肌源干細(xì)胞通過(guò)TGF-β1/CTGF信號(hào)通路減輕壓力性尿失禁大鼠的排尿障礙和尿道損傷

李善鳳,龔靜亞,沈海川,朱永貞,孫 瑗,王 玲,顧 月,姚明瑩,陳品靜

(1.連云港市婦幼保健院a.婦產(chǎn)科; b.檢驗(yàn)科,江蘇 連云港 222006; 2.蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科,江蘇 蘇州 215008; 3.東?？h溫泉鎮(zhèn)第一衛(wèi)生院婦產(chǎn)科,江蘇 連云港 222301; 4.灌云縣伊山鎮(zhèn)中心衛(wèi)生院婦產(chǎn)科,江蘇 連云港 222299)

壓力性尿失禁(stress urinary incontinence,SUI)是女性常見(jiàn)疾病之一,我國(guó)SUI患者發(fā)病率約為18.9%[1]?？人浴⒋驀娞?、大笑等均會(huì)誘發(fā)SUI患者發(fā)生不自主的尿液滲漏,嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量[2]。有研究[3]表明,尿道高活動(dòng)度及固有括約肌功能障礙是導(dǎo)致SUI的主要原因。目前臨床治療因單純尿道高活動(dòng)度所導(dǎo)致的SUI療效較好,但因尿道固有括約肌功能障礙所致的SUI效果不理想,且不能完全治愈肌功能障礙[4]。

近年來(lái),干細(xì)胞治療受到學(xué)者們的廣泛關(guān)注。干細(xì)胞具有自我更新和自我分化的潛能,為女性SUI治療提供新的方向。肌源性干細(xì)胞(muscle-derived stem cells,MDSCs)、脂肪干細(xì)胞及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是目前常用于治療SUI的干細(xì)胞。和其他類型干細(xì)胞相比,MDSCs具有特殊的分化能力,可直接分化為成熟的肌肉細(xì)胞,并極易形成肌管和肌纖維[5-6]。有研究[7]發(fā)現(xiàn)MDSCs可改善大鼠SUI的尿失禁,但其機(jī)制尚不清楚。有研究[8]顯示,女性發(fā)生SUI的主要原因是盆底支撐結(jié)構(gòu)損壞,因膠原和彈性蛋白的含量明顯減少導(dǎo)致支持組織的彈性降低,使得盆底松弛,從而導(dǎo)致SUI。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)可調(diào)節(jié)膠原和彈性蛋白的含量,影響基質(zhì)降解酶的活性[9]。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor,CTGF)可通過(guò)刺激成纖維細(xì)胞增殖和分泌而介導(dǎo)多種病理過(guò)程,包括纖維性疾病和創(chuàng)傷后瘢痕形成等[10]。目前TGF-β1/CTGF在SUI中的研究報(bào)道較少。因此,本研究旨在基于TGF-β1/CTGF信號(hào)通路探究MDSCs對(duì)SUI大鼠排尿功能及尿道損傷的作用機(jī)制,從而為SUI的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6～8周齡雌性未孕未產(chǎn)SD大鼠40只,SPF級(jí),體重200～220 g,購(gòu)自北京華阜康生物科技有限公司,許可證號(hào):SCXK(京)2019-0008。3～4周齡SPF級(jí)健康未孕雌性SD大鼠5只,購(gòu)自上海計(jì)劃生育科學(xué)研究所,許可證號(hào):SCXK(滬)2018-0006。所有大鼠均飼養(yǎng)在SPF級(jí)屏障環(huán)境中,自由飲水,室溫恒定23～25 ℃,相對(duì)濕度50%～60%,光照12 h/12 h明暗循環(huán),適應(yīng)性喂養(yǎng)大鼠1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑和儀器

HE染色試劑盒(上海百通科技股份有限公司)、TGF-β1和CTGF羊抗兔多克隆抗體、兔抗大鼠結(jié)蛋白(Desmin)抗體、兔抗大鼠Sca-1抗體(美國(guó)Abcam公司)、TGF-β1/CTGF信號(hào)抑制劑SB431542(上海聯(lián)邁生物工程有限公司)、尿動(dòng)力學(xué)分析儀(成都維信醫(yī)療設(shè)備有限公司)、盆底電刺激儀(ADInstruments公司)、顯微鏡(日本尼康公司)、切片機(jī)(北京萬(wàn)方醫(yī)學(xué)科技股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 MDSCs的分離、純化及培養(yǎng)

