Hock等[9]研究發(fā)現(xiàn),乳源外泌體可提高腸道上皮細(xì)胞活力,促進(jìn)細(xì)胞增殖并刺激腸道干細(xì)胞活性的提高,用乳源外泌體給藥可防止壞死性結(jié)腸炎發(fā)生;Samuel等[10]研究發(fā)現(xiàn),乳源外泌體富含與免疫應(yīng)答和生長有關(guān)的蛋白質(zhì),通過調(diào)節(jié)這些蛋白質(zhì)可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫機(jī)能和生長修復(fù);駱駝乳來源外泌體可抑制乳腺腫瘤細(xì)胞生長[11];牦牛乳源外泌體可提升細(xì)胞抗低氧能力[12];Li等[13]研究發(fā)現(xiàn),乳源外泌體可作為包封親水性大分子藥物并口服的載體,可見開發(fā)乳源外泌體具有重要的生物學(xué)和商業(yè)價值,雖通過細(xì)胞培養(yǎng)也可收集到大量外泌體,但操作過程耗時費(fèi)力,需要特殊設(shè)備,成本高,獲取量少且質(zhì)量不穩(wěn)定,不適用于用量大的試驗研究。因此,眾多試驗通過建立不同的技術(shù)方法,從乳汁中分離提取大量外泌體。

目前已知外泌體可通過差速超速離心法、化學(xué)沉淀法、蔗糖密度梯度離心法、超濾分離法、尺寸排阻色譜法、免疫親和法、微流控法和其他商業(yè)試劑盒等提取方法得到。超濾分離法主要通過濾膜孔徑不同來分離外泌體,該方法操作簡單、耗時短,且保證外泌體生物活性,但易堵塞濾膜,與外泌體同等大小的蛋白質(zhì)雜質(zhì)與之混雜,且過膜壓力會對外泌體造成機(jī)械性損傷,導(dǎo)致分離純度低,因此僅適用于尿液、細(xì)胞培養(yǎng)液等的外泌體提取;尺寸排阻色譜法是通過固定相多孔凝膠孔徑大小分離外泌體,方法簡單高效,純度高且色譜柱可重復(fù)使用,但操作耗時費(fèi)力,需要特殊設(shè)備,成本高且獲取量少,且存在高密度脂質(zhì)顆粒,不適用處理大量樣品及乳源外泌體的試驗研究;免疫親和法是通過外泌體表面蛋白抗原與抗體特異性結(jié)合來分離外泌體,該方法操作簡單,特異性高,可保證外泌體的完整,但效率低,特異性抗體貴且易受其他因素影響;微流控法是通過控制微通道中流體行為來分離外泌體,該方法耗時短,純度高,常在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域使用,但目前未見其在乳源外泌體研究中的應(yīng)用;不對稱流場流分餾法通過分流技術(shù)分離大尺徑范圍內(nèi)樣品,如聚合物、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等,該方法獲取外泌體較完整,但耗時長,設(shè)備昂貴[14]。綜上所述,仍需通過比較不同外泌體提取方法的優(yōu)缺點(diǎn),結(jié)合乳汁特性,挖掘高效穩(wěn)定的乳源外泌體提取方法。

牛乳含大量酪蛋白,提取外泌體較其他組織困難。乳源外泌體分離常使用差速超速離心法、蔗糖密度梯度離心法和化學(xué)沉淀法,但前人發(fā)現(xiàn),差速超速離心法、凝乳酶法、乙酸法和蔗糖密度梯度離心法都存在提取數(shù)量少、純度低、步驟復(fù)雜、耗時長、過程外泌體損傷等問題,本試驗通過改變乙酸或凝乳酶用量、調(diào)整蔗糖密度梯度,減少離心步驟先將4種提取方法進(jìn)行優(yōu)化,并通過透射電子顯微鏡(TEM)、納米粒子跟蹤分析(NTA)、蛋白濃度檢測(BCA)、免疫印跡(WB)方法鑒定提取到的乳源外泌體,比較分析每種優(yōu)化后提取乳源外泌體方法的優(yōu)缺點(diǎn),旨在確定最佳提取乳源外泌體的方法,為進(jìn)一步研究奶牛乳源外泌體生物功能及應(yīng)用提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及樣品采集

