大鼠VDAC1腺病毒過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建及功能鑒定

趙嘉儀,袁明明,王利軍,賴松青,鄒華西,黃 瓊,劉季春,黃 璜

(南昌大學(xué)a.第一附屬醫(yī)院心臟大血管外科; b.煥奎書(shū)院,南昌 330006)

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞株及質(zhì)粒

293A細(xì)胞(腺病毒的包裝細(xì)胞)和大鼠H9c2心肌樣細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù),DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。腺病毒載體重組穿梭質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒由蘇州吉瑪基因股份有限公司構(gòu)建制備提供。

1.1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶EcoRI(NEB,#R0101M)、XhoI(NEB,#R0146M),T4連接酶(NEB,M0202L)購(gòu)自蘇州吉瑪基因股份有限公司。RIPA裂解液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。Anti-VDAC1/Porin抗體(ab14734),β-Actin鼠單克隆抗體購(gòu)自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司。胎牛血清(FBS,C2027050)購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。高效轉(zhuǎn)染試劑盒HETkit購(gòu)自深圳百恩維生物科技有限公司。DNA凝膠回收試劑盒和腺病毒Maxi純化試劑盒購(gòu)自上海百塞生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ADV6-VDAC1病毒質(zhì)粒構(gòu)建

按照基因庫(kù)(GeneBank)中的大鼠VDAC1基因編碼序列(NM_031353.1)委托吉瑪基因公司化學(xué)合成目的基因。采用ADV6(C1MV)為克隆載體,首先用EcoRI和BamHI對(duì)VDAC1(大鼠)基因片段和載體進(jìn)行酶切,37 ℃孵育2 h。進(jìn)行凝膠電泳后,用DNA凝膠回收試劑盒回收目的VDAC1基因片段和載體ADV6。用T4 DNA連接酶連接雙酶切后得到的線性化的載體和大鼠VDAC1基因片段,22 ℃孵育2 h。將連接產(chǎn)物在42 ℃水浴中化學(xué)轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,取適量已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞涂抹于含50 μg·mL-1氨芐西林的LB平板上,37 ℃培養(yǎng)16 h。挑選出陽(yáng)性克隆菌落繼續(xù)培養(yǎng)16 h,提取質(zhì)粒,吸取200 μL陽(yáng)性克隆對(duì)應(yīng)的菌液用于測(cè)序,將測(cè)序結(jié)果與目的基因序列進(jìn)行比對(duì)。無(wú)突變的克隆命名為ADV6-VDAC1病毒質(zhì)粒。

1.2.2 病毒包裝

常規(guī)接種5000個(gè)293A細(xì)胞至6 cm培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)箱(37 ℃,5% CO2)孵育過(guò)夜。按感染復(fù)數(shù)(MOI)=100加入ADV6-VDAC1病毒質(zhì)粒至0.5 mL無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中混勻,并將30 μL RNAi-Mate加至0.5 mL無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中,充分混勻,室溫靜置5 min,再將兩種混合液混合均勻,室溫放置20 min左右。將轉(zhuǎn)染混合物均勻加入6 cm培養(yǎng)皿中,充分搖晃培養(yǎng)皿以充分混勻復(fù)合物,培養(yǎng)箱孵育4～6 h后更換為含10%FBS的完全培養(yǎng)基,出現(xiàn)空斑后收集病毒裂解原液。

“我騙杰克說(shuō)我要把瓷瓶送給朋友，可是他一點(diǎn)兒也不好糊弄。為了不被發(fā)現(xiàn)，我就把現(xiàn)場(chǎng)偽造成我和杰克都被綁架的樣子?！苯淌诳嘈χf(shuō)道，“我本想等把這個(gè)瓷瓶賣了換些錢之后，就把杰克放了，然后出去躲一段時(shí)間……”

1.2.3 病毒的擴(kuò)增和純化

第一輪擴(kuò)增:在直徑為10 cm的培養(yǎng)皿中接種適量293A細(xì)胞,使用含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)液,在37℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%左右時(shí),添加適量病毒上清液感染細(xì)胞進(jìn)行病毒擴(kuò)增。待大部分293A細(xì)胞出現(xiàn)典型的空斑,并且有50%的細(xì)胞脫壁時(shí),進(jìn)行低速離心以收集細(xì)胞。隨后,將細(xì)胞在2 mL DMEM中懸浮,進(jìn)行-70 ℃/37 ℃的反復(fù)凍融,振蕩3次。在4 ℃條件下,以7000 g的速度進(jìn)行離心5 min,將病毒上清液收集并保存于-70 ℃。使用相同的步驟進(jìn)行第二輪擴(kuò)增,將病毒上清液收集并保存于-70 ℃。

