柚皮苷通過抑制ERK1/2活化和DRP1表達(dá)減輕棕櫚酸處理后脂肪細(xì)胞炎癥

曾文靖,王超文,王 莉,張亞琴,劉阿花,黃起壬

(1.江西省基礎(chǔ)藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室; 2.南昌大學(xué)江西醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院a.藥理學(xué)教研室; b.2020級(jí),南昌 330006)

肥胖是由于機(jī)體能量代謝紊亂和脂肪過度堆積而造成的一種慢性疾病,與動(dòng)脈粥樣硬化、2型糖尿病、高血壓等代謝性疾病的發(fā)病密切相關(guān)[1]。流行病學(xué)調(diào)查[2-3]結(jié)果顯示,肥胖已經(jīng)在全球范圍內(nèi)廣泛流行,成為最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一。脂肪組織不僅調(diào)節(jié)內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng)功能,而且可維持機(jī)體能量代謝,在肥胖發(fā)生發(fā)展過程中扮演著關(guān)鍵角色。大量研究[4-5]表明,肥胖主要的病理機(jī)制與脂肪組織脂質(zhì)代謝異常以及慢性炎癥密切相關(guān)。肥胖狀態(tài)下機(jī)體脂肪組織發(fā)生病理性擴(kuò)張,脂肪細(xì)胞形態(tài)和功能發(fā)生失調(diào),同時(shí)伴有促炎因子大量釋放、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和慢性纖維化等特點(diǎn)[6]。失調(diào)的脂肪細(xì)胞可產(chǎn)生并釋放過量的白細(xì)胞介素-6(IL-6)、IL-1β和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等促炎細(xì)胞因子,進(jìn)一步促進(jìn)脂肪組織炎癥的發(fā)生發(fā)展[7-8]。

柚皮苷(naringin,Nar)是一種來自葡萄柚和柑橘類水果的黃酮糖苷類成分,有多種藥理活性[9-10]。唐亮等[11]研究發(fā)現(xiàn),Nar可影響巨噬細(xì)胞的功能,降低其產(chǎn)生炎癥因子的能力,從而促進(jìn)MC-3T3-E1細(xì)胞的成骨分化。LUO等[12]研究結(jié)果表明Nar可減輕脂多糖誘導(dǎo)的小鼠腸道屏障損傷。多種動(dòng)物模型[13-14]均證明,Nar有抗炎和抗氧化應(yīng)激作用,可以有效減少炎癥反應(yīng)相關(guān)信號(hào)因子的表達(dá),如IL-6、IL-8、誘導(dǎo)一氧化氮合酶(iNOS)、Nrf2和TNF-α。本課題組前期研究[11]顯示,Nar通過激活PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路抑制自噬,進(jìn)而減輕高糖高脂應(yīng)激誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙以及改善高糖高脂誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞胰島素抵抗。本研究以3T3-L1前脂肪細(xì)胞為研究對(duì)象,通過成脂化誘導(dǎo)后研究Nar對(duì)棕櫚酸(PA)處理后成熟脂肪細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響及作用機(jī)制,旨在為臨床上肥胖的治療研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 細(xì)胞株及主要試劑與藥品

3T3-L1前脂肪細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC。胎牛血清(FBS)購(gòu)自天津TBD公司(貨號(hào):TBD11HB);H-DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自北京索萊寶公司(貨號(hào):12100);飽和油紅O染料購(gòu)自北京索萊寶公司(貨號(hào):G1260);動(dòng)力相關(guān)蛋白1(DRP1)抗體(貨號(hào):16443-1-AP)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)抗體(貨號(hào):16443-1-AP)購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司;p-ERK1/2抗體(貨號(hào):AF1015)購(gòu)自Affinity公司;GAPDH抗體(貨號(hào):LS203561)購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司;脂肪酸合酶(FASN)抗體(貨號(hào):10624-2-AP)購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司;過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)抗體(貨號(hào):2443S)購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司;IL-6 ELISA試劑盒(貨號(hào):2H-KMLJ201mm)南京卡米洛生物工程有限公司。柚皮苷(Nar,貨號(hào):100917,純度≥98.0%),線粒體裂變抑制劑Mdivi-1(貨號(hào):HY-15886,純度:99.73 %)購(gòu)自上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司;PA購(gòu)于天津博迪化工股份有限公司。

