過表達(dá)CASP1誘導(dǎo)人急性髓系白血病細(xì)胞THP-1的G0/G1細(xì)胞周期阻滯和NLRP3炎性小體介導(dǎo)的焦亡

艾克拜爾·阿布都熱衣木, 徐 麗, 阿孜古麗·麥麥提,阿依姆妮薩·阿卜杜熱合曼, 帕提古力·蘇力坦

(新疆維吾爾自治區(qū)喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院血液內(nèi)科, 新疆 喀什 844000)

人急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)細(xì)胞的增殖被異常激活且細(xì)胞凋亡被抑制,在體內(nèi)呈現(xiàn)生長不受控制的爆發(fā)性生長[1]。目前,化療、放療、免疫治療和造血干細(xì)胞移植是治療AML的主要手段[2],但是AML患者的總體生存率仍然不令人滿意,迫切需要新的治療策略[3-4],然而,對于AML發(fā)生機(jī)制的研究仍處于初步階段。炎性小體是參與先天免疫反應(yīng)的胞質(zhì)多蛋白復(fù)合物。含有半胱天冬酶1(Caspase1,CASP1)、NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(Nod-like receptor heat protein domain associated protein 3,NLRP3)、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白((apoptosis-associated speck-like protein,ASC)的NLRP3炎性小體是表征最好的炎性小體之一。盡管NLRP3炎性小體激活的確切機(jī)制仍在研究中,然而,目前認(rèn)為NLRP3炎性小體的形成導(dǎo)致CASP1激活形成cleaved-CASP1,隨后將促炎細(xì)胞因子IL-1β或IL-18轉(zhuǎn)化為成熟的生物活性形式[5]。成熟的IL-1β或IL-18隨后被釋放到細(xì)胞外[5]。另外,CASP1的抑制劑VX765被證明可以促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖并抑制細(xì)胞CASP1/Gasdermin D介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡(pyroptosis)。這些特征均指向CASP1激活可能促進(jìn)了細(xì)胞焦亡。然而,目前尚不清楚CASP1是否調(diào)控AML細(xì)胞的焦亡。本文研究過表達(dá)CASP1對AML THP-1細(xì)胞焦亡和細(xì)胞周期阻滯的影響,并探討過表達(dá)CASP1誘導(dǎo)AML THP-1細(xì)胞焦亡的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1試劑與耗材:人急性髓系白血病原代細(xì)胞THP-1購于于中國科學(xué)院上海生物科學(xué)研究所。RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清均購于美國Gibco公司。CASP1過表達(dá)載體(pcDNA3.1-CASP1)和陰性對照(pcDNA3.1-null)構(gòu)建于美國Invitrogen公司。Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于上海碧云天生物科技有限公司。細(xì)胞周期檢測試劑盒購于美國伯樂公司。TRIzol蛋白提取試劑、BCA蛋白測定試劑、超級信號PLUS化學(xué)發(fā)光底物均購于北京天根生物科技有限公司。細(xì)胞活性氧檢測試劑盒和兔抗人增殖相關(guān)蛋白Ki67、兔抗人增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA),兔抗人細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)、兔抗人NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(Nod-like receptor heat protein domain associated protein 3,NLRP3)、兔抗人凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白((apoptosis-associated speck-like protein,ASC)、兔抗人CASP1、兔抗人切割半胱天冬酶1(cleaved-caspase 1,cleaved-CASP1)、兔抗人白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β,兔抗人IL-18、兔抗人cleaved-Gasdermin D,兔抗人磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase,GAPDH)的一抗購于英國Abcam公司。聚偏二氟乙烯膜購于上海碧云天生物科技有限公司。ABI7900快速實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(美國卡爾斯巴德應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)SYBR Green PCR主混合物(上海碧云天生物科技有限公司)