選用甘肅省蘭州市某奶牛場20頭4～5歲齡、4～6胎次、處于泌乳期且無乳房炎的健康荷斯坦奶牛,在收集牛奶之前,用溫水清洗乳房和酒精徹底擦拭。用無菌瓶采集乳汁樣本,并將其混勻,用冰袋快速帶回實(shí)驗室,儲存于-80 ℃冰箱。

1.2 乳源外泌體提取方法的優(yōu)化

參照前人提取方法,對其中各項參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,達(dá)到減少操作步驟和時間,快速提取到大量雜蛋白少、純度高的外泌體。乳源外泌體提取過程均在無菌環(huán)境下進(jìn)行,每種提取方法均先將200 mL荷斯坦奶牛乳從-80 ℃冰箱取出,于25 ℃恒溫水浴鍋解凍。每種乳源外泌體主要優(yōu)化超高速離心前的乳清提取步驟。

1.2.1 差速超速離心法的優(yōu)化

優(yōu)化前,差速超速離心法[15](多步離心)乳清提取需3步:①全脂牛奶離心10 min(300×g,4 ℃)取上清;②上清液離心10 min(2 000×g,4 ℃)取上清;③上清液離心30 min(10 000×g,4 ℃)取上清。

優(yōu)化后,差速超速離心法乳清提取只需1步,原奶離心30 min(16 500×g,4 ℃)取上清,除去細(xì)胞、蛋白質(zhì)、脂肪等,再超高速離心取沉淀,使用0.45 μm過濾器過濾,轉(zhuǎn)移乳清至超速離心管中;再離心120 min(120 000×g,4 ℃)除上清液,用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)重懸收集達(dá)到清洗作用;使用0.22 μm過濾器過濾除去細(xì)菌、凋亡小體和聚集囊泡,超高速離心60 min(120 000×g,4 ℃)除上清液,用100 μL PBS重懸收集外泌體;轉(zhuǎn)移至無菌離心管中,立即使用或-80 ℃儲存用于進(jìn)一步試驗。

1.2.2 凝乳酶法的優(yōu)化

優(yōu)化前,1)凝乳酶法[16](添加乙酸)乳清提取需6步:①全脂牛奶離心15 min(277×g,4 ℃)取上清,重復(fù)2次;②上清液中添加10%乙酸溶液,將pH調(diào)至6;③加入0.035 mg/mL凝乳酶(NaCl溶液溶解),37 ℃水浴30 min;④加上清液中,37 ℃水浴30 min;⑤離心30 min(9 983×g,4 ℃)取上清;⑥上清液離心60 min(9 983×g,4 ℃)取上清。2)凝乳酶法[17](孵育6 h)乳清提取需4步:①全脂牛奶離心30 min(8 000×g,4 ℃)取上清;②上清液離心60 min(13 200×g,4 ℃)取上清;③上清液添加凝乳酶0.025 g/L;④37 ℃孵育6 h。

優(yōu)化后,凝乳酶法前期乳清準(zhǔn)備只需2步:①常溫下原奶中添加pH 5.5的0.2 g/L凝乳酶氯化鈉溶液,在28 ℃恒溫水浴20 min使酪蛋白沉淀后;②離心30 min(16 500×g,4 ℃)去除細(xì)胞、蛋白質(zhì)、脂肪、酪蛋白等,后續(xù)步驟與本試驗優(yōu)化后正常差速超速離心法相同。

1.2.3 乙酸法的優(yōu)化

優(yōu)化前,1)乙酸法[16](pH 4.6)乳清提取需4步:①全脂牛奶樣品離心15 min(277×g,4 ℃)取上清,去除細(xì)胞,重復(fù)2次;②上清液中加入10%乙酸溶液,將pH調(diào)至4.6靜置10 min;③上清液離心30 min(9 983×g,4 ℃)取上清;④上清液離心60 min(9 983×g,4 ℃)取上清。2)乙酸法[18](牛奶和乙酸體積比為100∶5)乳清提取需3步:①脫脂牛奶37 ℃預(yù)熱10 min,②室溫添加乙酸(牛奶和乙酸體積比為100∶5)混合5 min;③離心10 min(10 000×g,4 ℃)取上清。