1.2 主要儀器

超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州蘇凈安泰公司(型號(hào):SW-CJ-1F);680型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Perkinelmer公司(型號(hào):Enspire);CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司(型號(hào):Forma311);熒光倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司(型號(hào):8K43352);垂直電泳-轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司(型號(hào):041BR143676)。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組

3T3-L1細(xì)胞成脂化誘導(dǎo)(處理1)實(shí)驗(yàn)分為2組:誘導(dǎo)前組和誘導(dǎo)后組;PA濃度篩選(處理2)實(shí)驗(yàn)分為不同濃度(0、25、50、100、200 μmol·L-1)PA組;Nar濃度篩選(處理3)實(shí)驗(yàn)分為不同濃度(0、12.5、25、50、100 μmol·L-1)Nar組;單獨(dú)PA處理(處理4)實(shí)驗(yàn)分為2組:Ctrl組、PA組;聯(lián)合Nar處理(處理5)實(shí)驗(yàn)分為4組:Ctrl組、PA組、Nar組、PA+Nar組;聯(lián)合Mdivi-1處理(處理6)實(shí)驗(yàn)為7組:Ctrl組、PA組、Nar組、Mdivi-1組、PA+Nar組、PA+Mdivi-1組、PA+Nar+Mdivi-1組。

2.2 3T3-L1細(xì)胞的成脂化誘導(dǎo)

3T3-L1細(xì)胞成脂化誘導(dǎo)按照文獻(xiàn)[15]方法進(jìn)行:待細(xì)胞長(zhǎng)至鋪滿培養(yǎng)皿底時(shí),將原培養(yǎng)基換成誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅰ(含0.5 mmol·L-1異丁基甲基黃嘌呤、1 μmol·L-1羅格列酮、1 μmol·L-1地塞米松、10 mg·L-1胰島素的H-DMEM溶液)培養(yǎng)2 d;2 d后,將細(xì)胞培養(yǎng)液換成新鮮配制的誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅱ(10 mg·L-1含胰島素的H-DMEM溶液),培養(yǎng)6 d,每?jī)商鞊Q一次新鮮配制的誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅱ。6 d后,再換成10% FBS的H-DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2 d即誘導(dǎo)為成熟脂肪細(xì)胞。

2.3 油紅O染色

細(xì)胞按處理1分組處理后固定液固定20 min,油紅O染料室溫染色30 min,60%異丙醇漂洗細(xì)胞表面,PBS清洗除去殘留的異丙醇,拍照記錄。

2.4 CCK-8實(shí)驗(yàn)

3T3-L1細(xì)胞接種于96孔板成脂化誘導(dǎo)后細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%左右時(shí),細(xì)胞按處理2和3分組進(jìn)行處理,48 h后棄原培養(yǎng)基,避光加入100 μL CCK-8工作液(培養(yǎng)基:CCK-8=9：1),1 h后,酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處各組OD值。

2.5 ELISA實(shí)驗(yàn)

3T3-L1細(xì)胞成脂化誘導(dǎo)后按處理2、5、6分組處理細(xì)胞。ELISA試劑盒和板條室溫復(fù)溫,預(yù)留空白孔。收集細(xì)胞培養(yǎng)基,離心取上清液,按照試劑盒說明書操作,酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處各組OD值,依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算IL-6的濃度。

2.6 Western blotting實(shí)驗(yàn)

3T3-L1細(xì)胞成脂化誘導(dǎo)后按處理1、4、5、6分組處理細(xì)胞后,提取細(xì)胞總蛋白,用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度,并計(jì)算上樣量。10% SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離,冰水浴轉(zhuǎn)膜2 h,5%脫脂牛奶封閉2 h,封閉結(jié)束后將PVDF膜與一抗孵育過夜。次日,室溫條件下孵育二抗2 h。PVDF膜曝光、顯影,Image-Lab軟件進(jìn)行灰度值分析。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad Prism 8.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間比較采用單因素方差分析,2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 3T3-L1前脂肪細(xì)胞成功誘導(dǎo)為成熟脂肪細(xì)胞