5只SD大鼠全身麻醉后無(wú)菌條件下取腓腸肌,剪碎后用D-Hank’s液吹打漂洗,靜置1 min,棄上清,0.2%Ⅺ型膠原酶37 ℃消化1 h;再次離心并棄上清,2.2 U·mL-1dispase酶37 ℃孵育1 h后,0.1%胰酶消化30 min,將細(xì)胞分別經(jīng)100、200和400目細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾,將篩選出的細(xì)胞置于含多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶,于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育1 h后,將未貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)移至一新培養(yǎng)瓶中,換液后培養(yǎng)4～5 d,每24 h換液1次,5～6 d后貼壁細(xì)胞即為MDSCs。細(xì)胞每2～3 d換液1次,匯合度為70%～80%時(shí)傳代。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定MDSCs

MDSCs細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化,以1×105個(gè)·mL-1接種于六孔板培養(yǎng)24 h后,PBS漂洗3次,4%多聚甲醛固定10 min,3%過(guò)氧化氫4 ℃孵育10 min,PBS漂洗,一抗兔抗大鼠結(jié)蛋白(Desmin)抗體、兔抗大鼠Sca-1抗體4 ℃孵育1 h,PBS漂洗5 min后滴加二抗37 ℃孵育40 min,PBS漂洗,DAB顯色10 min,自來(lái)水沖洗以終止顯色反應(yīng)。蘇木素復(fù)染1 min,封片,顯微鏡下觀察,陽(yáng)性細(xì)胞為棕黃色顆粒,計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組與模型制備

SD大鼠40只,按隨機(jī)數(shù)字表法分為NC組、SUI組、MDSCs組、MDSCs+SB431542組,每組10只。NC組不做任何處理,其他組均采用接受模擬產(chǎn)傷和雙側(cè)卵巢切除手術(shù)建立SUI模型[11]。在SUI模型基礎(chǔ)上,MDSCs組經(jīng)尿道壁內(nèi)注射30 μL MDSCs細(xì)胞懸液(約含3×106個(gè)細(xì)胞);MDSCs+SB431542組經(jīng)尿道壁內(nèi)注射10 μL TGF-β1/CTGF信號(hào)抑制劑SB431542及30 μL MDSCs細(xì)胞懸液;NC組、SUI組經(jīng)尿道壁內(nèi)注射等量生理鹽水。各組均于藥物干預(yù)4周后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

SUI模型:用導(dǎo)管將大鼠膀胱排空,腹部正中位作1 cm的切口,剝離雙側(cè)卵巢后縫合切口。將尿?qū)Ч苤糜陉幍?3 mL無(wú)菌生理鹽水用氣囊注入陰道以充分?jǐn)U張陰道,4 h后撤掉尿?qū)Ч?當(dāng)陰道氣囊擴(kuò)張2周后完全摘除卵巢組織后縫合。采用噴嚏實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證模型。

1.2.4 噴嚏實(shí)驗(yàn)

仰臥位固定大鼠,經(jīng)尿道口將硬皮導(dǎo)管一端插入到膀胱,另一端和微量泵連接,將生理鹽水注入到膀胱中,速度為10 mL·h-1,當(dāng)尿道口有液體溢出時(shí)停止注入,計(jì)算注入量。將大鼠的膀胱排空,將前次1/2注入量的生理鹽水再次注入到膀胱,用鼠須刺激大鼠鼻孔,當(dāng)大鼠發(fā)生噴嚏時(shí)尿道口有液體流出時(shí)則視為噴嚏實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性,如尿道口沒(méi)有液體流出則視為陰性。統(tǒng)計(jì)各組大鼠噴嚏陽(yáng)性率,噴嚏陽(yáng)性率=噴嚏陽(yáng)性大鼠數(shù)量/大鼠總數(shù)量×100%。

1.2.5 尿動(dòng)力學(xué)指標(biāo)檢測(cè)

排空大鼠膀胱內(nèi)液體,將生理鹽水注入到膀胱,速度為12 mL·min-1,當(dāng)觀察到尿道口出現(xiàn)第一滴尿液時(shí),記錄膀胱最大容積(MBC)和漏尿點(diǎn)壓(LPP)。再次排空膀胱,按上述同樣的方法注入生理鹽水后,用手指緩慢按壓大鼠腹部,直至尿道口有液體排出時(shí)停止按壓,記錄腹壓漏尿點(diǎn)壓(ALPP)。

1.2.6 排尿指標(biāo)測(cè)定

將三通管中一根導(dǎo)管經(jīng)左側(cè)頸靜脈插入到膀胱內(nèi)后縫合固定供膀胱,一根導(dǎo)管口連接到壓力檢測(cè)器,監(jiān)測(cè)膀胱壓力,經(jīng)第三根導(dǎo)管持續(xù)向膀胱注入生理鹽水以誘導(dǎo)膀胱收縮并排尿,收集尿液,計(jì)算排尿量、殘留尿量及排尿效率等。

1.2.7 HE染色

取尿道組織,將組織于4%多聚甲醛溶液中固定24 h,石蠟包埋,切4 μm薄片,蘇木素染色10 min,浸泡于1%N2O2中2 min,伊紅染色20 min,中性樹脂封片,光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.8 蛋白免疫印跡法