優(yōu)化后,乙酸法乳清提取只需2步:①常溫下每1 mL原奶中添加4 μL純乙酸溶液至pH 5.0,靜置10 min使酪蛋白沉淀;②離心30 min(16 500×g,4 ℃)去除細(xì)胞、蛋白質(zhì)、脂肪、酪蛋白等。后續(xù)步驟與本試驗優(yōu)化后差速超速離心法相同。

1.2.4 蔗糖密度梯度離心法的優(yōu)化

優(yōu)化前,1)蔗糖密度梯度離心法[19](43%、35%、20%蔗糖梯度)的乳清提取需5步:①去除牛奶中細(xì)胞、脂肪、酪蛋白等物質(zhì);②上清液離心70 min(150 000×g,4 ℃)取沉淀,添加5 mL PBS吹勻為混懸液;③超高速管中依次加入43%、35%、20%濃度蔗糖溶液,混懸液加入頂層;④離心90 min(110 000×g,4 ℃)取43%和35%(平均密度1.7 g/mL)沉淀液體;⑤沉淀液體離心90 min(110 000×g,4 ℃)取沉淀。2)蔗糖密度梯度離心法[20](30%蔗糖)的乳清提取需5步:①樣品離心10 min(300×g,4 ℃)取上清;②上清液離心30 min(10 000×g,4 ℃)取上清;③超高速離心管中依次加入PBS、30%蔗糖溶液,上清液加入頂層;④離心90 min(100 000×g,4 ℃)取沉淀,添加PBS吹勻為混懸液;⑤混懸液離心90 min(100 000×g,4 ℃)取沉淀。

優(yōu)化后,蔗糖密度梯度離心法只需3步:①在超高速離心管中依次添加40%、30%、20%、10%、5%濃度蔗糖溶液,優(yōu)化后差速超速離心法提取的最終混懸液加入頂層;②離心120 min(120 000×g,4 ℃)除上清液,取40%、30%沉淀液體,使用0.22 μm過濾器過濾除去細(xì)菌、凋亡小體和聚集囊泡,使用PBS重懸收集沉淀吹勻為混懸液,達(dá)到清洗作用;③混懸液離心60 min(110 000×g,4 ℃)取沉淀,用100 μL PBS重懸收集乳源外泌體。

1.3 乳源外泌體鑒定

1.3.1 TEM鑒定乳源外泌體

TEM可分辨直徑1 nm內(nèi)圖像,鑒定原理是將外泌體固定在網(wǎng)上并染色干燥,用TEM調(diào)整視野觀察拍照,對比形態(tài)鑒定外泌體。取混勻奶牛乳源外泌體20 μL滴加在銅網(wǎng);加入2%醋酸雙氧鈾1滴,負(fù)染乳源外泌體30 min,日光燈干燥;TEM觀察選擇電壓80 kV,視野調(diào)整到直徑200 nm,找到合適視野觀察拍照保存。

1.3.2 WB鑒定乳源外泌體

將奶牛乳源外泌體裂解離心的上清液,與4×蛋白上樣緩沖液混勻,100 ℃煮沸15 min;蛋白上樣量10 μL,Marker上樣量4 μL;電壓70 V電泳30 min;電壓轉(zhuǎn)120 V電泳60 min;裁剪與膠相等大小的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜浸泡甲醇激活30 s;橫流200 mA轉(zhuǎn)膜80 min;封閉液室溫孵育120 min;去除封閉液,將PVDF膜分別加入抗體:腫瘤易感基因101蛋白(TSG101)、熱休克蛋白70(HSP70)、四次跨膜蛋白家族中CD81和CD9,4 ℃封閉過夜;回收抗體PVDF膜用Tris-HCl緩沖鹽溶液+吐溫(TBST)溶液洗30 min;將PVDF膜相應(yīng)加入抗兔二抗和鼠二抗室溫孵育120 min;回收抗體PVDF膜用TBST溶液洗40 min;配制好化學(xué)發(fā)光顯色液,使用化學(xué)發(fā)光儀曝光成像并保存。