Western blotting 實(shí)驗(yàn)顯示誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)成熟脂肪細(xì)胞標(biāo)志蛋白PPARγ和FASN表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05);油紅O染色結(jié)果顯示誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)大量脂滴聚集。見圖1。

A:Western blotting實(shí)驗(yàn)圖;B:2組PPARγ和FASN蛋白相對(duì)表達(dá)比較;C:油紅O染色圖。*P<0.05、 **P<0.001。圖1 3T3-L1前脂肪細(xì)胞成脂化誘導(dǎo)驗(yàn)證

3.2 PA篩選濃度

CCK-8結(jié)果顯示,與0 μmol·L-1PA組比較,25和50 μmol·L-1PA組細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),100和200 μmol·L-1PA組細(xì)胞活力均降低(P<0.05),其中以200 μmol·L-1PA組最明顯(P<0.001)。ELISA結(jié)果顯示,與0 μmol·L-1PA組比較,50和100 μmol·L-1PA組IL-6水平升高(P<0.05),但200 μmol·L-1PA組IL-6水平下降(P<0.001)。見圖2。綜合CCK-8和ELISA結(jié)果,后續(xù)實(shí)驗(yàn) PA選擇50 μmol·L-1。

PA/(μmol·L-1)PA/(μmol·L-1)*P<0.05、ΔP<0.01、#P<0.001、nsP>0.05與0 μmol·L-1 PA組比較。圖2 不同濃度PA對(duì)成熟脂肪細(xì)胞活力和IL-6水平的影響

3.3 PA對(duì)p-ERK1/2和DRP1蛋白表達(dá)的影響

Western blotting 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與Ctrl組比較,PA組DRP1及p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平均顯著增加(P<0.001)。見圖3。

*P<0.001與Ctrl組比較。圖3 PA對(duì)p-ERK1/2和DRP1蛋白表達(dá)的影響

3.4 Nar濃度篩選及對(duì)IL-6、p-ERK1/2和DRP1蛋白表達(dá)的影響

CCK-8結(jié)果顯示,與0 μmol·L-1組比較,12.5和25 μmol·L-1Nar組細(xì)胞活力無顯著差異(P>0.05),50 μmol·L-1Nar組細(xì)胞活力下降(P<0.05),故后續(xù)實(shí)驗(yàn)Nar選擇25 μmol·L-1。ELISA結(jié)果顯示,與Ctrl組比較,PA組IL-6水平升高(P<0.001),Nar組細(xì)胞IL-6水平無顯著差異(P>0.05);與PA組比較,PA+Nar組IL-6水平更低(P<0.001)。Western blotting結(jié)果顯示,與Ctrl組比較,PA組p-ERK1/2和DRP1表達(dá)更高(P<0.001),Nar組p-ERK1/2和DRP1表達(dá)更低(P<0.05);與PA組比較,PA+Nar組p-ERK1/2和DRP1表達(dá)更低(P<0.01)。見圖4。

*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、ns P>0.05與0 μmol·L-1組或Ctrl組比較;#P<0.01、##P<0.001與PA組比較。圖4 Nar對(duì)細(xì)胞活力、IL-6水平、p-ERK1/2和DRP1蛋白表達(dá)的影響

3.5 Mdivi-1對(duì)IL-6水平、p-ERK1/2和DRP1蛋白表達(dá)的影響

ELISA結(jié)果顯示,與Ctrl組比較,Nar組和Mdivi-1組細(xì)胞IL-6水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但PA+Nar組、PA+Mdivi-1組和PA+Nar+Mdivi-1組IL-6水平較PA組均更低(P<0.05),且PA+Nar+Mdivi-1組IL-6水平較PA+Nar組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Western blotting結(jié)果顯示,與Ctrl組比較,Nar組和Mdivi-1組細(xì)胞p-ERK1/2和DRP1表達(dá)均更低(P<0.05);與PA組比較,PA+Nar組、PA+Mdivi-1組和PA+Nar+Mdivi-1組p-ERK1/2和DRP1表達(dá)均更低(P<0.05);PA+Nar+Mdivi-1組p-ERK1/2和DRP1表達(dá)較PA+Nar組更低(P<0.05)。見圖5。