重組腺病毒的純化:按照腺病毒Maxi純化試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行腺病毒的純化。最終,將純化后的重組腺病毒分裝,并保存于-70 ℃。

1.2.4 大鼠H9c2心肌樣細(xì)胞的培養(yǎng)及傳代

于每個(gè)10 cm培養(yǎng)皿中接種5×105個(gè)H9c2細(xì)胞,加入7 mL含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基,置入培養(yǎng)箱(37 ℃,5% CO2)培養(yǎng),次日更換培養(yǎng)基。細(xì)胞密度達(dá)80%左右時(shí)進(jìn)行傳代,次日更換培養(yǎng)基。取第6代H9c2細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 ADV6-VDAC1腺病毒的功能鑒定

將H9c2細(xì)胞傳代至六孔板,密度為5×104個(gè)·孔-1。實(shí)驗(yàn)分組:Control組(正常H9c2心肌細(xì)胞),ADV6-NC組(轉(zhuǎn)染ADV6-NC腺病毒),ADV6-VDAC1組(轉(zhuǎn)染ADV6-VDAC1腺病毒)。每孔各加入無(wú)血清高糖DMEM培養(yǎng)基1 mL,再按實(shí)驗(yàn)分組分別加入DMEM 50 μL、ADV6-NC腺病毒50 μL,ADV6-VDAC1 108腺病毒50 μL,24 h后更換為含血清的完全培養(yǎng)基,72 h后收集細(xì)胞,分別提取總RNA及蛋白。

1.2.6 總RNA提取及qPCR

各組細(xì)胞以預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次,吸除液體后加入1 mL Trizol,提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,進(jìn)行qPCR檢測(cè)VDAC1 mRNA的表達(dá)情況。

1.2.7 細(xì)胞蛋白提取及蛋白免疫印跡

各組細(xì)胞以預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次,于每1 mL的RIPA裂解液加入10 μL 100 mM 苯甲基磺酰氟(PMSF)配制成裂解工作液,充分混勻。每個(gè)培養(yǎng)皿中加入200 μL上述裂解液,混勻后于冰上孵育15～20 min。將混懸液移至4 ℃預(yù)冷的1.5 mL離心管中,4 ℃下以12 000 rpm離心15 min,吸取上清至4 ℃預(yù)冷的1.5 mL離心管中,吸取20 μL進(jìn)行BCA法蛋白濃度測(cè)定,于-80 ℃保存。

配置10%分離膠和5%濃縮膠,上樣后以80 V的恒定電壓電泳,直至濃縮膠表面平整,然后調(diào)整電壓至120 V,直至溴酚藍(lán)指示劑出現(xiàn)。停止電泳后,將事先在甲醇中激活的PVDF膜貼在膠上,以220 mA的電流進(jìn)行1 h轉(zhuǎn)膜。將PVDF膜放入含有5%脫脂牛奶的TBST緩沖液中進(jìn)行1 h封閉。封閉后,進(jìn)行一抗的孵育,并4 ℃過(guò)夜。用TBST洗膜3次,每次10 min。在室溫下進(jìn)行二抗孵育1 h,再次洗膜后,使用熒光化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影。

2 結(jié)果

2.1 腺病毒質(zhì)粒構(gòu)建

VDAC1(大鼠)基因上下游引物分別加上EcoRI和BamHI酶切序列及保護(hù)堿基,用于載體的亞克隆,引物序列見(jiàn)表1。通過(guò)PCR獲取VDAC1目的基因,長(zhǎng)度為900 bp,插入到ADV6(CMV)質(zhì)粒載體,插入位點(diǎn)為EcoRI和BamHI,見(jiàn)圖1。測(cè)序結(jié)果和NCBI中的目的cDNA序列比對(duì)完全一致,證明病毒質(zhì)粒構(gòu)建成功,見(jiàn)圖2。

圖1 ADV6-CMV質(zhì)粒圖譜

圖2 VDAC1基因的部分序列

表1 引物序列

2.2 ADV6-VDAC1包裝、收毒、擴(kuò)增及滴度測(cè)定

ADV6-VDAC1病毒質(zhì)粒感染293A細(xì)胞后,每天定時(shí)觀察病毒增殖情況,待開(kāi)始出現(xiàn)空斑現(xiàn)象時(shí),收集病毒裂解原液,采用微量全細(xì)胞病變法檢測(cè)病毒滴度,結(jié)果為1×1011PFU·mL-1,體積為1 mL。