取尿道組織50 mg,將組織充分剪碎,液氮中將研磨,收集粉末,RIPA裂解液裂解1 h,蛋白試劑盒提取組織總蛋白,上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉,一抗(1：500)孵育過(guò)夜,HRP標(biāo)記二抗(1：2000)室溫孵育1 h,發(fā)光液顯色,使用Image J軟件分析條帶灰度值,計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 MDSCs形態(tài)學(xué)變化

1～5 d細(xì)胞多呈纖維細(xì)胞,胞體較大,細(xì)胞貼壁后呈梭形和扁平星形,數(shù)量明顯增多,未傳代的細(xì)胞大量融合;6 d時(shí)細(xì)胞以球形、短梭形和紡錘形為主,胞體體積變小且細(xì)胞數(shù)量減少(圖1A);MDSCs培養(yǎng)9 d時(shí)可見(jiàn)少量懸浮細(xì)胞,細(xì)胞開始分裂增殖,呈圓形或多角形(圖1B);11～13 d后未見(jiàn)懸浮細(xì)胞,貼壁細(xì)胞見(jiàn)明顯分裂,且多呈長(zhǎng)梭形和長(zhǎng)菱形,數(shù)量明顯增加(圖1C);14～16 d時(shí),貼壁細(xì)胞大量增殖且數(shù)量增多,多數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)有規(guī)律的融合,平行排列(圖1D);細(xì)胞在培養(yǎng)25～29 d時(shí)融合至70%,傳代后細(xì)胞分布明顯均勻,細(xì)胞多以長(zhǎng)梭形和紡錘形為主,形態(tài)均一,約3～4 d可傳代(圖1E)。

A:6 d;B:9 d;C:11～13 d;D:14～16 d;E:25～29 d。圖1 光學(xué)顯微鏡下不同培養(yǎng)時(shí)間MDSCs的形態(tài)(×100)

2.2 MDSCs鑒定

免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示,細(xì)胞分布均勻,Desmin和Sca-1均呈陽(yáng)性表達(dá)。見(jiàn)圖2。

A:Desmin表達(dá);B:Sca-1表達(dá)。圖2 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)干細(xì)胞標(biāo)記物Desmin和Sca-1的表達(dá)(×100)

2.3 4組大鼠噴嚏陽(yáng)性率比較

噴嚏實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,SUI組噴嚏陽(yáng)性率(80%)較NC組(0%)增加(χ2=7.500,P=0.023 5);MDSCs組噴嚏陽(yáng)性率(20%)低于SUI組(χ2=7.200,P=0.027 3);MDSCs+SB431542組噴嚏陽(yáng)性率(90%)較MDSCs組增加(χ2=9.899,P=0.007 1)。

2.4 4組大鼠尿動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較

與NC組比較,SUI組MBC、LPP、ALPP水平均降低(均P<0.05);與SUI組比較,MDSCs組MBC、LPP、ALPP水平增加(均P<0.05);與MDSCs組比較,MDSCs+SB431542組MBC、LPP、ALPP水平降低(均P<0.05)。見(jiàn)圖3。

*P<0.05與NC組比較;#P<0.05與SUI組比較;△P<0.05與MDSCs組比較。1 mmHg=0.133 kPa。圖3 各組大鼠尿動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較

2.5 4組大鼠排尿指標(biāo)比較

與NC組比較,SUI組大鼠排尿量、殘余尿量增加,排尿效率降低(均P<0.05);與SUI組比較,MDSCs組大鼠排尿量、殘余尿量減少,排尿效率增加(均P<0.05);與MDSCs組比較,MDSCs+SB431542組大鼠排尿量、殘余尿量增加,排尿效率降低(均P<0.05)。見(jiàn)圖4。

*P<0.05與NC組比較;#P<0.05與SUI組比較;△P<0.05與MDSCs組比較。圖4 各組大鼠排尿指標(biāo)比較

2.6 4組大鼠尿道組織病理學(xué)變化

HE染色結(jié)果顯示,NC組大鼠尿道組織無(wú)異常病理學(xué)變化,尿道括約肌組織結(jié)構(gòu)清晰完整;SUI組大鼠尿道組織明顯損傷,細(xì)胞核排列紊亂、無(wú)規(guī)則且數(shù)量減少,多數(shù)核出現(xiàn)萎縮,肌層厚度明顯變薄,各肌束間隙明顯增加,細(xì)胞染色不均勻且有大量的空泡出現(xiàn);MDSCs組大鼠尿道組織損傷減輕,細(xì)胞染色變均勻且有規(guī)則地排列,細(xì)胞數(shù)量增加且空泡明顯減少;MDSCs+SB431542組大鼠尿道組織病理學(xué)變化較MDSCs組損傷明顯。見(jiàn)圖5。