*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、ns P>0.05與Ctrl組比較;#P<0.05、##P<0.01、###P<0.001與PA組比較;ΔP>0.05;&P<0.05。圖5 Mdivi-1對(duì)PA處理后細(xì)胞IL-6水平、p-ERK1/2和DRP1蛋白表達(dá)的影響

4 討論

線粒體動(dòng)力學(xué)對(duì)細(xì)胞活力、衰老、線粒體健康、質(zhì)量控制和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)具有重要作用[16]。DRP1是介導(dǎo)線粒體分裂的關(guān)鍵因子,主要存在于細(xì)胞質(zhì)中,但在應(yīng)激期間,DRP1易位到功能失調(diào)的線粒體中,并誘導(dǎo)線粒體網(wǎng)絡(luò)斷裂。ERK1/2是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的成員,在細(xì)胞分裂、增殖和凋亡方面發(fā)揮重要作用[17]。在病理?xiàng)l件下ERK1/2的激活通過調(diào)節(jié)DRP1的磷酸化,誘導(dǎo)線粒體網(wǎng)絡(luò)斷裂。LIU等[18]研究發(fā)現(xiàn)高血糖通過ERK1/2信號(hào)通路激活細(xì)胞自噬和線粒體裂變加重缺血性腦損傷。TNF-α、IL-1β等促炎因子通過激活ERK1/2誘導(dǎo)DRP1表達(dá)從而導(dǎo)致線粒體網(wǎng)絡(luò)過度斷裂,誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡[19]。也有報(bào)道[20-21]稱ERK1/2信號(hào)通路介導(dǎo)的DRP1激活、線粒體裂變,在促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和化療耐藥性方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。此外,DRP1在控制細(xì)胞增殖、遷移、分化和存活等方面也扮演著關(guān)鍵角色。本實(shí)驗(yàn)觀察到Nar可降低PA處理后3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞上清中IL-6水平,同時(shí)抑制ERK1/2活性及DRP1表達(dá)。

PA作為一種飽和脂肪酸,可引起脂肪組織炎癥反應(yīng)和胰島素抵抗[22]。有研究[23]證實(shí),柚皮苷在多個(gè)系統(tǒng)疾病中均有減輕炎癥、抗氧化應(yīng)激的作用。例如,通過調(diào)控NF-κB通路緩解軟骨細(xì)胞炎癥損傷;在心血管系統(tǒng)中抑制YAP通路逆轉(zhuǎn)ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和炎癥[24]。本研究發(fā)現(xiàn)PA處理后脂肪細(xì)胞p-ERK1/2和DRP1蛋白表達(dá)量均顯著增加,同時(shí)IL-6水平增高。課題組前期研究[15]中已篩選出Mdivi-1作用于3T3-L1脂肪細(xì)胞濃度為10 μmol·L-1時(shí)對(duì)細(xì)胞活性沒有明顯影響,且能顯著抑制3T3-L1脂肪細(xì)胞中DRP1表達(dá)水平。本研究發(fā)現(xiàn)Mdivi-1能促進(jìn)Nar抑制p-ERK1/2和DRP1表達(dá),提示線粒體裂變可能參與Nar對(duì)成熟脂肪細(xì)胞的炎癥反應(yīng),具體作用及機(jī)制需深入探討。

綜上所述,Nar可減輕PA誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞炎癥反應(yīng),且該效應(yīng)可能是通過抑制ERK1/2激活和DRP1表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。但是,本實(shí)驗(yàn)僅從體外研究觀察Nar對(duì)脂肪細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響,而在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面并未進(jìn)行驗(yàn)證,存在一定的局限性,后續(xù)研究需完善。