1.2方 法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng):THP-1在添加了10% (v/v)胎牛血清和1% (v/v)青霉素/鏈霉素的RPMI-1640中培養(yǎng),培養(yǎng)箱環(huán)境為37℃和5% (v/v) CO2。待細(xì)胞生長到對數(shù)生長期用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染和后續(xù)檢測實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組 用24孔板接種對數(shù)生長期的細(xì)胞(2×105個(gè)/孔),待細(xì)胞生長到融合度達(dá)到90%時(shí),根據(jù)Invitrogen公司轉(zhuǎn)染試劑盒的說明方法,更換為500μL的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基,培養(yǎng)基中含10μL Lipofectamine 3000和0.8μg的pcDNA3.1-CASP1,孵育細(xì)胞24h,將該處理命名為pcDNA3.1-CASP1組。使用含10μL Lipofectamine 3000和0.8μg的pcDNA3.1-null的RPMI-1640培養(yǎng)基孵育細(xì)胞24h作為pcDNA3.1-null組。另外,用24孔板接種對數(shù)生長期的細(xì)胞(2×105個(gè)/孔),待細(xì)胞生長到融合度達(dá)到90%時(shí)更換為500μL的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h作為對照組。最后收集對照組、pcDNA3.1-null組、pcDNA3.1-CASP1組的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn):各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌兩次,1000 rpm離心10min。細(xì)胞濃度通過血球計(jì)計(jì)數(shù)檢測。細(xì)胞在96孔板中以5×104細(xì)胞/孔立即接種,根據(jù)CCK-8試劑盒提供的說明加入10μL CCK-8試劑孵育4h,在490nm處讀取吸光度。

1.2.4細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn):細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中各組細(xì)胞以每孔1×106個(gè)細(xì)胞接種在24孔板中。根據(jù)試劑盒提供的說明用Annexin V對細(xì)胞進(jìn)行染色,孵育10min后,并在PI緩沖液中重懸。然后用流式細(xì)胞術(shù)(FACSCantoTMⅡ)對其進(jìn)行分析,并檢測其熒光強(qiáng)度。數(shù)據(jù)分析使用FlowJo軟件分析凋亡細(xì)胞的比例。

1.2.5細(xì)胞周期分析:各組細(xì)胞以1×106的密度接種于24孔板中過夜。在2000rpm下離心5min,在冷PBS中洗滌2次,在75% (v/v)的冷液中重懸。按照碘化丙啶細(xì)胞周期染色方案進(jìn)行細(xì)胞周期分析。采用FACSCantoTMⅡ檢測DNA含量。使用FCS Express 7 Flow軟件程序分析數(shù)據(jù)。

1.2.6Western blot收集各組細(xì)胞,使用TRIzol提取試劑分離細(xì)胞中全蛋白裂解物。使用BCA蛋白測定試劑檢測蛋白濃度。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離50μg的細(xì)胞總蛋白,并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜。在4℃下孵育封閉液封閉聚偏二氟乙烯膜,隨后用針對Ki67(1∶500)、PCNA(1∶1000)、cyclin D1(1∶1000)、NLRP3(1∶800)、ASC(1∶800)、cleaved-CASP1(1∶500)、IL-1β(1∶600),IL-18(1∶800)、cleaved-Gasdermin D(1∶1200)的一抗在4℃下孵育過夜,然后加入辣根過氧化酶偶聯(lián)的二抗(1∶5000)。內(nèi)參蛋白為GAPDH(1∶10000),使用SuperSignal West Pico PLUS化學(xué)發(fā)光底物,檢測感興趣的蛋白,并使用Invitrogen iBright FL1000成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察。

1.2.7實(shí)時(shí)定量PCR (qRT-PCR):使用Trizol試劑(美國Invitrogen公司)從各組細(xì)胞中提取總RNA。并將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA,并在ABI 7900快速實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上使用SYBR Green PCR試劑進(jìn)行qRT-PCR。使用U6作為內(nèi)參基因。然后用2-ΔΔCT方法計(jì)算相對表達(dá)水平。引物(5′～ 3′)序列如下:caspase-1正向ATCCGTTCCATGGGTGAAGGTACA,caspase-1反向CAAATGCCTCCAGCTCTGTAATCA;IL-18正向GCTTGAATCTAAATTATCAGTC;IL-18反向GAAGATTCAAATTGCATCTTAT;IL-1β正向TGCAGTTCACAGAGCAGACC,IL-1β反向GACCGGAAACCTCATGGAG;GAPDH正向GACATTGTTGCCATCAACGACC,GAPDH反向CCCGTTGATGACCAGCTTCC。

2 結(jié) 果

2.1過表達(dá)CASP1對THP-1細(xì)胞增殖的影響:與對照組比,pcDNA3.1-null組的細(xì)胞增殖活力變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而且Ki67和PCNA的相對表達(dá)水平變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。與對照組比,pcDNA3.1-CASP1組的細(xì)胞的增殖活力減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),Ki67和PCNA的相對表達(dá)水平減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。與pcDNA3.1-null組比,pcDNA3.1-CASP1組細(xì)胞的增殖活力減少,Ki67和PCNA的相對表達(dá)水平減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1A～1D。

