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    中草藥靈丹草抗弧菌及其用于發(fā)酵飼料添加劑的研究

    2020-12-31 08:50:18戴祥宇李相安何增國
    山東畜牧獸醫(yī) 2020年12期
    關(guān)鍵詞:靈丹產(chǎn)酶弧菌

    戴祥宇,李相安,何增國

    中草藥靈丹草抗弧菌及其用于發(fā)酵飼料添加劑的研究

    戴祥宇1,李相安2*,何增國3

    (1.復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海 200000 ;2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海都學(xué)院生物科技系,山東 萊陽;3.青島海洋生物醫(yī)藥研究院海洋微生物工程研發(fā)中心,山東 青島)

    通過篩選產(chǎn)酶有益微生物菌株,對(duì)藥用植物靈丹草進(jìn)行發(fā)酵,并進(jìn)行了發(fā)酵條件的摸索和優(yōu)化。結(jié)果表明,從9種不同產(chǎn)地的靈丹草中篩選出了對(duì)弧菌抑制效果較好的樣品,對(duì)副溶血弧菌、溶藻弧菌、霍亂弧菌的最低抑菌濃度(MIC)均為0.133 g/ml。篩選出了一株枯草芽孢桿菌和一株地衣芽孢桿菌作為產(chǎn)酶發(fā)酵菌株,可使對(duì)副溶血弧菌的最低抑菌濃度降低50 %。驗(yàn)證了靈丹草對(duì)斑馬魚的安全性,以及抗弧菌的初步應(yīng)用效果。

    中草藥;靈丹草;發(fā)酵;弧菌

    中草藥富含豐富的營養(yǎng)成分及藥用成分,如:有機(jī)酸類、酶、多糖等。然而由于植物細(xì)胞壁的阻礙作用,有效成分難以釋放出來。傳統(tǒng)炮制加工技術(shù)并不能使有效成分充分釋出,而微生物豐富的酶系統(tǒng)使之成為可能。微生物發(fā)酵過程中產(chǎn)生的各種酶類不僅能降解難溶的木質(zhì)素、纖維素、半纖維素等基質(zhì),還能將藥用植物中難利用的大分子物質(zhì)分解成小分子物質(zhì)。

    靈丹草Laggera pterodonta(DC.)Benth.為菊科六棱菊屬,又名臭靈丹,主要分布于我國的長江流域以南及西南部。該草藥的民間應(yīng)用廣泛,主要用在治療上呼吸道感染、扁桃體炎、咽喉炎、支氣管炎、瘧疾等病。

    本文就靈丹草抗弧菌性能及其作為飼料添加劑進(jìn)行了研究。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 中草藥

    表1 不同產(chǎn)地靈丹草及其代碼

    1.1.2 試驗(yàn)菌種

    表2 指示菌菌種及其染色

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 靈丹草抑菌譜 選用取自昆明、麗江、西雙版納、梅州、亳州、贛州的9種靈丹草,粉碎后過30目篩,烘干,分別取20 g靈丹草粉末,加入150 ml無菌水在121 °C下滅菌20 min,制得0.133 g/ml的藥液,取上清對(duì)表2中的指示菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn),以牛津杯法觀察抑菌圈,測量抑菌圈直徑。

    1.2.2 菌株篩選、鑒定及菌株產(chǎn)酶特性研究 從20份海水、土壤樣品以及其他樣品中分離產(chǎn)酶菌,分別用產(chǎn)酶的平板進(jìn)行初篩和復(fù)篩,選出產(chǎn)酶性能高的菌株,進(jìn)行鑒定,及菌種的溶血性測定。將所選菌株活化后,用移液器取10 μl菌液滴到血瓊脂平板上,在37 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜,觀察菌落生長情況和溶血圈大小。