黑色箭頭所示為細(xì)胞核。圖5 各組大鼠尿道組織HE染色(×100)

2.7 4組大鼠尿道組織中TGF-β1、CTGF蛋白表達(dá)比較

與NC組比較,SUI組大鼠尿道組織中TGF-β1、CTGF蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05);與SUI組比較,MDSCs組大鼠尿道組織中TGF-β1、CTGF蛋白表達(dá)水平增加(P<0.05);與MDSCs組比較,MDSCs+SB431542組大鼠尿道組織中TGF-β1、CTGF蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)。見(jiàn)圖6。

*P<0.05與NC組比較;#P<0.05與SUI組比較;△P<0.05與MDSCs組比較。圖6 各組大鼠尿道組織中TGF-β1、CTGF蛋白表達(dá)比較

3 討論

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展,干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中表現(xiàn)出巨大的潛力,為女性SUI疾病的治療提供新的途徑[6,13]。本研究分離并培養(yǎng)MDSCs,免疫組化鑒定Desmin和Sca-1表達(dá)發(fā)現(xiàn)所得細(xì)胞即為MDSCs,并向SUI模型大鼠中注射MDSCs后大鼠排尿功能和尿道損傷情況改善。由于MDSCs具有增殖速度快、多向分化等特點(diǎn),而且移植后存活率明顯高于從肌肉分離出來(lái)的另一干細(xì)胞即成肌細(xì)胞[13]。MDSCs在體外可分化為神經(jīng)元和內(nèi)皮細(xì)胞等多種不同細(xì)胞。它的這種特性符合修復(fù)尿道括約肌的要求。有研究[14]發(fā)現(xiàn),自體MDSCs聯(lián)合膠原基質(zhì)可改善約79%的SUI癥狀。另有學(xué)者研究[15]發(fā)現(xiàn),MDSCs注射治療可改善女性SUI患者癥狀。尿道括約肌是泌尿系統(tǒng)最基本的結(jié)構(gòu)和功能單位。當(dāng)尿道括約肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能異常時(shí),由于肌細(xì)胞數(shù)量減少以及單位肌纖維的收縮能力降低,進(jìn)而影響尿道括約肌的控尿能力。噴嚏反射可增加腹部壓,故本研究采用噴嚏實(shí)驗(yàn)來(lái)判斷SUI模型制備的成功與否以及MDSCs對(duì)SUI控尿能力的影響。尿動(dòng)力學(xué)指標(biāo)可反映控尿能力,常用方法有力學(xué)及電生理學(xué)方面的檢測(cè)[16]。本研究結(jié)果顯示MDSCs組大鼠噴嚏陽(yáng)性率明顯減少,尿動(dòng)力學(xué)指標(biāo)MBC、LPP、ALPP和排尿率明顯增加,尿道組織病理學(xué)變化改善,提示MDSCs可改善SUI大鼠膀胱相關(guān)的排尿功能,減輕尿道組織損傷。陳春經(jīng)等[17]研究證實(shí),MDSCs可增強(qiáng)其在移植環(huán)境中的生存能力,并通過(guò)其旁分泌功能治療SUI,這與本研究結(jié)果類似。

盆底組織損傷可促進(jìn)SUI的發(fā)生。TGF-β1可調(diào)節(jié)組織修復(fù)過(guò)程中細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用,誘導(dǎo)成纖維母細(xì)胞分化為成纖維細(xì)胞。CTGF能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞增生和膠原蛋白的合成[18]。而TGF-β1可特異性調(diào)控CTGF的表達(dá)。有研究[19]顯示,TGF-β1可通過(guò)CTGF促進(jìn)傷口愈合和組織修復(fù),但TGF-β1/CTGF對(duì)SUI的作用鮮有報(bào)道。本研究結(jié)果顯示,MDSCs組SUI大鼠尿道組織中TGF-β1、CTGF蛋白表達(dá)均明顯增加,提示MDSCs可能通過(guò)調(diào)控TGF-β1/CTGF信號(hào)通路而減輕SUI大鼠尿道損傷和相關(guān)功能障礙。本研究使用TGF-β1/CTGF信號(hào)通路抑制劑聯(lián)合MDSCs共同干預(yù)SUI大鼠,結(jié)果顯示SB431542組大鼠噴嚏陽(yáng)性率增加,尿動(dòng)力學(xué)指標(biāo)MBC、LPP、ALPP和排尿率明顯降低,尿道組織嚴(yán)重?fù)p傷,大鼠排尿功能變差,尿道組織損傷加重,提示抑制TGF-β1/CTGF信號(hào)通路可減弱MDSCs的治療作用。

綜上,MDSCs可改善SUI大鼠的排尿功能,減輕尿道損傷,其可能是通過(guò)調(diào)控TGF-β1/CTGF信號(hào)通路發(fā)揮作用。