圖1 過表達(dá)CASP1對THP-1細(xì)胞增殖的影響

2.2過表達(dá)CASP1對THP-1細(xì)胞凋亡的影響:與對照組比,pcDNA3.1-null組的細(xì)胞凋亡率變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對照組比,pcDNA3.1-CASP1組的細(xì)胞凋亡率增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與pcDNA3.1-null組比,pcDNA3.1-CASP1組的細(xì)胞凋亡率增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 用流式細(xì)胞術(shù)檢測過表達(dá)CASP1對THP-1細(xì)胞凋亡的影響

2.3過表達(dá)CASP1對THP-1細(xì)胞周期的影響:與對照組比,pcDNA3.1-null組的細(xì)胞周期變化均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且cyclin D1的相對表達(dá)水平變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對照組比,pcDNA3.1-CASP1組的G0/G1細(xì)胞周期被阻滯,cyclin D1的相對表達(dá)水平(對照組:1.00±0.12 vs.pcDNA3.1-CASP1組:0.52±0.08)減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。與pcDNA3.1-null組比,pcDNA3.1-CASP1組的G0/G1細(xì)胞周期被阻滯,cyclin D1的相對表達(dá)水平減少(pcDNA3.1-null組:0.97±0.05 vs.pcDNA3.1-CASP1組:0.52±0.08),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3和表1。

表1 cyclin D1的相對表達(dá)水平

圖3 用流式細(xì)胞術(shù)檢測過表達(dá)CASP1對THP-1細(xì)胞周期進(jìn)程的影響

2.4過表達(dá)CASP1對THP-1細(xì)胞中炎癥小體的影響:與對照組比,pcDNA3.1-null組的NLRP3、ASC、cleaved-CASP1的相對表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。與對照組比,pcDNA3.1-CASP1組的NLRP3、ASC、cleaved-CASP1的相對表達(dá)水平均增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。與pcDNA3.1-null組比,pcDNA3.1-CASP1組的NLRP3、ASC、cleaved-CASP1的相對表達(dá)水平均增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見圖4和表2。

表2 NLRP3 ASC cleaved-CASP1 CASP1的相對表達(dá)水平

圖4 Western blot法檢測各組NLRP3、ASC、cleaved-CASP1、CASP1表達(dá)所得到的條帶圖

2.5過表達(dá)CASP1對THP-1細(xì)胞中CASP1、IL-1β,IL-18 mRNA水平的影響:與對照組比,pcDNA3.1-null組的CASP1、IL-1β,IL-18的相對mRNA水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。與對照組比,pcDNA3.1-CASP1組的CASP1、IL-1β,IL-18的相對mRNA水平均增加(均P<0.05)。與pcDNA3.1-null組比,pcDNA3.1-CASP1組的CASP1、IL-1β,IL-18的相對mRNA表達(dá)水平均增加(均P<0.05)。見表3。

表3 CASP1 IL-1β IL-18的相對mRNA

2.6過表達(dá)CASP1對THP-1細(xì)胞焦亡的影響:與對照組比,pcDNA3.1-null組的IL-1β,IL-18、cleaved-Gasdermin D(30 kDa)的相對表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。與對照組比,pcDNA3.1-CASP1組的IL-1β,IL-18、cleaved-Gasdermin D(30 kDa)的相對表達(dá)水平均增加(均P<0.05)。與pcDNA3.1-null組比,pcDNA3.1-CASP1組的IL-1β,IL-18、cleaved-Gasdermin D(30 kDa)的相對表達(dá)水平均增加(均P<0.05)。見圖5和表4。