1.3.3 NTA鑒定乳源外泌體

NTA是納米粒子常用一束光照射,當(dāng)光被納米粒子散射并發(fā)生布朗運(yùn)動時,便可記錄納米粒子運(yùn)動路徑、擴(kuò)散系數(shù)和平均速度。將乳源外泌體放置冰上,PBS稀釋,使用粒徑分析儀檢測,對懸浮液中特定直徑30～1 000 nm外泌體和囊泡,實(shí)時進(jìn)行逐個直接成像及觀察;最后通過Zeta view 8.04. 02.軟件計算出乳源外泌體粒徑分布。

1.3.4 BCA鑒定乳源外泌體

奶牛乳源外泌體中添加蛋白裂解液,4 ℃裂解30 min,離心5 min(12 000×g,4 ℃),取上清至無菌離心管,按BCA蛋白檢測試劑盒說明書操作,制定蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線,在562 nm處測吸光度值,通過公式計算樣品蛋白濃度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對BCA蛋白濃度測定和NTA所得數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗,比較優(yōu)化后4種方法提取的蛋白濃度和粒子濃度差異顯著性。對比分析WB優(yōu)化前和優(yōu)化后4種方法提取的外泌體條帶。使用ImageJ2x軟件進(jìn)行WB條帶灰度值分析。使用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行繪制差異性顯著分析。P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 對比每種優(yōu)化前和優(yōu)化后的乳源外泌體提取方法

2.1.1 對比優(yōu)化前和優(yōu)化后3種提取方法的乳清

本試驗將優(yōu)化前和優(yōu)化后差速超速離心法、凝乳酶法和乙酸法提取的乳清進(jìn)行拍照對比,如圖1所示,差速超速離心法優(yōu)化后比優(yōu)化前(多步離心)提取的乳清沉淀效果更好;凝乳酶法優(yōu)化后比優(yōu)化前提取的乳清沉淀效果更好;乙酸法優(yōu)化后比優(yōu)化前提取的乳清沉淀效果更好。因蔗糖密度梯度離心法的篩選,主要在超高速離心且蔗糖濃度濾過部分,所以無乳清對比圖。因此,3種方法均顯示優(yōu)化后提取的乳清比優(yōu)化前沉淀更多。

A:差速超速離心法;B:凝乳酶法;C:乙酸法。下圖同。A: differential overspeed centrifugal method; B: rennet method; C: acetic acid method. The same as below.

2.1.2 TEM鑒定對比每種優(yōu)化前和優(yōu)化后的乳源外泌體形態(tài)

TEM是鑒定外泌體的金標(biāo)準(zhǔn),可直觀對比外泌體典型形態(tài)和密度。分別對優(yōu)化前和優(yōu)化后4種方法對比分析,如圖2所示,通過對圖像結(jié)果觀察對比,優(yōu)化前和優(yōu)化后的4種方法取得乳源外泌體均具有外形呈圓形有部分凹陷樣似“茶托”形典型結(jié)構(gòu),粒徑均在30～200 nm,差速超速離心法優(yōu)化后比優(yōu)化前提取的外泌體含量高;凝乳酶法優(yōu)化后比優(yōu)化前提取的外泌體含量高;乙酸法優(yōu)化后比優(yōu)化前提取的外泌體含量高,且外泌體表面光滑;蔗糖密度梯度離心法優(yōu)化后比優(yōu)化前提取的外泌體含量高。因此,本試驗優(yōu)化后4種方法提取的外泌體含量均明顯高于優(yōu)化前提取方法,且部分優(yōu)化前提取的外泌體表面粗糙,形態(tài)結(jié)構(gòu)被損傷。

D:蔗糖密度梯度離心法,其中(1)為優(yōu)化前蔗糖密度梯度離心法(43%、35%、20%蔗糖梯度),(2)為優(yōu)化前蔗糖密度梯度離心法(30%蔗糖)。下圖同。D:sucrose density gradient centrifugation method, (1) is the gradient centrifugation of sucrose density before optimization (43%, 35%, 20% sucrose gradients), and (2) is the gradient centrifugation of sucrose density before optimization (30% sucrose). The same as below.