    1.2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化 將靈丹草用粉碎機(jī)粉碎后,過30目篩待用。將發(fā)酵液上清做抑菌實(shí)驗(yàn),以副溶血弧菌作為指示菌,以牛津杯法觀察抑菌圈。(1)靈丹草對(duì)發(fā)酵菌種抑制作用試驗(yàn):在500 ml錐形瓶中分別加入5 g、10 g、15 g、20 g、30 g靈丹草粉末,加入150 ml無菌水在121 °C下滅菌20 min。分別將10 μl藥液涂在3種產(chǎn)酶菌的平板上,觀察是否有抑菌圈。(2)菌液添加量試驗(yàn):在500 ml錐形瓶中分別加入20 g靈丹草粉末,加入150 ml無菌水在121 °C下滅菌20 min。分別加入10 ml、20 ml、30 ml的B.subtilis LS7菌液,發(fā)酵96 h。用發(fā)酵液上清進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。(3)中草藥添加量試驗(yàn):在500 ml錐形瓶中分別加入10 g、15 g、20 g、25 g靈丹草粉末,加入150 ml無菌水分別在121°C下滅菌20 min。加入20 ml的菌液發(fā)酵72 h。用發(fā)酵液上清進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。(4)pH穩(wěn)定性試驗(yàn):將滅菌的靈丹草調(diào)至pH5,pH7和pH9,分別發(fā)酵。用發(fā)酵液上清進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。(5)發(fā)酵前后活性對(duì)比:在500 ml錐形瓶中分別加入20 g靈丹草粉末,加入150 ml無菌水在121 °C下滅菌20 min,加入20 ml菌液;將滅菌后的靈丹草加入170 ml無菌水作為對(duì)照,共同發(fā)酵72 h。發(fā)酵完成后取上清離心過濾,文火煎至100 ml,得到0.2 g/ml的靈丹草藥液,用二倍稀釋法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

    1.2.4 動(dòng)物試驗(yàn) (1)動(dòng)物安全試驗(yàn):分別取靈丹草滅菌后和發(fā)酵72 h后的藥液,稀釋到0.2 g?ml-1、0.1 g?ml-1、0.05 g?ml-1,浸泡飼料投喂斑馬魚,以正常飼料投喂的斑馬魚作為對(duì)照。添加量約為每缸150 μl,每缸10條,三組平行,觀察15 d后斑馬魚的生長狀態(tài)和存活情況。(2)動(dòng)物功效試驗(yàn):分別將魚缸里加入1 ml弧菌培養(yǎng)液使水中弧菌濃度在1 000 CFU/ml左右,分別以發(fā)酵前、發(fā)酵后不同濃度的靈丹草處理飼料飼喂斑馬魚。每缸10條,3組平行,15 d后測量水中弧菌數(shù)量的變化,生長狀態(tài)、體重變化及存活情況。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 靈丹草抑菌活性篩選

    從表3可以看出,K1、K3、K4、X1樣品對(duì)于三種病原弧菌都有明顯的抑制租用。其中K4樣品最為明顯。

    表3 不同產(chǎn)地靈丹草的抑菌圈直徑 (mm)

    注:NA: 無抑菌效果或抑菌圈小于8mm

    測試K4的抑菌譜,結(jié)果如表4,發(fā)現(xiàn)其除對(duì)弧菌有抑制作用外,對(duì)金黃色葡萄球菌也有抑制作用。

    表4 K4樣品靈丹草最低抑菌濃度

    2.2 發(fā)酵菌種篩選

    從20份海水、土壤樣品以及其他樣品中,一共分離得到了86株菌,初篩得到25株菌,復(fù)篩得到3株產(chǎn)酶性較高的菌株。分別為枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌。3種均為益生菌,在國家農(nóng)業(yè)部可允許添加的飼料菌種目錄中,且均無溶血性。產(chǎn)酶特性如表5:

    表5 產(chǎn)酶菌的產(chǎn)酶直徑比

    注:表中數(shù)值為菌液在產(chǎn)酶篩選培養(yǎng)基上點(diǎn)10 μl培養(yǎng)24 h的透明圈直徑與菌落直徑比

    2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

    2.3.1 靈丹草對(duì)發(fā)酵菌種抑制作用 在500 ml錐形瓶中分別加入5 g、10 g、15 g、20 g、30 g靈丹草粉末,加入150 ml無菌水在121°C下滅菌20 min。分別將10 μl藥液涂在3種產(chǎn)酶菌的平板上,觀察是否有抑菌圈。如表6,B. subtilis LS7對(duì)于靈丹草藥液耐受濃度較高,可用于發(fā)酵。

    表6 靈丹草對(duì)發(fā)酵菌種的抑制試驗(yàn)

    注:+為有抑菌圈;-為沒有抑菌圈

    2.3.2 菌液添加量試驗(yàn) 菌落變化見表7。雖然發(fā)酵液在發(fā)酵48 h時(shí)菌活數(shù)達(dá)到最大,但發(fā)酵72 h的發(fā)酵液上清比發(fā)酵48 h的發(fā)酵液上清抑菌圈大,說明菌產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物復(fù)合酶需要一定的時(shí)間。

    表7 發(fā)酵過程中的菌落變化及抑菌效果

    2.3.3 中草藥添加量 抑菌結(jié)果見表8,得到20 g發(fā)酵組抑菌效果最好;25 g添加組可能過于粘稠,不利于液體發(fā)酵。

    表8 不同靈丹草添加量發(fā)酵的抑菌效果

    2.3.4 pH穩(wěn)定性 不調(diào)節(jié)pH發(fā)酵時(shí),發(fā)酵液始終保持在5.5左右。3種pH發(fā)酵組抑菌圈結(jié)果相同,證明pH對(duì)發(fā)酵影響不大。

    2.3.5 發(fā)酵前后活性對(duì)比 發(fā)酵前最低抑菌濃度(MIC)為0.1 g/ml,發(fā)酵后的最低抑菌濃度為0.05 g/ml,抑菌效果提升一倍。

    2.4 動(dòng)物試驗(yàn)

    2.4.1 動(dòng)物安全性 15 d后斑馬魚的生長狀態(tài)和存活情況見表9和表10。斑馬魚的生長狀態(tài)和存活情況均為良好,無呆滯、厭食或者死亡現(xiàn)象。

    表9 未發(fā)酵靈丹草安全性

    表10 發(fā)酵后靈丹草安全性

    2.4.2 動(dòng)物功效性 在魚缸里加入1 ml弧菌培養(yǎng)液使水中弧菌濃度在1 000 CFU/ml左右之后,記錄斑馬魚的存活數(shù)量(見表11)。在有靈丹草的情況下,斑馬魚的成活率高于不添加靈丹草。濃度高的實(shí)驗(yàn)組存活率高于濃度低的實(shí)驗(yàn)組。添加發(fā)酵靈丹草的斑馬魚存活率高于添加未發(fā)酵靈丹草的斑馬魚7 %。

    表11 動(dòng)物功效試驗(yàn)

    3 結(jié)論

    本研究從9種不同產(chǎn)地的靈丹草中篩選出了對(duì)弧菌抑制效果較好靈丹草樣品;篩選出了產(chǎn)酶效果良好的一株枯草芽孢桿菌,對(duì)藥用植物靈丹草進(jìn)行了發(fā)酵,使靈丹草有效成分充分釋放,使對(duì)副溶血弧菌的最低抑菌濃度降低了50 %。同時(shí)與所用生產(chǎn)菌一起,形成復(fù)合微生物添加劑,在斑馬魚上驗(yàn)證了靈丹草的安全性,以及抗弧菌的初步應(yīng)用效果。這也為后續(xù)在水產(chǎn)業(yè)中取得應(yīng)用,抑制弧菌,用于替代抗生素的使用,減少耐藥菌的產(chǎn)生,并為減少抗生素在水產(chǎn)中的殘留打下基礎(chǔ)。

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    (2020–10–02)

    S853.92

    A

    1007-1733(2020)12-0011-03

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