表4 IL-1β IL-18 cleaved-Gasdermin D的相對表達(dá)水平

圖5 Western blot法檢測各組IL-1β,IL-18、cleaved-Gasdermin D表達(dá)所得到的條帶圖

3 討 論

AML是人類最常見的惡性腫瘤,尤其是兒童和年輕人[6]。此外,在20歲以下人群中,白血病造成的死亡人數(shù)超過任何其他癌癥。AML的特點(diǎn)是抑制細(xì)胞的凋亡和促進(jìn)細(xì)胞的增殖,因此近年來,AML的治療目標(biāo)是促進(jìn)白血病細(xì)胞凋亡和抗白血病細(xì)胞增殖[7]。先前的研究表明,炎性或病毒感染誘導(dǎo)的炎性小體會導(dǎo)致大多數(shù)階段的癌癥發(fā)展,并引起細(xì)胞焦亡。而最近的研究也表明,細(xì)胞焦亡同樣在白血病中扮演重要角色[8]。然而,促進(jìn)細(xì)胞焦亡以阻止AML細(xì)胞增殖或生長的研究報(bào)道仍然較少。CASP1是半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶家族的成員,與細(xì)胞凋亡過程密切相關(guān)。CASP1及其激活劑NLRP3是炎癥小體的核心成分,CASP1能被NLRP3和ASC所招募從而激活NLRP3炎癥小體,研究表明,CASP1在白血病中的過表達(dá)可導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素耐藥[6]。此外,CASP1的遺傳變異與慢性淋巴細(xì)胞白血病的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。然而,到目前為止,CASP1對AML的調(diào)控作用和機(jī)制尚不清楚。因此,本研究探討了CASP1對THP-1細(xì)胞行為的調(diào)控作用和潛在機(jī)制。通過在THP-1中過表達(dá)CASP1可明確觀察CASP1對AML的調(diào)控作用并探討可能存在的機(jī)制,特別是可以深入探討NLRP3炎癥小體激活后THP-1細(xì)胞的細(xì)胞行為學(xué)變化和潛在機(jī)制。本研究結(jié)果表明,過表達(dá)CASP1通過激活NLRP3炎癥小體促進(jìn)了THP-1細(xì)胞的周期阻滯和細(xì)胞焦亡。

細(xì)胞焦亡的典型途徑中,炎性小體和前CASP1通過ASC與炎性復(fù)合體結(jié)合,然后激活CASP1。CASP1參與IL-1β與IL-18的激活和Gasdermin D的裂解。然后,GSDMD的N端片段易位到細(xì)胞膜上,引起細(xì)胞腫脹和孔形成,導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)流出,導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂。從而導(dǎo)致細(xì)胞焦亡。因此,腫瘤細(xì)胞的焦亡可以阻止腫瘤細(xì)胞增殖[9]。Liu等[6]發(fā)現(xiàn)CASP1的mRNA表達(dá)水平在白血病細(xì)胞系中升高,并且認(rèn)為CASP1可能參與了AML的發(fā)病機(jī)制,該報(bào)道把CASP1作為預(yù)測AML預(yù)后的因素和AML患者的治療靶點(diǎn)。在我們的研究中,過表達(dá)CASP1明顯促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡活性并抑制了細(xì)胞的增殖活力,Xu等[9]也發(fā)現(xiàn)CASP1過表達(dá)可以通過激活細(xì)胞焦亡從而抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果提示了CASP1可能介導(dǎo)了細(xì)胞焦亡從而在AML細(xì)胞的惡性進(jìn)展中扮演著重要作用。

研究表明,細(xì)胞焦亡發(fā)生時(shí),Gasdermin D(53 kDa)被切割,產(chǎn)生30 kDa左右的片段cleaved-Gasdermin D[10]。另外,IL-1β和IL-18則會被大量釋放到細(xì)胞中,參與Gasdermin D的切割和細(xì)胞腫脹和孔的形成[11]。為了進(jìn)一步研究CASP1是否通過激活細(xì)胞焦亡從而扮演了抑制AML細(xì)胞增殖的作用,本研究檢測CASP1過表達(dá)后THP-1細(xì)胞中CASP1、IL-1β、IL-18、cleaved-Gasdermin D的表達(dá),結(jié)果顯示,CASP1過表達(dá)可以明顯促進(jìn)CASP1、IL-1β、IL-18、cleaved-Gasdermin D的表達(dá)。因此表明,AML細(xì)胞過表達(dá)CASP1促進(jìn)了細(xì)胞焦亡。

細(xì)胞周期的進(jìn)展是由不同的細(xì)胞周期蛋白、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶及其抑制劑調(diào)控的,它們影響核苷酸代謝和DNA復(fù)制。cyclin D1通常有助于加速G1/S期的進(jìn)展。本文數(shù)據(jù)顯示,CASP1過表達(dá)抑制了近50%的cyclin D1表達(dá),減少S期細(xì)胞數(shù)量,增加G0/G1期細(xì)胞數(shù)量,提示了THP-1中的CASP1過表達(dá)可以形成G0/G1阻滯,從而抑制THP-1細(xì)胞的增殖。

綜上所述,本研究初步探討了過表達(dá)CASP1誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞中炎癥小體并激活焦亡相關(guān)的信號通路。本研究數(shù)據(jù)表明,CASP1可以通過細(xì)胞周期阻滯和焦亡途徑抑制THP-1細(xì)胞的細(xì)胞增殖。我們的研究為CASP1作為AML治療靶點(diǎn)提供了新的見解。