2.1.3 WB鑒定對比每種優(yōu)化前和優(yōu)化后的乳源外泌體特異性蛋白表達(dá)量

利用WB條帶分別對優(yōu)化前和優(yōu)化后4種方法提取的乳源外泌體進(jìn)行對比鑒定,如圖3所示,特異性標(biāo)記蛋白CD81均有表達(dá),4種方法均顯示優(yōu)化后提取的外泌體蛋白表達(dá)量比優(yōu)化前高。

圖3 優(yōu)化前和優(yōu)化后4種提取方法的WB條帶對比

對比優(yōu)化前和優(yōu)化后的4種方法提取的乳源外泌體WB條帶灰度值,如表1所示,差速超速離心法優(yōu)化后提取的外泌體含量顯著高于優(yōu)化前(多步離心)(P<0.05);凝乳酶法優(yōu)化后提取的外泌體含量最多,顯著高于優(yōu)化前(P<0.05);乙酸法優(yōu)化后提取的外泌體含量顯著高于優(yōu)化前(P<0.05);蔗糖密度梯度離心法優(yōu)化后提取的外泌體含量顯著高于優(yōu)化前(P<0.05)。因此,本試驗優(yōu)化后4種方法提取的外泌體含量均顯著高于優(yōu)化前。

表1 優(yōu)化前和優(yōu)化后4種提取方法的WB條帶灰度值對比結(jié)果

2.2 鑒定比較優(yōu)化后的4種最優(yōu)乳源外泌體提取方法

2.2.1 優(yōu)化后乳源外泌體提取方法

對優(yōu)化后乳源外泌體提取方法進(jìn)行歸納,如圖4所示,優(yōu)化后的提取方法主要分為乳清提取和外泌體沉淀,高速離心去除酪蛋白、脂肪、細(xì)胞及蛋白質(zhì)等,使用0.45 μm過濾器過濾,第1次超高速離心,使用0.22 μm過濾器過濾去除細(xì)菌、凋亡小體和聚集囊泡,第2次超高速離心,最終獲得外泌體沉淀。

Centrifugal:離心;washing:溶液;filtration:過濾;exosomes:外泌體;casein:酪蛋白;cell debris:細(xì)胞碎片;fat:脂肪;chymosin:凝乳酶;acetic acid:乙酸;sucrose solution:蔗糖溶液;milk:牛乳。

2.2.2 TEM鑒定比較優(yōu)化后4種方法提取乳源外泌體的形態(tài)

分別對優(yōu)化后4種方法提取的乳源外泌體進(jìn)行TEM鑒定,通過對圖像結(jié)果觀察對比,如圖5所示,優(yōu)化后4種方法提取的乳源外泌體均具有外形呈圓形、有部分凹陷樣似“茶托”形結(jié)構(gòu),表面光滑,背景雜質(zhì)少,粒徑均在30～200 nm,乙酸法提取的乳源外泌體鏡下視野密度高達(dá)80%以上,蔗糖密度梯度離心法提取的乳源外泌體鏡下視野密度可達(dá)50%左右,凝乳酶法提取的乳源外泌體鏡下視野密度可達(dá)20%左右,差速超速離心法提取的乳源外泌體鏡下視野密度可達(dá)5%左右。因此,優(yōu)化后乙酸法提取的乳源外泌體含量最高。

圖5 優(yōu)化后4種方法提取奶牛乳源外泌體形態(tài)和密度對比圖

2.2.3 NTA鑒定比較優(yōu)化后4種方法提取乳源外泌體的大小

分別對優(yōu)化后4種方法提取的乳源外泌體進(jìn)行NTA鑒定,通過對圖像結(jié)果觀察對比,如圖6所示,優(yōu)化后4種方法提取的乳源外泌體粒徑均在30～200 nm,符合外泌體粒徑范圍。

該圖表示不同優(yōu)化方法的不同倍比稀釋后的峰值濃度。

通過對NTA鑒定結(jié)果對比,如表2所示,優(yōu)化后差速超速離心法提取的乳源外泌體粒徑大小為(144.1±48.2) nm;優(yōu)化后凝乳酶法提取的乳源外泌體粒徑大小為(143.9±56.9) nm;優(yōu)化后乙酸法提取的乳源外泌體粒徑大小為(151.0±47.2) nm;優(yōu)化后蔗糖密度梯度離心法提取的乳源外泌體粒徑大小為(155.0±49.9) nm。優(yōu)化后乙酸法提取的乳源外泌體粒子濃度最高,其次是優(yōu)化后蔗糖密度梯度離心法提取的乳源外泌體,最后是優(yōu)化后凝乳酶法提取的乳源外泌體,均高于優(yōu)化后差速超速離心法提取的乳源外泌體粒子濃度。因此,優(yōu)化后乙酸法提取的乳源外泌體含量最高。