2.3 ADV6-VDAC1腺病毒功能鑒定

ADV6-VDAC1轉(zhuǎn)染H9c2心肌細(xì)胞72 h后,分別提取各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的RNA及總蛋白,進(jìn)行qPCR及蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn),分別檢測(cè)VDC1 mRNA及蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示,ADV6-VDAC1組VDAC1 mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.01),提示ADV6-VDAC1腺病毒構(gòu)建成功,可在H9c2細(xì)胞內(nèi)正常表達(dá),見(jiàn)圖3。

A:qPCR檢測(cè)VDAC1 mRNA表達(dá)水平;B:蛋白免疫印跡檢測(cè)VDAC1蛋白表達(dá)水平;C:VDAC1蛋白印跡灰度分析。ns:P>0.05,**P<0.01。圖3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞VDAC1表達(dá)水平

3 討論

VDAC在線粒體中存在3種亞型(VDAC1、VDAC2和VDAC3),其中VDAC1的表達(dá)最為廣泛[8]。VDAC1由19條跨膜β-鏈和一個(gè)N末端α-螺旋結(jié)構(gòu)域組成,位于線粒體外膜,使其能夠與100多種蛋白質(zhì)相互作用,并通過(guò)多個(gè)信號(hào)通路協(xié)調(diào)線粒體和細(xì)胞的相互作用[9-10]。有研究[11]表明,VDAC1是一種多功能蛋白,在物質(zhì)運(yùn)輸、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量產(chǎn)生、細(xì)胞凋亡等多個(gè)生理過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。此外,有研究[11]報(bào)道線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔道(MPTP)的開(kāi)放或關(guān)閉狀態(tài)與心肌缺血再灌注損傷密切相關(guān),其中VDAC1在這一過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。本課題組之前的研究[7]表明,心肌缺血預(yù)適應(yīng)可以抑制VDAC1的表達(dá),維持線粒體膜電位,從而關(guān)閉MPTP的開(kāi)放狀態(tài),最終抑制心肌細(xì)胞凋亡,發(fā)揮抗缺氧/復(fù)氧損傷的作用。因此,為深入研究VDAC1在心肌缺血再灌注損傷中的具體作用機(jī)制,本研究利用基因表達(dá)調(diào)控技術(shù)構(gòu)建了腺病毒過(guò)表達(dá)載體,在H9c2細(xì)胞中特異性激活VDAC1表達(dá),以探討VDAC1在心肌損傷中的作用機(jī)制。

病毒作為自然演化的載體,是工程病毒載體系統(tǒng)傳遞治療基因的理想選擇,能夠高效地將外源基因傳遞到宿主細(xì)胞中。由于其強(qiáng)大的攜帶外源基因的能力和高效表達(dá)的特性,病毒常被廣泛應(yīng)用于基因工程,作為基因傳遞的載體[12]。腺病毒屬于腺病毒科,是一種非包膜病毒,能夠快速侵入細(xì)胞,并在細(xì)胞核中進(jìn)行復(fù)制,但通常不會(huì)整合到宿主細(xì)胞基因組中。腺病毒在體內(nèi)傳遞基因的效果非常顯著,也可應(yīng)用于癌癥治療,旨在誘導(dǎo)免疫對(duì)抗癌癥或直接殺死癌細(xì)胞,同時(shí)用于評(píng)估病毒衣殼修飾是否有助于增強(qiáng)治療特性[13]。重組腺病毒已被廣泛用于基因工程,包括外源基因傳遞、體內(nèi)疫苗接種和基因治療等方面。例如,腺病毒可將外源性基因傳遞至各種細(xì)胞類型,而這種基因傳遞并不依賴于細(xì)胞的分裂,因此可獲得高滴度的病毒和高水平的轉(zhuǎn)基因表達(dá)[14]。

本研究首先采用腺病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建了VDAC1病毒質(zhì)粒,然后將其感染至293A細(xì)胞中進(jìn)行病毒包裝、擴(kuò)增和純化。經(jīng)過(guò)病毒滴度測(cè)定后,再感染H9c2心肌細(xì)胞,通過(guò)qPCR和蛋白免疫印跡檢測(cè)VDAC1 mRNA及蛋白的表達(dá),以確保ADV6-VDAC1腺病毒的成功構(gòu)建且能在心肌細(xì)胞中正常表達(dá),為深入研究VDAC1在心肌缺血再灌注損傷中的作用提供了前期條件。