表2 優(yōu)化后4種方法提取奶牛乳源外泌體粒徑、粒子濃度和粒徑峰值對比結(jié)果

2.2.4 BCA蛋白濃度測定鑒定比較優(yōu)化后4種方法提取的乳源外泌體的濃度

因BCA蛋白濃度檢測的非純外泌體濃度,所以分別對優(yōu)化后4種方法提取的乳源外泌體樣品進(jìn)行BCA蛋白濃度測定,標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=2.342 8x-0.198 8(x:樣品蛋白濃度,mg/mL;y:樣品吸光度值),r2=0.989 5。如表3所示,優(yōu)化后乙酸法提取的乳源外泌體樣品蛋白濃度最低,顯著低于優(yōu)化后差速超速離心法提取的乳源外泌體樣品蛋白濃度(P<0.05),其次是優(yōu)化后蔗糖密度梯度離心法提取的乳源外泌體,最后是優(yōu)化后凝乳酶法提取的乳源外泌體,均低于優(yōu)化后差速超速離心法提取的乳源外泌體樣品蛋白濃度。根據(jù)TEM方法和NTA濃度結(jié)果,可對比得出乙酸法提取得到的乳源外泌體雜蛋白含量少且純度高。

表3 優(yōu)化后4種方法提取奶牛的乳源外泌體樣品蛋白濃度對比結(jié)果

2.2.5 WB鑒定比較優(yōu)化后4種方法提取的乳源外泌體特異性蛋白表達(dá)量

外泌體表面和內(nèi)部有許多特異性標(biāo)記蛋白,如HSP70、TSG101、CD9、CD81等,而HSP70是外泌體位于胞漿內(nèi)的蛋白,因WB可特異性測定乳源外泌體表面及內(nèi)部蛋白表達(dá)量,所以分別對優(yōu)化后4種方法提取的乳源外泌體進(jìn)行鑒定,如圖7所示,優(yōu)化后乙酸法提取到的乳源外泌體可明顯表達(dá)表面及內(nèi)部特異性標(biāo)記蛋白CD81、CD9、TSG101和HSP70,而其他3種優(yōu)化后方法均有不同程度表面及內(nèi)部蛋白標(biāo)記物損傷。因此,優(yōu)化后乙酸法提取的乳源外泌體含量最高,且可用于轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等進(jìn)一步試驗。

TSG101:腫瘤易感基因101 tumor susceptibility gene 101;HSP70:熱休克蛋白70 heat shock protein 70。

分別對優(yōu)化后4種方法提取的乳源外泌體WB條帶灰度值進(jìn)行對比,如表4所示,優(yōu)化后乙酸法提取的乳源外泌體WB條帶灰度值顯著高于其他3種方法(P<0.05),其次是優(yōu)化后蔗糖密度梯度離心法提取的乳源外泌體,WB條帶灰度值高于優(yōu)化后凝乳酶法和優(yōu)化后差速超速離心法。

表4 優(yōu)化后4種方法提取的乳源外泌體WB條帶灰度值比較結(jié)果

2.2.6 WB法鑒定篩選優(yōu)化后乙酸法最優(yōu)乙酸添加量

將優(yōu)化后4種方法進(jìn)行對比后發(fā)現(xiàn),優(yōu)化后乙酸法提取的乳源外泌體含量最高,通過WB方法檢測外泌體特異性表面蛋白CD81和內(nèi)部蛋白HSP70,根據(jù)蛋白表達(dá)水平篩選優(yōu)化后乙酸法的最佳乙酸添加量,如圖8所示,每毫升乳中添加4 L乙酸(pH 5.0)時蛋白表達(dá)量最高,且外泌體內(nèi)部蛋白HSP70未受損傷。HSP70是外泌體內(nèi)部蛋白,位于胞漿內(nèi),應(yīng)激下可進(jìn)入核,并包圍核仁,具有與核苷酸結(jié)合的特性,表明外泌體內(nèi)部及核糖體未受乙酸的損傷,可用于進(jìn)一步的核酸試驗。

HSP70:熱休克蛋白70 heat shock protein 70。

分別對優(yōu)化后乙酸法不同乙酸添加量提取的乳源外泌體WB條帶灰度值對比,如表5所示,每毫升乳中添加4 μL乙酸至乳的pH為5.0時提取的外泌體含量最高,其次是每毫升乳添加8 μL乙酸至乳的pH為4.6時提取的外泌體,最后是每毫升乳添加12 μL乙酸至乳pH為4.3時提取的外泌體,均比每毫升乳添加20 μL乙酸至乳pH為4.0時提取的外泌體含量高。因此,每毫升乳添加4 μL乙酸至乳pH為5.0時提取的外泌體含量高且穩(wěn)定。

表5 優(yōu)化后乙酸法不同乙酸添加量提取的乳源外泌體WB條帶灰度值比較結(jié)果

3 討 論

近幾年國內(nèi)外學(xué)者不斷發(fā)現(xiàn)乳源外泌體可作為載體,通過靶向傳遞生物大分子、核酸、基因、藥物等,達(dá)到抵抗炎癥、治療腫瘤、制作疫苗、疾病診斷等功效,極具醫(yī)學(xué)潛力及應(yīng)用價值,所以研究乳源外泌體的提取就成為重中之重。

牛奶中含有大量蛋白質(zhì)、脂肪和酪蛋白等化合物,提取乳源外泌體有難度。本試驗根據(jù)前人已建立的差速超速離心法、凝乳酶法、乙酸法和蔗糖密度梯度離心法,通過不斷優(yōu)化和改進(jìn),可有效除去乳中化合物,精簡乳源外泌體的提取方法的步驟。根據(jù)國際外囊泡學(xué)會發(fā)布的鑒定標(biāo)準(zhǔn),對優(yōu)化前和優(yōu)化后4種方法提取到的乳源外泌體進(jìn)行鑒定及比較。Yamauchi等[21]通過加入鹽酸進(jìn)行等電點(diǎn)沉淀,發(fā)現(xiàn)提取的乳源外泌體表面粗糙,受到酸性條件的損傷,而本試驗優(yōu)化后乙酸法提取得到乳源外泌體,通過TEM和NTA觀察,發(fā)現(xiàn)該外泌體數(shù)量和粒子濃度都高于其他3種方法,而且在酸性條件下,形態(tài)也未遭受破壞。Rahman等[22]研究發(fā)現(xiàn),加入乙酸進(jìn)行等電點(diǎn)沉淀,提取乳源外泌體粒子濃度高于超速離心法和加入鹽酸等電點(diǎn)沉淀法提取效果,與本試驗研究結(jié)果具有相似性。研究同時發(fā)現(xiàn),在酸性條件下,外泌體表面及內(nèi)部特異性標(biāo)記蛋白的表達(dá)易受損傷,而本試驗優(yōu)化后乙酸法提取的乳源外泌體表面及內(nèi)部特異性標(biāo)記蛋白均未受到破壞,可見添加乙酸至乳pH為5.0時可有效保護(hù)外泌體內(nèi)部結(jié)構(gòu)。綜上所述,本試驗優(yōu)化的乙酸外泌體提取方法可有效除去乳中酪蛋白及其他化合物,提高外泌體純度及濃度,保持形態(tài)結(jié)構(gòu)完整性,同時可減少提取步驟及時間,具有一定的應(yīng)用價值。

4 結(jié) 論

本試驗通過增加離心速度,改變乙酸或凝乳酶用量、調(diào)整蔗糖密度梯度,減少離心步驟成功優(yōu)化了4種乳源外泌體提取方法,優(yōu)化的奶牛乳源外泌體乙酸提取法在減少提取步驟和時間的基礎(chǔ)上,可獲得純度高、特異性標(biāo)記蛋白不易降解的優(yōu)質(zhì)外泌體。研究結(jié)果為乳源外泌體大量制備和工業(yè)化生產(chǎn)奠定方法基礎(chǔ)。